Clase 14. Candidiasis.docx

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L​ABORATORIO​ C​ANDIDIASIS Grupo encargado: ​#4

​Fecha de la Clase:​ 24 de setiembre del 2020

​Profesor Encargado:​. Dra. Daniela Jaikel

M​ORFOLOGÍA​ ​MACROSCÓPICA​ ​DE​ ​CA​ NDIDA​ ​SP​.

Al estar ante un cultivo de ​Candida​, se observan colonias levaduriformes, levantadas, de borde definido, brillantes. ​Candida posee la característica de poseer micelio sumergido (se mete dentro del agar). En la rutina de laboratorio, cuando se aíslan levaduras de un hemocultivo y se siembran en agar sangre, al ser un muy medio rico, las colonias fácilmente se observan levaduriformes con abundante micelio sumergido, característico del hongo. Al observarla en tubo, al anverso se observa la morfología levaduriforme, pero en contraluz se puede observar el micelio sumergido como una sombra penetrando en el agar. Esta característica permite diferenciarla de otras levaduras, y permite identificarla como ​Candida s​ p. Se identifica de esta forma, ya que no es posible designar especies con morfología colonial (​C. albicans, C. auris, C. parapsilosis, C. tropicalis, ​etc.). La única especie que no posee esta morfología colonial característica es ​C. glabrata​, ya que no produce micelio, sino únicamente blastosporas, de modo que la colonia se asemejaría a una de ​Saccharomyces s​ p., es decir, solo colonia levaduriforme en ausencia de micelio sumergido. El resto de las especies todas pueden hacer micelio o pseudomicelio.

M​ORFOLOGÍA​ ​MICROSCÓPICA​ ​DE​ ​C​ANDIDA​ ​SP​.

Al realizar un montaje en azul de lactofenol se observa micelio hialino septado. Aún si el micelio es muy delgado, al ser de un diámetro constante y uniforme se asume que posee septos. Nótese que a partir de la hifa se producen brotes, que a su vez forman más brotes dando origen a las blastosporas. También es factible observar pseudomicelio cuando una blastospora gema, el brote se queda unido y vuelve a gemar, formando una estructura a manera de rosario. Al observar esta morfología microscópica solo es posible indicar que se está en presencia de ​Candida ​sp., de la misma manera al combinar la morfología macroscópica con la microscópica.

I​DENTIFICACIÓN​ ​DE​ ​LA​ ​ESPECIE

Para identificar la especie es necesario utilizar pruebas bioquímicas. Entre ellas existen las siguientes: ➢ CHROMagar Candida: es un agar cromogénico. Distintas casas comerciales lo producen y es muy importante leer el inserto para ver exactamente de qué color se pone cada una de las especies a identificar y cuáles especies permite identificar. La mayoría viran de forma muy similar, sin embargo hay algunas excepciones. No se puede trabajar siempre bajo el supuesto de que ​C. albicans g​ enera colonias verdes, por ejemplo. ➢ Tubo germinativo: permite hacer una caracterización del complejo ​C. albicans​. 1

➢ Clamidosporas terminales: permiten hacer una caracterización del complejo ​C. albicans. ➢ API/Vitek: podrían estar disponibles dependiendo del sitio de trabajo. ➢ MALDI-TOF-MS: está disponible en algunos hospitales para hacer la identificación por espectrometría de masas. ➔ El HSJD utiliza el de Biomérieux (misma empresa que vende Vitek), lo cual es ventajoso ya que se puede acoplar el detector de masas al Vitek. Así es posible identificar por espectrometría de masas a la levadura o a bacterias, permitiendo montar también las pruebas de susceptibilidad en el Vitek. Este es un sistema cerrado, con la limitante de que se pueden identificar solo los hongos contemplados en su base de datos, la cual es bastante europea de modo que muchos de los hongos que causan enfermedad solo en latinoamérica no están en ella. ➔ Un ejemplo de lo anterior es una cromoblastomicosis por ​Fonsecaea​, que al no estar en el la base de datos ameritaría utilizar el expertise de observación microscópica para llegar al diagnóstico. ➔ También se encuentra disponible el Bruker, empleado en el Hospital del Trauma, que no permite acoplar al Vitek (al ser casas comerciales diferentes), lo que implica que la susceptibilidad la deben determinar por otras técnicas al identificar el microorganismo por este método. El Bruker tiene la ventaja de ser un sistema abierto, posee una biblioteca de espectros contra los que compara el aislamiento, y en caso de no reconocer el aislamiento, es posible subirlo a la biblioteca, caracterizar el aislamiento molecularmente (en otro contexto), y volver al MALDI e indicar a qué especie corresponde el espectro que se subió a la biblioteca y así sumar la posibilidad de identificarlo en el futuro. ➔ Ambos equipos tienen ventajas y desventajas.

