MCLI 103 Clase 21 Metodos fisicos y quimicos de destruccion bacteriana

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Introducción a la microbiología - Wendy Wilson 30/10/2018 - Barbara Perez

MÉTODO FÍSICOS Y QUÍMICOS DE DESTRUCCIÓN MICROBIANA Estos métodos tienen una gran incidencia en la atención hospitalaria y constituye un desafío para todo el equipo de salud, porque un hospital o un consultorio no puede funcionar si el material que se utiliza no está libre de MO, es importante que esto sea así porque el perfil de los pacientes a cambiado, hace 50 años atrás los adultos llegaban a los 40, 50 años y fallecían, ahora llegan a los 80, 100 años porque hay nuevas técnicas, métodos, implementación mejor. También han aparecido nuevas enfermedades como el VIH, nuevas tecnologías de diagnóstico, tratamientos invasivos que llevan a que los pacientes se infecten, tratamientos a pacientes que están con terapia inmunosupresora, endoscopía, paroscopía. Además para prevenir, se está haciendo esterilización domiciliaria El hecho de conocer todas estas técnicas, está orientado a eliminar de forma química o física los MO del medio ambiente, o de las cosas que utilizamos, esto hace que la incidencia de infecciones asociadas a la atención de salud disminuya. En todo laboratorio, hospital tiene que haber una instancia que provea material libre de contaminantes, libre de agentes virales, bacterias, hongos parásitos que van a constituir un riesgo para el paciente, por lo tanto, a nivel de hospital tiene que haber un servicio de esterilización, con personal capacitado, para poder operar los equipos y para que ellos mismos no corran riesgo. La persona encargada de este servicio debe tener la capacidad de incorporar nuevas tecnología o nuevos métodos para eliminar estos MO y además tiene que velar por que se cumplan las normas nacionales y locales de los procedimientos. El objetivo de conocer todas estas técnicas es para:  

 

Prevenir infecciones en el ser humano y en los animales  material para recolectar muestra y ser procesada posteriormente, jeringas para extraer sangre, todo ese material tiene que estar libre de MO y de esa forma prevenir infecciones Evitar descomposición, no sólo aplicado a laboratorio sino en general  para preparación de alimentos, por ejemplo, evitar el proceso de descomposición de una bebida o un alimento en que está participando un MO no deseado, como por ejemplo la levadura que se utiliza para hacer pan es un hongo, si esa masa se contamina con otro MO, ese proceso de fermentación no va a suceder, o va a suceder mal. Evitar interferencia en distintos procesos Prevenir contaminación en todo el material que se utilice.

Existen distintos tipos de MO, unos más resistentes que otros, y con distintas localizaciones. Los MO están en la piel, en todo el medio ambiente, por todo esto es que no existe un método específico que abarque todas las circunstancias, los métodos se utilizan de acuerdo a lo que se quiere eliminar, que bacterias o MO se espera encontrar, la localización (si los MO están dentro de un tubo, de una placa, o sobre la superficie del mesón), considerando todo esto hay que ver que método se aplicara en cada situación. Resistencia de MO. Hasta el momento lo más resistente que se conoce y tiene capacidad infecciosa son los priones, luego le siguen todas las bacterias con capacidad de producir esporas, después las micobacterias que son las agentes de tuberculosis o de lepra, los virus sin lípidos, los hongos, las bacterias en su forma

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vegetativa y finalmente los más sensibles de todos son los virus con lípidos. Es distinta la técnica que se aplicara cuando se sospecha de priones a cuando se sospecha de bacterias en forma vegetativa. Con los métodos físicos, químicos y biológicos se puede obtener: destrucción total del MO, inhibición de su desarrollo o separación unos de otro (ej. por centrifugación o filtración). Desde el punto de vista de la microbiología lo que más interesa es la destrucción del MO no deseado. Conceptos: Esterilización: Material que está libre de todo tipo MO, incluirá priones, formas vegetativas, esporuladas, hongos, todo. Desinfección y Antisepsia, ambas se utilizan cuando se quiere eliminar en forma total o parcial MO, pero solo por métodos químicos. La diferencia que hay entre ambos términos es que la desinfección se hace con sustancias químicas biosidas (cualquier sustancia química que tiene acción sobre un MO), que son tóxicas para la piel y las mucosas de los seres vivos, por lo tanto, la desinfección se hace sólo sobre objetos inanimados (ej. piso, mesón) y dependiendo el tipo de biosida que se utilice se puede lograr la esterilización, o sea la eliminación de todos los MO, porque los biosidas tienen distintos grados. La Antisepsia utiliza biosidas que se aplican sobre piel y mucosas, esta se utiliza previo a un procedimiento quirúrgico, antes de una punción venosa o antes de una punción intramuscular, por ej. Con la antisepsia se previenen infecciones, no se eliminarán todas las bacterias, sino sólo las patógenas. METODOS FISICOS Seco

