Manual para Tecnico Superior de Laboratorio Clinico y Biomedico

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MANUAL PA A TECNICO SUPERIOR , , DE LABORATORIO CLINICO y BIOMEDICO

Francisco Javier Mérida de la Torre Profesor de Bioquímica-Nutrición, Centro Universitario de Enfermería de Ronda, Universidad de Málaga Jefe de Servicio de Laboratorio, Área de Gestión Sanitaria de la Serranía de Málaga

Elvira Eva Moreno Campoy Profesora de Seguridad Clínica, Centro Universitario de Enfermería de Ronda, Universidad de Málaga Farmacéutica, Área de Gestión Sanitaria de la Serranía de Málaga

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CÉ panamericana

EDITORIAL M~DICAia":)

BUENOS AIRES - BOGOTÁ - CARACAS - MADRID - MÉXICO - PORTOALEGRE www.medicapanamericana.com

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Indice de colaboradores

Aguado Codina, María Cristina Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universi tario y Politécnico La Fe, Valencia.

Bonet Estruch, Elena Laboratorio de Metabolopatías y Cribado Neonatal, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Alba Redondo, Desamparados Departamento de Hormonas, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Buño Soto, Antonio Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario La Paz, Madrid.

Alonso Blázquez, Elena Laboratori Pasteur, Andorra la Vella, Andorra.

Alonso üíaz, Ricardo Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universi tario y Politécnico La Fe, Valencia.

Álvarez Corral, Gemma Departamento de Biotecnología, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Alta Resolución Guadix, Granada.

Caballero Ruíz, María Servicio de Laboratorio Clínico, Instituto Oncológico, San Sebastián.

Cabezas Fernández, María Teresa Departamento de Microbiología, Servicio de Biotecnología, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Coba Martínez, Fernando Amigo Moreno, Raquel Servicio de Biobanco, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Servicio de Microbiologia, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Collado López, Susana Andino Castro, Belinda Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universi tario y Politécnico La Fe, Valencia.

Avivar Oyonarte, Cristóbal Servicio de Biotecnología, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Bel Peña, Nieves Departamento de Laboratorio Clínico y Medicina Preventiva, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Bellmunt Barreda, Elena Servicio de Biobanco, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Benayas Bellido, María del Pilar Departamento de Análisis Clínicos, Servicio de Biotecnología, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Collado Yurrita, Luís Departamento de Medicina, Facultad de Medicina, Univer sidad Complutense de Madrid.

Córdoba Cortijo, Juan Ginés Departamento de Biología Molecular, Servicio de Microbiología, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Cordón Gallego, Lourdes Departamento de Citomorfología, Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Cuadrado Cenzual, María Ángeles Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

v

índice de colaboradores

Cuñat Estellés, Pilar Departamento de Citomorfología, Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

González Oller, Carlos Departamento de Biotecnología, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Gutiérrez Fernández, María Jesús De la Fuente Madero,José Luís Unidad Médica del Equipo de Valoración de Incapacidades, Dirección Provincial de Málaga, Instituto Nacional de la Seguridad Social, Málaga.

Unidad de Laboratorio Clínico y Medicina Preventiva, Servicio de Microbiología, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Hernández Tintorer, José Luís De Pedro Moro, José Antonio Servicio de Traumatología, Ho spital Clínico, Salamanca.

Esteban Pagola, Ana Isabel Departamento de Contabilidad y Gestión, Área de Economía Financiera y Contabilidad, Facultad de Comercio y Gestión, Universidad de Málaga.

Unidad de Hematología Analítica, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

IzquierdoÁlvarez, Silvia Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.

Izquierdo Quirce, Juan Fernando Ferrer Cañabate, Jaime Unidad de Laboratorio, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital José Maria Morales Meseguer, Murcia.

Unidad de Bioquímica, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital de Galdakao, Usansolo, Galdakao.

Labraña de Miguel, Javier Fuster Lluch, Osear Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Unive rsitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Departamento de Citogenética, Reference Laboratory, Hospitalet de Llobregat, Barcelona.

Láiz Marro, Begoña García Bautista, JesúsAlejo Departamento de Hematología, Servicio de Biotecnología, Hospital de Alta Resolución de Guadix, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, Guadix, Granada.