T​UBO​ ​GERMINATIVO​, ​TUBO​ ​GERMINAL​ ​O​ ​PRUEBA​ ​DE​ F​ ILAMENTIZACIÓN

Se utilizan 0.5 mL de suero y se prepara una suspensión de blastosporas en este. Esta prueba evalúa la capacidad de una blastospora para germinar y se evalúa el tiempo de germinación, ya que el complejo ​C. albicans ​germina más rápidamente que las otras especies. Es muy importante tomar el inóculo de la parte más superficial y levaduriforme de la colonia, ya que si se toma del micelio se podría estar reportando un resultado incorrecto (se observaría muchísimo filamento); así se garantiza que la suspensión solo contenga blastosporas. La incubación se realiza a 37​o​C por 3h. En la literatura se indica que debe ser de 2-4h, sin embargo, en la Sección de Micología Médica se ha observado que el tiempo ideal es 3h, ya que si se lee antes puede ser que ​C. albicans ​no haya producido tubo germinativo porque esté más lenta, mientras que si se lee después de las 3h o 4h o 5h (porque se tenía mucho trabajo en el hospital o el analista simplemente lo olvidó), todas las especies habrán germinado (excepto ​C. glabrata q ​ ue no hace micelio), e igualmente se reportaría un resultado incorrecto indicando ​C. albicans.​ Esto tiene implicaciones a nivel terapéutico, ya que cada especie tiene un patrón de susceptibilidad diferente. Algunas ​C. albicans ​no hacen tubo germinativo, debido a que el paciente ya traía tratamiento previo, es un paciente especializado, tenía tratamiento profiláctico, etc., y puede ocurrir que al correr las pruebas bioquímicas sea ​C. albicans. Lo que se debe observar es una blastospora con una pequeña prolongación de micelio, en el que el citoplasma sea contínuo desde la blastospora, esto indica una prueba positiva (carita feliz en la imagen). Cuando se observa un septo entre la blastospora y el micelio, esto ​no ​es tubo germinativo, sino lo contrario: micelio que produjo una blastospora; en este caso además se puede notar que la blastospora vino de pseudomicelio, ya que se ven las constricciones (carita enojada en la imagen). Se debe tener cuidado en este aspecto. En el siguiente video corto de 2 min se ilustra la técnica: ​https://www.youtube.com/watch?v=C-6Utqv8nKk En resumen, si una ​Candida ​da un tubo germinativo positivo, aunque no todas lo hagan a las 3h, con ese resultado precoz se debe informar al médico que es ​C. albicans ​para que este pueda hacer los cambios en la terapéutica. Es una manera rápida, barata y sencilla de identificar al complejo, que está compuesto por ​C. albicans s​ ensu stricto, ​C. dubliniensis ​(muy importante en pacientes que han tenido tratamiento profiláctico con fluconazol, ya que esta es resistente) y ​C. africana (importante a nivel de candidiasis vaginal, sin embargo, su perfil de susceptibilidad es idéntico al de ​C. albicans)​ . Para efectos de examen, si se observa un tubo germinativo positivo: 2