Directo Ej.: Sollamado Incineración Aire caliente Ej.: Horno Pasteur

Calor Con Presión Ej.: Autoclave TEMPERATURA:

Húmedo Sin Presión Ej.: Ebullición Pasteurización y tindalizacion Frio

Refrigeración Congelación Liofilización

Aplicación de calor que puede ser seco o húmedo. Calor: a) Seco: a. Directo, corresponde al sollamado o incineración que consiste en colocar el asa de nicron o de cultivo directamente sobre la llama del mechero hasta que este roja, y con

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esto esterilizamos el asa con la que se trabajara, otra aplicación no tiene. Alrededor del mechero la zona no está estéril, pero si tiene una carga bacteriana menor. b. Por circulación de aire caliente, se logra en el horno Pasteur, es un horno generalmente eléctrico, al abrirlo tiene rejillas, y sobre estas se coloca el material que uno quiere esterilizar, el horno además tiene un marcador de temperatura, y un timer, hay dos opciones para utilizarlo, una a 165 - 170 °C por 2 horas o bien a 180°C por 1 hora. La precaución que hay que tener al utilizarlo es que el material que se quiere esterilizar ya debe estar limpio y además debe ir envuelto, los tubos deben ir taponados, para que cuando termine el proceso de esterilización, se saque el material y se almacene para ser usado, pero tiene que estar protegido, envuelto o en porta placas metálico para así no tocar el material una vez esterilizado y no contaminarlo. En el horno se puede esterilizar todo lo que sea de vidrio y todo lo metálico, nada que sea de plástico o goma, ya que no resistiría la temperatura.

b) Húmedo: a. Con presión, en ese caso se habla de autoclave de desplazamiento por gravedad (significa que vapor de agua desplaza al oxigeno), que son los que habitualmente se tienen en los laboratorios. El autoclave, en los laboratorios funciona a 121°C a 1 atm de presión por 20 minutos, el proceso es mucho más rápido ya que a menos temperatura, menos tiempo, porque la presión hace que el vapor penetre más en todo el material que se va a esterilizar.

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Esquemáticamente el autoclave funciona igual que una olla a presión, tiene que tener agua, sobre ella va una rejilla perforada para que pueda pasar el vapor de agua, una fuente de poder que puede a gas o eléctrica y una tapa que sella herméticamente, que tiene unos tornillos que la ajustan, un manómetro, un termómetro, una válvula de seguridad (que en caso de que aumente más la presión se abrirá y dejara salir vapor de agua) y una espita (válvula). Se coloca dentro el material que se quiere esterilizar, se cierra la tapa, verificamos una barra que indica el valor de agua, para que tenga lo suficiente y se conecta a la fuente de poder. Al inicio se debe dejar la válvula espita abierta, el agua comienza a hervir y empieza a producir vapor de agua, ese vapor de agua tiene que reemplazar a todo el oxígeno del recipiente, por eso hay que dejar abierta la espita, cuando de esta salga un chorro continuo de vapor, eso quiere decir que el vapor de agua a reemplazado todo el oxígeno que estaba dentro, en ese momento se cierra la espita y se comienza a acumular presión, es al momento de cerrar la espita que empiezan a correr los 20 minutos, es un proceso rápido, eficiente, siempre se lograra esterilización. En el laboratorio se esterilizará todos los medios de cultivo, aunque sean medios sólidos todos llevan agua, por lo tanto, se esterilizan en un medio húmedo o si no se deshidratan. Todos los medios de cultivo, ya sea en matraces o en tubos se esterilizarán en el autoclave. Todo el material contaminado por ej. las ollas del laboratorio con todas las placas con agar se colocan completas al autoclave, los frascos o tubos con muestras biológicas luego de ser sembradas también. Una vez terminado el proceso de esterilización hay que esperar a que baje la presión y la temperatura y luego se abre el autoclave, con una espátula, con la mano o con guantes se bota a la basura los restos de agar, luego las placas se lavan con un detergente especial, se ponen a un secador, y finalmente el material se envuelve con papel Kraft. Este material limpio y seco se esteriliza en el horno pasteur para volver a utilizarlo, al menos las placas de vidrio, porque todo el material de plástico pasa por el autoclave y luego es desechado. También se pueden esterilizar en el autoclave algunos plásticos como tubos con tapa rosca por ej. que soportan la alta temperatura y que son reutilizables, pero en general todas las placas Petri, frascos de recolección de orina, jeringas, etc. no son resistentes y salen deformados del autoclave. El único inconveniente de la autoclave es que el material sale húmedo, pero eso no importa ya que los medios de cultivo tienen agua y el material contaminado se lavará e igual quedara mojado. A los matraces se les coloca un tapón de algodón, y sobre eso una capucha de papel amarrada con pita, para que el vapor de agua no penetre dentro del medio. Cuando se prepara un agar una vez que el polvo se disuelve bien dentro del matraz, se lleva al autoclave y se esteriliza, luego el agar se coloca en placas previamente esterilizadas en el horno pasteur. Para medios semisólidos o líquidos también se prepara el agar, pero se pone directamente a los tubos y luego estos van al autoclave al sacarlos se colocan tendidos o parados dependiendo de lo que se necesite.