García Ruiz, Pablo Equipo de Valoración de Incapacidades, Instituto Nacional de la Seguridad Social, Granada.

Gella Tomás, Francisco Javier Departamento de Bioquímica y Biología Mo lecular, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Barcelona.

Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Ledesma Vaquero, Abraham Siemens HealthCare Diagnostics, Cornella de Llobregat, Barcelona.

López Ruiz, Antonio Laboratorio Clínico y Medicina Preventiva, Servicio de Bioquímica, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Marín Seria, José Luís Giménez Lozano, Cristina Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Unive rsitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Gómez Álvarez, Ana María Unidad Médica del Equipo de Valoración de Incapacidades, Dirección Provincial de Málaga, Instituto Nacional de la Seguridad Social, Málaga.

Gómez-Cambronero López, Luis Gregario Unidad de Hemostasia y Trombosis, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Laboratorio Cribado Neonatal, Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Hospital Clinic, Sede Maternitat, Barcelona.

Martín Castillo, Iván Unidad de Hematología (Citogenética), Servicio de Hematología -Hemoterapia, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Martín Marco, Ana Belén Servicio de Biobanco, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Martínez Fernández, Javier Gaspar González Estecha, Monserrat Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. VI

Unidad de Análisis Clínicos, Servicio de Biotecnología, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

índice de colaboradores

Martínez Triguero, Maria Luisa Unidad de Hormonas, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

MedinaJouannys, Sandra Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Univers itario y Politécnico La Fe, Valencia.

Mérida de la Torre, Francisco Javier Centro Universitario de Enfermería de Ronda, Universidad de Málaga. Servicio de Laboratorio, Área de Gestión Sanitaria de la Serranía de Málaga.

Molina Arrebola, María Angustias Servicio de Hematología y Hemoterapia, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Molina Moreno, José Miguel Unidad de Biología Molecular, Servicio de Microbiología, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Pérez Martínez, Alfonso Unidad de Laboratorio, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital José Maria Morales Meseguer, Murcia.

Pérez Moyano, María Rosario Servicio de Hematología y Hemoterapia, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Pérez Santos, María Jesús Laboratorio Clínico y Medicina Preventiva, Servicio de Microbiología, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Pérez Surribas, David Laboratori Pasteur, Andorra la Vella, Andorra.

Pino Ríos, María Auxiliadora Dirección, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Repáraz Andrade, Alfredo Mora Corcobado, Roberto Servicio de Laboratorio Clínico, Hospital Universitario La Paz, Madrid.

Morales Alcázar, María de los Ángeles Unidad de Bioquímica Clínica, Servicio de Análisis Clínicos, Complejo Hospitalario Universitario Albacete.

Moreno Campoy, Elvira Eva Centro Universitario de Enfermería de Ronda, Universidad de Málaga. Área de Gestión Sanitaria de la Serranía de Málaga.

Moreno Hevilla, Salvador Laboratorio Clínico y Medicina Preventiva, Servicio de Bioquímica, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Unidad de Citogenética y Genética Molecular, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Xeral, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo.

Rivera Seria, Leonor Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Royo Boronat, Irina Departamento de Biología Molecular, Reference Laboratory, Hospitalet de Llobregat, Barcelona.

Sánchez Crespo, Alicia Servicio de Hematología y Hemoterapia, Agencia Pública Empresarial Hospital de Poniente, El Ejido, Almería.

Sánchez Fragoso, Fernando Murado Pardo, Julián Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Univers itario y Politécnico La Fe, Valencia.

Oliver Sáez, Paloma Laboratorio de urgencias y Point of Care Testing, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario La Paz, Madrid.

Olmeda Herreros, María Consuelo Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Univers itario y Politécnico La Fe, Valencia.

Unidad de Hematología y Hemostasia, Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Sánchez Margalet, Víctor Unidad de Laboratorio, Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla.

Sánchez Martínez, Pilar María Unidad de Laboratorio, Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla.

PaLacios Rodríguez, Sebastián Laboratorio Clínico y Medicina Preventiva, Servicio de Anatomía Patológica, Área de Gestión Sanitaria Serranía, Ronda, Málaga.

Sánchez Pozo, María Cristina Servicio de Laboratorio, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla. VII

I

I

índice de coLaboradores

Sarnago Gonzálo, Ana Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Sempere Talens, Amparo Unidad de Citomorfología, Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

VIII

Suescun Giménez, Marta Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia.