❖ Estructura: ​Tubo germinativo

❖ Identificación: ​Candida albicans​ o ​Candida albicans /Candida dubliniensi​ s (con poner ​Candida albicans​ es suficiente). Se indica género y especie porque la prueba lo permite CLAMIDOSPORAS​ T​ ERMINALES

Tienen la misma función que el tubo germinativo: ​diferenciar el complejo de ​C. albicans d ​ e las otras candidas. Esta prueba (al igual que el tubo germinativo) permite identificar a nivel de especie. Recordar que las clamidosporas son esporas de resistencia, entonces se debe enfrentar al hongo a un medio que sea pobre para que se produzcan estas esporas. Se utiliza el ​agar harina de maíz​. Se toma un inóculo de la colonia inicial, ​se inserta el asa dentro del agar y se hace un ​surco profundo (no se siembra en la superficie del agar, se inserta el asa y se hace un surco). Al surco profundo se le coloca encima un cubreobjetos estéril para disminuir la concentración de oxígeno. Esto genera condiciones adversas, por lo tanto se propicia la producción de clamidosporas. ​Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 5 días. ​A los 5 días para realizar la lectura, se retira el cubreobjetos, con un asa bacteriológica se recoge el cultivo que está dentro del surco y eso se monta en un portaobjetos con azul de lactofenol y se le coloca otro cubreobjetos. En la fotografía superior se observa el micelio hialino septado que produce ​Candida,​ pero al final de los ápices se ven esporas redondas y grandes de doble pared. La espora se llama “clamidospora terminal” porque está al final del ápice. Además se pueden observar blastosporas pequeñas. En la fotografía inferior se observa micelio hialino septado, blastosporas (se observan algunas gemando) que son mucho más pequeñas y tienen la pared más delgada que las clamidosporas terminales. Las clamidosporas son estructuras redondeadas y grandes de doble pared. ❖ Identificación: ​Candida albicans o ​Candida albicans/Candida dubliniensi​ s (porque

las otras especies del complejo también podrían hacerlo).

CHROMAGAR​ C ​ ANDIDA​

- ​AGAR​ ​CROMOGÉNICO

Se tiene un agar “corriente” con un sustrato cromogénico, cuando la levadura lo metaboliza cambia de color. Con respecto al cambio de color, la gran mayoría de estos agares cromogénicos producen: ❖ Coloración ​verde esmeralda​ en el caso del complejo de ​Candida albicans.​ ❖ Coloración ​azul​ en el caso de ​Candida tropicalis.

❖ Todas las otras candidas se van a ver ​blancas​ o un poco ​moradas/rosadas. Si bien hay micólogos muy expertos que dependiendo de la morfología de la colonia diferencian entre las especies, lo tradicional es que uno pueda decir ​C. albicans​, ​C. tropicalis​ o “alguna otra”. La ​función principal ​del medio cromogénico es ​indicar si la levadura que se está aislando está pura o si el paciente tiene una infección mixta​. La función principal no es precisamente identificar las especies. Se raya la colonia en tres zonas y se pueden observar distintos colores. Si se tienen distintos colores se puede determinar que el paciente tiene una infección mixta. Es muy útil cuando se monta un Vitek o API, pues permite confirmar que se deben trabajar ciertas levaduras por aparte si el CHROMagar señala una infección mixta.

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En la imagen izquierda se observa un CHROMagar con diferentes especies de ​Candida (apreciar las diferencias de color mencionadas anteriormente). También se observa ​Prototheca ​wickerhamii (será visto en un seminario). ​Recordar que estos son los colores tradicionales, la mayoría de agares cromogénicos van a mostrar estas coloraciones, pero hay algunos en los que podría cambiar el patrón de colores (se debe saber con cuál tipo de CHROMagar se trabaja en el laboratorio).