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En los hospitales se utilizan autoclaves de mayor tamaño, en que el volumen del material a esterilizar es muy grande. Estas autoclaves tienen externamente una bomba de vacío que chupa todo el aire de la autoclave, y también tiene una bomba externa de vapor, por lo tanto, el autoclave soló calienta ese vapor de agua. La otra diferencia de este autoclave es que el material sale seco ya que una vez que termina el proceso de esterilización, aspira todo el vapor de agua y tira calor. Estos autoclaves son totalmente automatizados, se les coloca la temperatura, tienen timer para programar el tiempo total, el tiempo de secado en cambio el del laboratorio no es así. Además, los autoclaves del hospital tienen distintos programas dependiendo de lo que se quiera esterilizar. Ej. programa 1 para instrumental y ropa en envases chicos a 134°C por 4 minutos y tiempo de secado 20, aumenta la temperatura para poder eliminar con mayor certeza todos los MO y cuando hay sospecha de priones ej. paciente con síndrome de la vaca loca, todo lo que este en contacto c on ese paciente, todos los fluidos corporales, todo va en recipientes aparte porque se esterilizan a 136°C, es la única forma de eliminar los priones por 35 min y 25 min de secado. Bowie Dick es una prueba que se hace correr todos los días que mide todos los parámetros del autoclave para saber si están funcionando bien. Para saber si un objeto ha sido esterilizado por autoclave u horno pasteur se utilizan controles que pueden ser químicos, biológicos o físicos. Métodos químicos se usan en tiras de okey, es una tira engomada, hay para horno y para autoclave. Estas tiras están impregnadas en una sustancia química que cambia de color a la temperatura requerida, cuando se visualiza sin línea es porque no ha pasado por autoclave o por horno, cuando hay una línea es porque paso por uno de los dos. Método biológico para controlar que se eliminen todos los MO se utilizan MO esporulados del género Bacillus que se sabe exactamente a que temperatura se mueren, se compra la ampolla que viene con un caldo y el Bacillus más un indicador de pH. Estas se colocan una vez a la semana, o una vez al mes dependiendo de las instrucciones del fabricante en el proceso de esterilización, pasa este proceso y las ampollas se incuban a baño maría y si cambia de color (normalmente son lilas) a amarillo significa que el proceso estuvo mal hecho, porque las esporas que estaban en tubo al darle la t° adecuada a los 37°C se desarrollaron, por lo tanto, no fueron eliminadas y el proceso no alcanzo la t° requerida. Métodos físicos consisten en ver que los termostatos estén funcionando bien, que cuando diga que está en 180°C lo esté. b. Sin presión que es a través de un proceso de pasteurización y la tindalización (ya no se usa, porque hay métodos mejores) Pasteurización: no es un método de esterilización, sino que es un método que destruye cierto tipo de MO y que se creó para eliminar MO no deseados especialmente en los productos lácteos. Por ej. La leche contiene muchos MO benéficos para el ser humano (Streptococcus, Lactobacillus, etc) que colonizan nuestro intestino y nos protegen de bacterias enteropatógenas ya que estas no encuentran un nicho libre para quedarse, pero a veces los animales se enferman, las vacas con mastitis contaminarían su leche por ej. con Staphylococcus aureus que es un MO altamente patógeno, para prevenir la contaminación de la leche que viene en buenas condiciones porque el animal está enfermo se someten a la pasteurización, en esta se matan los MO malos de la leche, pero quedan los que son benéficos para el ser humano.