Vázquez Mourín, Luis Servicio de Laboratorio, Hospital Quirón A Coruña.

Prólogo

«El que diga "esto no puede hacerse" se verd superado por otro que lo haga. »

El espectacular desarrollo de los laboratorios durante los últimos años ha conducido no sólo al interés por todas las técnicas y determinaciones que allí se realizan, sino también al amplio conocimiento de todo lo que a ello se refiere y a su correcta aplicación. Este libro está dirigido a los técnicos de laboratorio, que, con la dirección de los facultativos, trabajan para desarrollar todas las tecnologías punteras que hoy en día permiten llegar a un diagnóstico preciso y un tratamiento personalizado de las enfermedades. El Manual para Técnico Superior de Laboratorio Clínico y Biomédico pretende ser el libro de cabecera de todo técnico de laboratorio de cualquier especialidad, pues gracias a él se puede disfrutar de un espacio de enriquecimiento científico, ya que se trata de un amplio compendio de los programas de estudio del Ministerio de Educación, tanto del antiguo como del actual. En este sentido, también permite la posibilidad de utilizarlo como libro de consulta actualizado para la preparación de las oposiciones. Además, la organización por módulos facilita acceder rápidamente al tema que se desea consultar. La elaboración de esta obra ha sido una tarea ardua y minuciosa, pues la diversidad de disciplinas ha requerido la participación de diferentes profesionales especialistas con el fin de poder abordar cada una de las materias. En cualquier caso, no hay que olvidar que este libro sale a la luz en un momento de pleno auge de los técnicos de laboratorio, verdaderos protagonistas del trabajo de los laboratorios y que no siempre gozan de la comprensión y valoración que se merecen. Como presidente de la Asociación Española de Técnicos de Laboratorio (AETEL), agradezco al Dr. Francisco Javier Mérida de la Torre su invitación para escribir el pró logo de este libro, ya que para mí siempre es un placer poder dirigirme a los técnicos de laboratorio. Desde estas líneas quiero hacer llegar a todos ellos mi deseo de que este manual les sea de gran utilidad.

María Jesús Lagarto Benito Presidenta del Comité Científico de AETEL

Juan Carlos Rodríguez, Presidente de AETEL

IX

Prefacio

El auge de los laboratorios clínicos y biomédicos, debido en parte a la accesibilidad Organización a las pruebas diagnósticas, hace que sea preciso formar técnicos superiores altamente sanitaria, calidad cualificados para asumir este reto. y gestión de muestras biológicas Lo anteriormente expuesto, la complejidad de los laboratorios, la diversidad de pruebas disponibles, los altos requerimientos técnicos y la necesidad de conocer aspectos relacionados con esta actividad hacen preciso una formación integral y especializada que permita afrontar esta tarea. Aunque estos conocimientos necesarios, múltiples y variados, se pueden encontrar a través de diferentes fuentes, con este libro se pretende minimizar el esfuerzo de la búsqueda, por parte del lector, aunando los conocimientos precisos en un solo volumen. El propósito de este Manual es satisfacer las necesidades del alumno durante su formación como técnico especialista y al técnico titulado que desee profundizar en sus conocimientos. Sobre todo teniendo en cuenta el momento actual, en el que estamos a caballo entre un programa formativo implantado y las expectativas de un borrador con el nuevo plan de estudios que regulará la formación de los futuros técnicos superiores especialistas de laboFisiopatología general ratorio clínico y biomédico. Esta obra ha pretendido conciliar los dos proyectos añadiendo una visión de futuro. La obra estructurada en ocho módulos sigue un código de colores e iconos con el fin de facilitar al lector la ubicación de los temas. Se han contemplado, aspectos organizativos, administrativos y de seguridad necesarios para todos los laboratorios, que encontramos en el Módulo L Organización sanitaria) calidady gestión de muestras biológicas. Se ha dedicado un apartado concreto a las diferentes técnicas empleadas en los laboratorios tanto clínicos como experimentales, el Módulo IL Técnicas generales de laboratorio pretende dar respuesta a estas necesidades. Uno de los apartados que mayor auge ha tomado en los últimos años ha sido el de la biología molecular. Microbiología clínica capituIOJ3. ldentilic.aciÓn de tas caracterist¡cas de ~ En el Módulo IIL Biología moleculary citogenética, se ha .pretendido reflejar los conocimientos precisos que todo técnico debe tener para abordar esta nueva disciplina ya asentada en la práctica asistencial. El Módulo IV;Fisiopatología general, ofrece al lector la posibilidad de aplicar y entender los conocimientos que va a encontrar en el resto de la obra así como que ellaboratorio es un eslabón más del proceso asistencial y no una actividad aislada de la clínica. El Módulo V; Análisis bioquímico, introduce al lector en los principios y fundamentos de los procesos bioquímicos así como en las técnicas más comúnmente empleadas y su interpretación. El Módulo VL Técnicas de inmunodiagnóstico, se centra en los aspectos inmunológicos del laboratorio que han ido tomando importancia cada vez más. El Módulo VIL Microbiología clínica y el Módulo VIIL Técnicas de análisis hematológico, si bien son apartados clásicos, no han quedado al margen de la incorporación de las nuevas técnicas que actualmente están disponibles así como sus avances en el laboratorio. Cap ít ulo 6. ~tica . bic ética en los ta bora torios clinicos