V​IDEO​ ​API En el video se muestra un montaje API para bacterias, sin embargo el montaje en sí es igual al de las tirillas de API para ​Candida o de API Yeast que sería para otras levaduras. Cuando se está trabajando con una muestra clínica, para realizar la suspensión debe tomarse un único tipo de colonia de la placa (en el video se observa un solo tipo porque es un cultivo puro). Se debe elegir la colonia de la cual se sospecha que es la causante del cuadro. Entonces lo que se debe hacer es seleccionar una colonia, tomarla con el asa estéril y hacer una suspensión en SSE (para ​Candida es una suspensión de McFarland 3, muy muy turbia, lo que implica tomar muchas colonias). La suspensión se homogeniza y con esta suspensión se puede inocular la tira de API. Una vez abierta, se tienen los pocillos con reactivos deshidratados y el microorganismo de interés va a reaccionar con estos. El patrón obtenido una vez hecha la lectura es lo que permite hacer la identificación.

Con una pipeta pasteur se toma de la suspensión hecha y se llena la mayoría de los compartimentos hasta el borde inferior de la apertura (flecha azul). Ahora bien, como se puede ver, en el caso de “CIT” (círculo rojo, citrato) este está como encerrado “en una caja”, lo que indica que hay que llenar todo el pocillo. Y en aquellas pruebas donde el nombre está subrayado (como se muestra en el cuadrado verde), se debe agregar aceite mineral en el resto del pocillo, hasta llenarlo (ver foto a la derecha).

Una vez llenos los pocillos, se debe guardar toda la tira de API en una cámara húmeda. Se llena entonces la cámara con un poco de agua, se coloca la tira sobre esta, se tapa, se rotula y se incuba por el tiempo apropiado (24h normalmente). En el montaje del API Yeast no se van a tener cambios de color sino se lee por turbidez, se determina crecimiento o no crecimiento y así se reporta. El montaje del API de ​Candida es muy similar al de bacterias, la diferencia es que en lugar de observar cabios de color (en el caso de las bacterias), estos cambios se detectan como: amarillo = positivo, violeta o gris =negativo. Además, el API de ​Candida es mucho más pequeño (10 pocillos) en comparación con el de bacterias (20 pocillos para el API 20E de bacterias fermentadoras).

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Como se puede ver en la primera imagen, donde se observa el API de ​Candida​, no hay ningún pocillo donde esté “la caja”, entonces se llenan siempre hasta el borde inferior de la apertura. Los resultados se transcriben a una hoja, se obtiene un patrón (positivo o negativo) y así se determina la especie. Anteriormente se utilizaba otro API (API Yeast), en donde lo que se hacía era observar turbidez. Se comparaba la turbidez de cada prueba contra la turbidez de glucosa. Los triángulos que se pueden observar en el API lo que hacen es separar a la hora de la lectura, al realizar la interpretación se trabajan los 3 pocillos antes del triángulo y después los 3 pocillos que le siguen. En el caso de API Candida hay una particularidad = Tiene pocos pocillos, entonces hay algunos que se leen doble y la coloración puede ser distinta por lo que es importante siempre tener a mano el guión de lectura o En la página de Biomérieux viene una guía de cómo leer los API, desde las instrucciones de como llenarlo hasta cómo chequear los colores En el caso de este API que se tenía montado, la página de API lo va a identificar como una ​Candida albicans​, pero se sabe que es una Candida africana​ porque es trealosa negativo, entonces la ​Candida africana e​ s una ​Candida albicans t​ rehalosa negativo

C​ORTES​ ​HISTOLÓGICOS Se pueden ver cortes con Hematoxilina Eosina y con una de las tinciones especiales para hongos, la tinción de Grocott

H​EMATOXILINA​ ​EOSINA

Es la tinción inicial que se utiliza en patología, se realizan los cortes y se tiñen. Si el patólogo ve algo sospechoso hacia un hongo, monta las tinciones especiales, usualmente se montaría Grocott o PAS (Ácido Peryódico de Schiff) ¿Qué pasa con la Hematoxilina Eosina? No funciona bien para teñir hongos ​→ Lo que se ven son como fantasmas rosados, sin embargo, esos filamentos mal teñidos le dan un indicativo al patólogo de que se está frente a un hongo entonces ya se utilizarían las otras técnicas. En esta imagen que corresponde a una úlcera gástrica, se puede observar los filamentos de micelio que tiene ​Candida y se puede ver una que otra blastospora gemante. ¿Qué se identificaría aquí? ​→ Micelio con blastosporas y la identificación sería Candida s​ p.