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La técnica consiste en calentar la leche o el alimento a temperaturas muy altas, en periodos muy cortos. Hay 3 tipos de pasteurización dependiendo del alimento:  LTLT (low T°- long time) a 65°C x 30 s  HTST (high T° - short time) a 72°C x 15 s Enfriamiento rápido  UHT (ultra-high T°) a 130° - 150°C x 5 s (10°C) Los alimentos lácteos ocupan UHT. Frio: Refrigeración: La aplicación de frio mata a las bacterias, pero no es un método de esterilización, lo único que hace es detener la multiplicación de las bacterias, con ello evitamos que los alimentos se descompongan, para eso se usa la refrigeración. El que comúnmente esta en la casa tiene una temperatura de 4°C y eso permite detener con el tiempo la multiplicación bacteriana. Congelación: Hay 2 tipos: 



A -18°C, es el que se tiene en casa. Se pueden guardar algunas cepas, pero hay cepas que son muy sensibles a la temperatura y que ni siquiera existe una refrigeración, ni congelación, por ejemplo: los MO que producen meningitis (haemophilus influenzae), enfermedades de transmisión sexual, ya que a temperatura ambiente se mueren. Pero las cepas que utilizamos en el curso se mantienen congeladas a -18°C. A -80 -85°C, que es el que se usa en los laboratorios para conservar todo tipo de muestras, sustancias, etc. Es lo ideal, porque la congelación es rápida que el MO no sufre ningún cambio, van obviamente con un bioprotector. Cuando queremos obtener una cepa especial que guardamos, sencillamente se saca, se deja descongelar en el ambiente y se pasa al medio de cultivo adecuado y finalmente se incuba y obtenemos la cepa con todas sus propiedades. También sirve para guardar sueros, cualquier sustancia liquida o medios, etc.

Liofilización: es una deshidratación al vacío, y es otra forma de conservar MO, pero no solo en la microbiología, sino que también en la industria alimenticia como, por ejemplo: el puré, la leche en polvo, etc. Cuando usamos MO, estos son observados en un tubo con una ampolla especial, un caldo con concentrado de la bacteria y eso se descongela y se deshidrata, se saca todo el líquido y queda transformado en polvo. Cuando queremos reconstituir esa capsula de bacterias deshidratadas se vacía en un tubo con un medio de cultivo. También se utiliza en la industria farmacéutica, hay vacunas, antibióticos que vienen liofilizadas. Otros métodos físicos: CENTRIFUGACIÓN, por distintas densidades se pueden separar diferentes MO, no es muy usado. PRESIÓN OSMÓTICA, en un laboratorio no se usa, pero si, en la industria alimenticia, como una forma de conservar alimentos, como por ejemplo alimentos con altas concentraciones de sal o azúcar. ULTRASONIDO, tampoco tiene mucha aplicación. RADIACIONES IONIZANTES: Rayos X y Gama, con ellas se puede lograr esterilización, pero tiene sus inconvenientes, como los rayos X, que son tóxicos para el ser humano. Los rayos gama se usan mucho, pero para usarlas como métodos de esterilización son muy caros, por lo que no hay laboratorio de diagnóstico que los use, los que lo usan son las industrias farmacéuticas, en el que el volumen de

