Aula 4 - Bases Cromossômicas da Hereditariedade, citogenética clínica (2016.1)

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Universidade Federal do Piauí Campus Ministro Reis Velloso – Parnaíba Curso Biomedicina

Disciplina Genética Humana e Médica

As Bases Cromossômicas da Hereditariedade: citogenética clínica

Profa Renata Canalle

Doenças Genéticas

• Distúrbios monogênicos • Distúrbios cromossômicos (perdas reprodutivas, malformações congênitas, retardo mental)

• Distúrbios multifatoriais

Doenças Genéticas • Distúrbios cromossômicos (perdas reprodutivas, malformações congênitas, retardo mental)

Anormalidades cromossômicas – fração significativa das doenças genéticas (1 em cada 150 nascimentos vivos)

Citogenética: é o estudo dos cromossomos e das anomalias cromossômicas e seus efeitos sobre os fenótipos Citogenética clínica: é o estudo dos cromossomos, sua estrutura e sua herança, aplicado à prática da genética médica

Indicações Clínicas para a Análise dos Cromossomos •Problemas precoces de crescimento e desenvolvimento (pacientes com malformações congênitas (cardiopatias congênitas), dismorfismos faciais, baixa estatura, retardo mental, genitália ambígua) •Natimortos (0,7%) e morte neonatal (10%) •Distúrbios da determinação e diferenciação sexual •Infertilidade ou abortos recorrentes (abortos recorrentes – 3% a 6%) •Instabilidade cromossômica, História familiar, risco de tumores •Auxílio diagnóstico e monitorização em leucemias •Diagnóstico pré-implantação, pré-natal (idade avançada) e pós-natal •Síndromes cromossômicas

Análise citogenética

Síndromes Cromossômicas

Síndrome de Down

Síndromes Cromossômicas

Síndrome de Turner

Caso Clínico Um caso familial de inversão de cromossomo inv(7)(p11q21.1) foi analisado pelos métodos de citogenética convencional e molecular. A inversão foi transmitida do pai fenotipicamente normal, para sua filha e seu filho. O menino tem graves anormalidades fenotípicas, incluindo pescoço curto, deformação das orelhas, enquanto sua irmã é saudável. O cariótipo foi analisado. Os pontos de quebra foram detectados pela técnica de FISH, usando uma sonda centromérica e sondas para os braços longo e curto do cromossomo 7.

Caso Clínico

Análise de Cariótipo Cromossomos X Doença Análise Convencional e Molecular

Histórico

 1923 – 48 cromossomos (diferenciou X e Y)  1956 – Tijo e Levan (46 cromossomos – fibroblastos)  1956 – Ford e Hamerton (23 cromossomos – testículos)  1959 – Lejeune ( síndrome de Down)  1959 – Jacobs e Strong (Klinefelter e Turner)

Histórico

1960 – Moorhead (cultura de curta duração – linfócitos) 1970 – Banda Q (quinacrina mostarda) Banda G Banda R Banda C Coloração NOR 1980 – Bandas de alta resolução 1990 – Hibridização in situ (citogenética molecular)

Ciclo Celular

Intérfase e mitose

Cromossomos na intérfase Classificação segundo a Compactação da cromatina Eucromatina

Heterocromatina

• Configuração aberta

• Condensada

• Transcricionalmente ativa

• Transcricionalmente inativa

• Coloração uniforme

• Corada mais intensamente

• Maior parte do cromossomo

• Heterocromatina constitutiva DNA altamente repetitivo • Heterocromatina facultativa inativação de cromossomos inteiros (X inativo fêmea)

Identificação dos Cromossomos • 1960 – Moorhead (cultura de curta duração – linfócitos T)

Preparações Metafásicas

Preparação Metafásica

Classificação dos Cromossomos

Nomenclatura do Cariótipo Humano Séries de normas apresentadas em vários Congressos Científicos (1966-1971) e relatos do Comitê Internacional de Nomenclatura em Citogenética Humana.

Os cromossomos são identificados: • Tamanho • Posição do centrômero • Padrão de bandas

Nomenclatura do Cariótipo Humano •1960 – Conferência de Denver (tamanho) - 46,XX 46,XY

cromátides

Braço curto p telômero Braço longo q

Grande/longo (A e B), médio (C e D), pequeno/curto (E) e muito pequeno (F e G)

Estrutura dos Cromossomos Humanos

satélite Braço curto (p)

(constrição secundária ou pedículo)

(constrição primária) Braço longo (q)

Nomenclatura do Cariótipo Humano •1963 – Conferência de Londres (grupos A, B, C, D, E, F, G)

46,XY

46,XX

Montagem do Cariótipo

Análise do Cariótipo

Cariótipo: conjunto de cromossomos de uma célula diplóide, característico da espécie. Usado como sinônimo de cariograma: conjunto de cromossomos de um indivíduo, ordenados segundo a classificação padrão (imagem impressa).