Cap it ulo 7. Identificac ión de la documen taci én del tabora toric

Ca pit ulo 8. Cal idad de la prestaci én de t servicio o det produc to

Capítulo 9. Muestras biot óqicas humanas Capítul o 10. Muestras sanqulneas

Ca pítu lo 12. Mues lrasdeorigendigestivo

Cap itulo 13. ESludiodetliquidoseminal.Seminog rama

:::: ::':::~::::::7:'~

Ca pítulo 64. lnl roducción a la bacle riologia

C.lpitulo6 5. Tecnicasdeprocesam ientodemues tras bacter iológicas

Capitutc

éé .

Aplicad ónd el écnica sd e tinción y ob se rvacióndem icroorganism os : preparac ión de med ios para elc uUivo de bac terias

XI

Prefacio

Una tarea como la descrita no podía limitarse a la redacción de un manual o libro de referencia al estilo tradicional. Para afianzar los conocimientos, junto al texto escrito, profusamente acompañado de recursos didácticos que amenicen su lectura, se han incorporado una serie de herramientas con el propósito de facilitar la asimilac ión de la información descrita.

El lector encontrará al inicio y al final de cada capítulo invitaciones a recordar conceptos importantes y lo nuclear de cada capítulo.

No debo olvidar qUB•.. •

La confidencialidad durante la

entrevisita~"í~ j'~!\W ;' ",'Il"~~~~~.,._~~_~~_.~,.~.,~_~,.~_-~----.~~~~~~'

garantizar la veracidad en sus respuestas . •

La persona responsable del banco de sangr matología y hemoterapia. ,

•

El banco de sangre es responsable de la ge; gre del hospital.

•

Los dos objetivos principales a la hora de se rantizar la seguridad del donante y obtener calidad y sin riesgos para el receptor.

•

La donación de sangre y componentes sane

•

El paciente debe recibir únicamente los con cesita para solucionar su problema, sin red saria de otros productos.

Al comienzo del capítulo se destacan las palabras clave y durante el desarrollo del mismo, en el margen de la página, se resaltan conceptos clave y cuestiones que ponen a prueba la adquisición de conocimientos. Se ha prestado especial interés a la iconografía, imprescindible en algunos temas como en Microbiología y Hematología.

Conceptos clave que ayudan a la compresión de la lectura.

""'.ti,lillJ.GiA> A,6 ~fF. ; , ti?...

Se inicia el capítulo con las palabras clave .

• • • • •

CuLtivo celular Cariotipo Cromosoma Citogenética Biología moLecular

Las bacterias son microrganismos procariotas (carecen de núcleo definido), de pequeño tamaño [de 0,5 a 5 urnl y no disponen de organelas citoplasmáticas con pared celular de peptidoglucanos y ribosomas 70S.

Iconografía

.-----J Tablas

j

MieLobLasto

15-20 lJm

Redondo

Laxa

2/3

Basófilo, sin granuLación

Figuras

_' -

--Riñón Pelvis renal

i----=---- Uréter 16-251Jm

Redondo Excéntrico

Semi densa

0/1

Basófilo, granulación primaria

Abundante, Condensada

XII

~.;;;;y,=----"0.=-:' - - --

-

Vejiga urinaria Uretra

.A. Figura 11-1. Localización de los riñones.