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‘’cosas’’ que tienen que esterilizar es muy grande. Estos ratos gama son capaces de penetrar algunos plásticos, papeles, parche curita, apósitos, jeringas desechables, etc. RADIACIONES ULTRAVIOLETA: La luz ultravioleta artificial es un excelente esterilizante, pero altamente irritativo para los seres vivos, pero si tiene aplicación y se sigue usando, pero con medidas de precaución. Hay que tener presente de que esta no tiene poder de penetración. FILTRACIÓN: este proceso se está reemplazando la tindalización, que es una esterilización fraccionada. Hoy en día tenemos diferentes tipos de filtros, aparatos, para hacer estas filtraciones y son de mucha utilidad, primero porque hoy en día la industria fabrica filtros de celulosa con poros de tamaño conocido, y vienen estériles. Para la filtración tenemos que tener un matraz, una cúpula y una bomba de vacío para que haga succión. Aplicaciones en microbiología: 1. Esterilizar medios de cultivo, que tienen compuestos orgánicos, como la urea, que no se pueden someter a calores altos porque se destruye. También hay algunos hidratos de carbono que no se pueden esterilizar de otra forma que no sea por filtros. El medio se hace pasar por un filtro, que está conectado con un matraz estéril, que se conecta con la bomba de vacío, hacemos vacío y el líquido comienza a pasar por el filtro, y tenemos en el matraz un medio libre de MO. 2. Hacer conteo de MO, primero el agua se filtra a través del matraz, y luego ese filtro se coloca sobre un medio de cultivo. El filtro es poroso, por lo que las bacterias van a poder obtener los nutrientes y van a crecer sobre el filtro, y se cuentan. También para concentrar ciertos MO como los campylobacter que son enteropatogenos y tienen requerimientos nutricionales especiales, pero si una muestra de deposición se sembrara directo sobre ese medio crecerían todas las enterobacterias y no nos permitiría diferenciarla con la patógena, por lo que en la placa ira en orden: 1° Medio de cultivo – 2° filtro de poros muy pequeños – 3° deposiciones con suero fisiológico. Por el filtro solo pasaran la campylobacter, y una vez que se ha visto que se a absorbido el líquido ese filtro se elimina por autoclave. METODOS QUIMICOS BIOCIDA: Toda sustancia química que tiene una acción sobre MO. Dentro de ella tenemos desinfectantes y antisépticos. DESINFECTANTE: Toda sustancia química que tiene acción antimicrobiana (bactericida y/o bacteriostática). Se utiliza sobre superficies inanimadas por ser altamente tóxica sobre tejidos vivos.

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ANTISÉPTICO: Biocida aplicable sólo en superficies mucosas y piel, por no ser tóxica sobre ellas. Se usa para inhibir el desarrollo microbiano (acción bacteriostática). CLASIFICACIÓN SEGÚN POTENCIA DEL BIOCIDA BIOCIDA

Esporas

Micobacterias

Hongos

Virus

Nivel Alto + Nivel intermedio -

+ +

+ +

Nivel bajo

-

+ (algunos)

+ + (sólo con lípidos) + + (algunos)

-

Formas vegetativas + +

Nivel alto  desinfección y esterilización. Nivel bajo  antiséptico Nivel intermedio  antiséptico un poco más efectivo. En la etiqueta vienen indicados (bidones del producto químico concentrado): - Nombre del producto - Nivel - Preparación (proporción de dilución, en que se diluye y el material en el que se diluye). ¿CÓMO INTERACTUA EL BIOSIDA CON LA CÉLULA? Interacción de biocida con superficie celular del MO Penetración celular Acción en distintos sitios específicos Un mismo biocida puede tener varios ciclos de acción diferente y eso lo hace mucho más efectivo. MECANISMOS DE ACCIÓN SOBRE MO 1. Sobre membrana o Pared celular:  Dificultando su síntesis. Por ejemplo: penicilina  Por combinación con lípidos de membrana, ej: alcohol y fenol  Por inhibición de cadena transportadora de e-. ej: hexaclorofeno. 2. Sobre proteínas y enzimas de MO:  Coagulando y desnaturalizando proteínas ej: alcohol y fenol.  Efecto tóxico sobre enzimas o Oxidación de radicales libres ej: peróxido de hidrogeno, yodo y cloro. o Efecto alquilante ej: formalaldehido y glutaraldehido.  Formación de compuestos con: - Radicales libres de la bacteria ej: mercuriales - Grupos sulfídricos ej: clorogenos - Grupos amina ej: formol y glutaraldehido