Métodos de Análise Cromossomos

Métodos de Análise dos Cromossomos Células e Tecidos Linfócitos do Sangue Periférico Humano Líquido Amniótico Medula Óssea Pele ou Tecidos de Órgãos Internos Vilosidade Coriônica

Cultura de Linfócitos Humanos

Coleta do sangue periférico (anticoagulante)

Cultura de Linfócitos Humanos

Meio de cultura: -Soro - meio RPMI - antibióticos - fitoemoaglutinina

Preparo das culturas

Cultura de Linfócitos Humanos

Incubadas a 37º C por 72 horas

Cultura de Linfócitos Humanos

Colchicina, centrifugação Colheita dos linfócitos, tratamento com hipotônica e fixação (3 metanol:1 ácido acético)

Cultura de Linfócitos Humanos

Preparo das lâminas, coloração adequada e análise microscópica

Métodos de Análise dos Cromossomos

Convencional

Bandamento

Hibridação in situ

Coloração Convencional

giemsa

Aberrações cromossômicas em linfócitos do sangue periférico humano

Classificação pelo Bandamento •1971 – Conferência de Paris (bandas) T. Casperson et al. (técnica de bandamento; foi possível a identificação de cada par cromossômico pelo padrão característico das bandas)

G C Q R NOR

região densamente enrolada de cromatina em um cromossomo

Bandamento Giemsa •Cromossomos submetidos a digestão com tripsina – desnaturação proteínas •Corados com Giemsa •Padrão de bandas claras e escuras – único para cada cromossomo •Bandas G escuras = DNA rico em bases AT (poucos genes ativos) •Bandas G claras = DNA rico em bases GC (muitos genes ativos) Bandas claras: maioria dos pontos de quebra e rearranjo

Análise de 20 células

350 a 550 bandas genoma haplóide banda = 5-10 x 106 pb

Localização Cromossômica Cromossomo 7

Exemplo Fibrose Cística

p Centrômero

Localização 7 q 31 . 2

Braço longo q

q Banda 1 Sub-banda 2 Região 3 Centrômero: 10

Nomenclatura das bandas citogenéticas Cromossomo 3

Braço p “petit”

Braço q

Esta banda do cromossomo é chamada 3p22

Esta banda do cromossomo é chamada 3p22.1

Esta banda do cromossomo é chamada 3p21

Centrômero: 10 p10 q10

Classificação pelo Bandamento

G-positiva G-negativa 5p15.2 8q24.2 Centrômero: 10 (ISCN 2005)

Bandamento Centrômero •Tratamento com hidróxio de sódio – DNA altamente repetitivo •Coloração com giemsa •variações na morfologia cromossômica ou coloração heteromorfismos (diferenças de seq. de DNA satélite)

(cromossomos 1q, 9q e 16q, Yq) Heterocromatina constitutiva

Bandamento Quinacrina • bandas Q claras = bandas G escuras • microscopia de fluorescência • variações na morfologia cromossômica ou coloração heteromorfismos (diferenças de seq. de DNA satélite)

Bandamento Reverso •aquecimento antes da coloração •bandas claras e escuras  reverso das G ou Q •Ideal para regiões que se coram pouco pelo G ou Q, especialmente extremidades distais; fornece padrão mais fácil para analisar

Idiograma

Idiograma: representação diagramática da morfologia cromossômica

Padrão de bandamento G

Idiograma

•400 bandas por cariótipo haplóide

Classificação pelo Bandamento • 1980 – Bandas de alta resolução – aumento na precisão diagnóstica Pró-metáfase: bandamento G ou R relativamente descondensado p

q

alta resolução

Suspeita de pequena anomalia estrutural

Classificação pelo Bandamento •1980 – Bandas de alta resolução

metáfase

pró-metáfase prófase Cromossomo X

Bandamento de Alta Resolução

Padrão de Bandas

Bandas

400 - 550

Bandas de Alta Resolução

700 - 850

Técnica bandas de alta resolução Como conseguir bandas de alta resolução? . Redução da concentração de colcemid / colchicina . Redução do tempo de exposição ao colcemid / colchicina . Usar sincronizadores do ciclo celular

Sincronizadores do ciclo celular: . MTX (metotrexato)- bloqueia o ciclo celular, mais precisamente atua na fase S Estes compostos bloqueiam o ciclo celular na mesma fase, fazendo com que todas as células partam para a divisão ao mesmo tempo

Citogenética Molecular

Hibridação In Situ Fluorescente – FISH Cariótipo Espectral – SKY Hibridação Genômica Comparativa - CGH

Citogenética Molecular

FISH – Fluorescence In Situ Hybridization SKY – Spectral Karyotyping CGH – Comparative Genomic Hybridization

Hibridação In Situ Fluorescente - FISH

A técnica de hibridação in situ fluorescente permite a localização física precisa de genes ou sequências de DNA diretamente nos cromossomos presentes nas preparações citológicas.