G​RAM Esta siguiente imagen es una tinción de Gram, corresponde a un lavado bronco alveolar que, aunque usualmente se realiza para buscar bacterias, los hongos también se van a teñir y si son los que están causando la patología, los vamos a observar. Los hongos por su pared son Gram positivos = Así como se observa en la fotografía donde se ve pseudomicelio con sus constricciones, donde se están separando cada una de las blastosporas y también vemos blastosporas

T​INCIÓN​ ​DE​ G​ROCOTT Se tiene un corte de úlcera gástrica pero teñido con Grocott. Se tiene micelio de diámetro uniforme, es decir un micelio septado, aquí no se puede decir si es hialino o si es fuliginoso porque la tinción de Grocott es una tinción de plata que se deposita sobre la pared y entonces no podemos diferenciar. Solo se puede decir que es un hongo filamentoso, pero como tienen blastosporas podemos decir que es la fase parasitaria de ​Candida​ y por lo tanto estamos al frente de una candidiasis.

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Algo muy importante es que Grocott va a teñir pared, y las blastosporas son estructuras redondeadas tridimensionales, se pega el Grocott sobre la pared y si se tiene una bola entonces todo se va a ver negro. Es importante esto porque a nivel del micelio (un tubo) se vería todo negro porque no se está viendo el interior del tubo, mientras que si se ve el interior se vería una delimitación del tubo, entonces se vería similar a una blastospora, pero como la blastospora posee pared por completo alrededor todo se ve todo negro, de manera que si se ve una estructura solamente con un halo negro alrededor (pared) esta correspondería a un micelio que fue cortado transversalmente o Esto es importante porque la fase parasitaria de ​Aspergillus es solo micelio, entonces yo podría ver un micelio cortado transversalmente y confundirlo con una candidiasis cuando en realidad lo que estoy viendo son los bordes de la hifa. Nota: En el caso de la Hematoxilina sí se puede ver que es un hongo hialino porque la melanina de los hongos fuliginosos se ve en los cortes histológicos, de hecho si el caso es por un hongo negro con Hematoxilina Eosina es muy fácil hacer el diagnostico porque la hifa, al tener color la pared, se ve de color negro en la tinción. En el caso de los hongos hialinos como no tienen color en su pared, se van a ver todos rosaditos pero no se observa la pared del hongo, por lo que en la imagen inicial se sabría que es un hongo hialino Nota: Sí hay otras infecciones fúngicas además de una candidiasis, que producen micelio y blastosporas, sin embargo, serían una feohifomicosis por lo que se vería la melanina en Hematoxilina Eosina, es por esto por lo que es importante que el patólogo siempre vea esta tinción primero. En el caso de que haya un ​Trichosporon,​ se va a tener blastosporas y micelio, pero tambien van a haber artrosporas entonces se debe tener un ojo entrenado para diferenciar estas atrosporas en Grocott de las blastosporas.

El HCG tiene un patólogo que es experto en hongos, por lo que todas las láminas sospechosas por hongos él las revisa. En el caso de que llegue una biopsia, esta se va a macerar, se va a colocar en KOH, se siembra en los medios y se puede emplear el blanco de calcoflúor. En este nivel el patólogo solo puede decir que hay una posible ​Candida,​ entonces el microbiólogo debe cultivarla y confirmar y también dar una identificación a nivel de especie. Se hace un trabajo complementario con patología, pero esta parte de tinciones es de patología

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