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3. Alteración cromosoma:  Interfiere con la replicación de ácidos nucleicos ej: radiaciones, colorantes, formaldehido Un mismo Biocida puede tener más de un mecanismo de acción CLASIFICACIÓN DE BIOCIDAS  Compuestos inorgánicos:  Ácidos y álcalis  Matan todo pero no tienen ninguna aplicación práctica porque son altamente tóxicos, como hidróxido de sodio, ácido sulfúrico, ácido nítrico  Sales de metales pesados  Plata (nitrato de plata), cobre (sulfato de cobre) y la más utilizada la de Mercurio.  Halógenos  Cloro y derivados (mejor Biocida actual, elimina de todo menos los priones), Yodo y derivados (excelente antiséptico), Yodóforos (muy irritativo).  Otros  H2O2, Permanganato de K, Gas plasma de H2O2, Ácido peracético. *Los priones la única forma de eliminarlos es en autoclave a 136°C *los biocidas cloro y el peróxido de hidrogeno tienen un inconveniente, se inactivan en presencia de materia orgánica.  Esterilización por gas plasma de H2O2: - Se le aplica un campo electromagnético sobre vapores H2O2. - Se usa con fines de esterilización - Proceso funciona en cámaras a 45°C por 55 – 75 minutos. - Se esteriliza el material que no puede ir a Horno Pasteur o Autoclave. - Tiene 2 inconvenientes: tienen poco poder de penetración, por lo tanto, sondas o pipetas que tengan un número muy pequeño, no es capaz de penetrar el vapor de H2O2. Lo otro es que todo lo que tenga celulosa se inactiva, por lo que el material no puede ir envuelto en nada que contenga celulosa, por lo que se envuelven en bolsas de polipropileno. - Se puede esterilizar, plástico, goma, líquidos, etc.  Steris system: - Excelente desinfectante. - Se utiliza en ambientes médicos donde hay instrumentos que no pueden ser sometidos ni a autoclave, ni a horno Pasteur, ni a gas plasma de H2O2, porque tienen lúmenes muy pequeños. Por ejemplo, endoscopios, mangueras de goma, otros. - Inmersión en Ácido peracético 0.2% - 12 mín. a 50 – 55°C - Está conectado a una fuente con agua estéril y se lava con ello, y en 1 hora y media, podrá ser utilizado por otro paciente.  Compuestos Orgánicos:  Alcoholes 70 y 90 %  etanol, isopropanol, etilenglicol (óxido de etileno) este último fue remplazado por el gas plasma porque es altamente toxico y además una vez que se hace el proceso de esterilizacion que demora como 24 horas, el material que se saca del aparato tienen que dejarse en el ambiente unas 48 horas más para liberar el óxido de etileno que queda en ellos. Utilizado como antisépticos y como desinfectante, pero de nivel intermedio.

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 Fenoles Excelente Biocida, pero altamente irritativo. Sólo se utiliza para probar sustancias nuevas, determinando el coeficiente fenólico de otros biocidas (Gold estándar). Es patrón de comparación con emergentes biocidas (única utilidad actual). Derivados: Bifenoles (hexaclorofeno, triclosan). Si tienen aplicación. Hoy en día están prohibidos en algunos países por que estas sustancias son absorbidas por la piel, las cuales se acumulan y a largo plazo causan daño. Estos fueron reemplazados por biguanidinas.  Biguanidinas  clorhexidina (dentífricos, desodorantes, jabones, otros.) excelente antiséptico, muy utilizado hoy en día en muchos productos, como por ejemplo antisépticos de piel.  Aldehídos  Formaldehidos, formalina y glutaraldehido. Son de naturaleza esterilizantes, biocidas de alto nivel, sin embargo, los dos primeros son altamente tóxicos. A nivel hospitalario se usa glutaraldheido.  Colorantes  cristal violeta, violeta de gensiana, azul de metileno, tienen acción antibacteriana a nivel de los ácidos nucleicos, pero la eliminación de MO es bien sesgada. Tienen acción principalmente en las bacterias gram (+).  Detergentes iónicos  - CATIÓNICOS: Derivados de amonio cuaternario (cloruro de benzalconio: Cetritane) - ANIÓNICOS: Fenoles, Laurel sulfato. FACTORES QUE AFECTAN LA ACCIÓN DE LOS BIOCIDAS  Concentración  cada biocida utiliza a una concentración determinada.  Tiempo de exposición  no hay ningún Biocida que tenga acción inmediata, todos necesitan de un tiempo de acción. Por ejemplo, el alcohol y los derivados del yodo, que son los que más se utilizan en clínica, vamos a saber que ejerció su efecto cuando la piel a la cual estuvo expuesta cuando la piel este seca.  pH  debe ser pH neutro.  Temperatura  que sea efectivo a la temperatura ambiente o corporal.  Microorganismo  Tipo y cantidad. Por ejemplo, utilizar un biocida de alto nivel para eliminar todas las bacterias tanto vegetativas como esporuladas que vendrán con las deposiciones, y la cantidad biocida adecuado al de MO.  Presencia de materia orgánica  Algunos se inactivan. Por esto siempre deberá eliminarse previamente la materia orgánica y luego se agrega el Biocida para que pueda ejercer su acción correctamente.  Contaminación  si los biocidas no están bien almacenados y cerrados se pueden evaporar los compuestos activos, y al final lo que tendremos es agua o un químico que tiene poca actividad bacteriana y también se pueden contaminar.