Prefacio

Además, se ha incluido al final de cada capítulo actividades de evaluación con preguntas de repaso así como casos prácticos donde el lector podrá poner en práctica sus conocimientos.

Preguntas de repaso 1. ¿Qué parte de la res piraci ón es la pasiva? : a. El intercambio gaseoso. b. La inspiración. c. La espiración. d. El espacio muerto. 2. ¿Qué patrones patológicos predominan en las enfermedades pulmonares?: a. Obst r uctivo y restrictivo . b. Enfi sem at oso y obst r uct ivo. c. Enferm edad pu lmo nar obst r uct iva cró nica yasm a. d. Enfi sem a e ins ufic ienc ia respi rat ori a.

Un hombre de 60 años de edad, fumador de una caje ti ll a diaria de cigarrillos, ' obeso, hipertenso, en trata m ient o con antihipertensivos lenalaprill, con hipercolest er olem ia ma l controlada , que comienza con un dolor opresivo centro torác ico, que se le irradi a hacia la garganta, con su do ración pro fu sa, náu seas, cianos is de piel y se nsac ió n de ahogo , se encue nt ra cena ndo en el m ism o rest au ran te qu e ust ed. Ant e esta sit uac ión, le pi den su colaboración . ¿Qué actitud ad opt aría ?

Mediante la visual ización de vídeos se pueden observar las técnicas más usua les del laboratorio, realizado s en situaciones reales y por profesionales del laboratorio.

En el s itio web de la obra se presenta material complementario con importante inform a ción adi cional. Se e ncon tra rán más preguntas de autoevaluación y podrá realizar un exa men online a la carta. Desarrollar los casos prácticos y consultar su solución.

Vídeo 55-1. Técnica correcta para la determinación de drogas de abuso en orina.

Para profund izar en el estudio de la materi a s e invita a consu ltar bibliografía adicional y enlacesde interés.

Con objeto de asegurar la calidad de los conocimientos se ha recurrido a la participación de un número importante de colaboradores que desde todas las perspectivas han ido enriqueciendo el manual con sus conocimientos y experiencia en distintos tipos de laboratorios y centros hospitalarios a nivel nacional. La mayoría de los colaboradores cuentan con experiencia docente en diferentes ámbitos, lo que también se ha valorado como requisito para garantizar la comprensión del texto . Esperamos que esta obra sea de su agrado, que encuentre en la misma las respuestas a las preguntas que le surjan y que sea de su ut ilidad ya que ésta y no otra ha sido nuestra intención.

Francisco Javier Mérida de la Torre Elvira Eva Moreno Campoy

XIII

,

Indice de contenidos

índice de coLaboradores

V

PróLogo..........................................................................

IX

Prefacio

XI

13. Estudio del líquido seminal. Seminograma.......... C. Avivar Oyonarte

141

14. Muestras del tracto respiratorio inferior.............. A. B. Martín Marco

159

15. Muestras para diagnóstico microbiológico que no pueden ser recogidas directamente por el paciente.......................................................

MÓDULO 1 Organización sanitaria, calidad y gestión de muestras biológicas

16.

1. Análisis de la estructura organizativa del sector sanitario......................................................... ........

175

F Cobo Martínez Muestras obtenidas mediante procedimientos invasivos o quirúrgicos:.........................................

189

L. VázquezMourín

3

J L. de la Fuente Madero y A. M CómezÁlvarez 2. Economía sanitaria........................................ ........

MÓDULO 11

15

Técnicas generales de laboratorio

A. I. Esteban Pagola, E. E. Moreno Campoy y F J Mérida de la Torre

3. Aplicación de protocolos de seguridad y prevención de riesgos en el ámbito laboral.......

25

M. A. Cuadrado Cenzual, M. Conzález Estecha y L. Collado Yurrita

4. Aspectos básicos de calidad

37

17. Clasificación de materiales, equipos y reactivos.. A. Ledesma Vaquero

201

18. Análisis de muestras biológicas humanas F J CelIa Tomás

213

19.