-Necessita de sequências conhecidas – sondas -Hibridação de sequências complementares

FISH

1. sonda de DNA marcada 3. Hibridação da sonda com o DNA do cromossomo

2. DNA desnaturado

Diagnóstico rápido de trissomias

Síndromes de microdeleções; duplicação

Rearranjos cromossômicos

Rearranjos cromossômicos; número cromossômico anormal; presença, ausência ou localização de um gene; duplicação; deleção específica Menores rearranjos (resolução): na faixa de 1 milhão de pb (1 Mb)

Hibridação In Situ Fluorescente • FISH – células interfásicas líquido amniótico • Crom. 18=azul; crom. X = verde; Y=vermelho

47,XX, + 18

47,XX, + 21

•FISH – cromossomos metafásicos •Detecção de telômeros •Sonda repetida TTAGGG •Duas cromátides irmãs evidentes

Hibridação In Situ Fluorescente Deleções e duplicações muito pequenas - Síndromes de genes contíguos

•Fluorescência bicolor •Síndrome de Prader-Willi •Deleção de 15q11-q13 (SNRPN) •Verde: centrômero 15 •Vermelho 15q distal: sonda controle

Categorizadas por padrões reconhecíveis de múltiplas malformações e anomalias devidas à duplicações e deleções de vários genes situados próximos em um determinado locus.

Hibridação In Situ Fluorescente Pintura cromossômica -

Chromosome painting

Rearranjos cromossômicos; Origem de cromossomos marcadores •Translocação balanceada entre os cromossomos 11 e 16 •Sonda de pintura cromossomo 11 •46,XY,t(11;16)(q24;q23)

Hibridação In Situ Fluorescente

•FISH de interfase em amniócitos: sondas centroméricas dos cromossomos 18, X e Y

•Diagnóstico de aneuploidias: 13, 18 e 21 •Diagnóstico pré-natal

Hibridação In Situ Fluorescente

•FISH em células de medula óssea: sondas de sequência única •Específicas para um determinado local •Detectar deleções e duplicações gênicas •Sonda para o gene BCR/ABL ( indicação de LMC) •A: sinais separados BCR/ABL negativos; B: sinais fundidos BCR/ABL positivo

Cariótipo Espectral (SKY)

•24 diferentes sondas multicoloridas de cromossomos •Combinação diferente de corantes fluorescentes •Duplicações, deleções e rearranjos (anomalias estruturais); anomalias numéricas

Análise SKY de caso de LMC

Análise SKY de carcinoma de ovário

Hibridação Genômica Comparativa(CGH) Sondas de biotina Fluoresceína (FITC)

digoxigenina rodamina (TRITC)

As duas amostras de DNA marcadas são combinadas e hibridizadas, juntamente com uma amostra não-marcada de DNA altamente repetitivo (Cot-1), em metáfases humanas masculinas normais de células não cancerosas web.cc.yamaguchi-u.ac.jp/. ../E.CGH1.page.htl

• Usada para medir as diferenças no número de cópias ou dosagem de um segmento cromossômico; amplificação gênica ou deleção, de todo o genoma; não avalia rearranjos ou translocações • Não depende do conhecimento prévio das regiões genômicas frequentemente afetadas e de células em metáfase do tecido em estudo

• Mede a proporção de fluorescência de vermelho para verde • O DNA adicional em células tumorais (amplificação) mostra-se em verde • A redução na quantidade de DNA (deleção) mostra-se em vermelho

• Muito usado para síndromes de microdeleção (array CGH) e câncer (tumores sólidos), diagnóstico de retardo mental sem causa definida. • Resolução: 5 a 10 Mb Kallioniemi et al., 1992 (Science, v. 258, p. 818)

+ Vermelho

Proporção verde:vermelho: 0,5 1

+ Verde

+ Vermelho

+ Verde

2

DNA de trissomia distal 18p marcado com verde e DNA normal marcado com vermelho

DNA de monossomia distal 18p marcado com verde e DNA normal marcado com vermelho

Proporção verde:vermelho = 1,5:1 (amplificação gênica) na área da trissomia; 1:1 nas outras áreas (normal, coloração azul)

Proporção verde:vermelho = 0,5:1 (deleção gênica) na área da monossomia; 1:1 nas outras áreas (normal, coloração azul)

Carcinomas pancreáticos por CGH: ganhos de DNA cromossômico em 3q, 5p, 7q, 8q, 12p e 20q; e perdas em 8p, 9p, 17p, 18q, 19p e 21.

Perfil de CGH -

array CGH

B. lâmina apresenta um microarranjo de segmentos de DNA imobilizados (oligonucleotídeos sintetizados, 500 bp), representando milhares de genes, ou seja, regiões específicas de todo o genoma ( parte expressa, funcional)

array CGH

 Microarranjos contendo centenas de milhares de pequenas sondas de oligonucleotídeos  Detecta deleções ou duplicações com resolução de 50 a 100 Kb, ou até menos, capazes de afetar um único gene  Importantes para diagnóstico de microdeleções  Processo altamente automatizado  Não detecta rearranjos equilibrados  Plataforma com painéis de 180.000 sondas