221

5. Seguridad del paciente E. E. Moreno Campoy y F J Mérida de la Torre

49

6. Ética, bioética en los laboratorios clínicos

20.

de medida

del laboratorio

8.

257

F J Celia Tomás

71

22.

Pérez Santos y F J Mérida de la Torre

Calidad de la prestación del servicio o del producto................................................ ........

239

21. Control de calidad de los procedimientos

7. Identificación de la documentación

J

Aplicación de procedimientos de separación de sustancias.........................................................

E. Bellmunt Barreda

59

N BelPeña, F J Mérida de la Torre y M. J Pérez Santos

N BelPeña, M

Realización de disoluciones y diluciones..............

E. Bellmunt Barreda

R. AmigoMoreno

Realización de técnicas de microscopia

y digitalización de imágenes 81

269

A. LópezRuiz y S. Moreno Hevilla

C. Conzález Oller

9. Muestras biológicas humanas

93

M. A. Cuadrado Cenzual, M ConzálezEstecha y J A. de Pedro Moro

10. Muestras sanguíneas N BelPeña, M A. Pino Ríosy M

Biología moLecular y citogenética 105

J

MÓDULO 111

Pérez Santos

23. Caracterización de los procesos que se realizan en los laboratorios de citogenética

11. Muestras de orina C. ÁlvarezCorral

115

12. Muestras de origen digestivo C. ÁlvarezCorral

127

y biología molecular J Labrañade Miguely I. Royo Boronat

24. Realización de cultivos celulares..........................

281 291

S. Izquierdo Álvarez

xv

ERRNVPHGLFRVRUJ

índice de contenidos

41.

25. Aplicación de técnicas de análisis cromosómico

A. Repáraz Andrade

inmediatos: hidratos de carbonos

nucleicos............ ........................ ....... ..... ........... .....

319

relacionadas con el metabolismo de principios inmediatos: proteínas 335

43. Análisis de magnitudes bioqu ímicas

Aplicación de técnicas de hibridación con sonda

relacionadas con los productos finales del metabolismo......... ...........................................

353

A. Repáraz Andrade

29. Determinación de métodos de clonación y secuenciación del ADN

569

R. Mora Corcobado 365

44.

Estudio de la función hepática

587

M. C. Sánchez Pozo y R M Sánchez Martínez

I. Martín Castillo

45.

Determinación de enzimas

599

F. J Gella Tomás

MÓDULO IV

46.

Fisiopatotoqia generaL

general del organismo humano............... .............

Realización de técnicas de estudio de muestras de orina

381

47. Función digestiva. Determinaciones bioquímicas en heces....

S. Palacios Rodríguez Identificación del proceso del desarrollo de la enfermedad

611

M. R Benayas Bellido y J G. Martínez Fernández

30. Reconocimiento de la estructura y organización

31.

561

M C. Olmeda Herreros, C. GiménezLozano y R. Alonso Díaz

S. Izquierdo Álvarez

28.

551

42. Análisis de magnitudes bioquímicas

S. Izquierdo Álvarez Aplicación de técnicas de PCR y electroforesis al estudio de los ácidos nucleicos............ .............

y lípidos ..........

M. Caballero Ruíz

26. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos

27.

Análisis de magn itudes bioquímicas relacionadas con el metabolismo de principios

303

633

F. J Gella Tomás 393

48. Estudio de otros líquidos y elementos corporales

S. Palacios Rodríguez

639

L. VázquezMourín

32. Reconocimiento de los trastornos del sistema inmunitario

401

49.

A. Pérez Martínez

33. Identificación de las características de las enfermedades infecciosas

653

A. Sarnago Gonzalo, J Murado Pardo y M. C. Aguado Codina

415

R García Ruíz

Determinación de magnitudes bioquímicas relacionadas con los trastornos del equilibrio hidroelectrolítico

50. Determinación de magnitudes bioquímicas

34. Identificación del proceso de desarrollo

relacionadas con la oxigenación tisular

tumoral

431

y el equilibrio ácido-base

A. Pérez Martínez

665

A. Buño Soto y R OliverSáez

35. Reconocimiento de las manifestaciones de enfermedades

453

51.

S. Palacios Rodríguez

36. Reconocimiento de trastornos hemodiná micos y vasculares

679

F. J Mérida de la Torre, E. E. Moreno Campoy yN Bel Peña 465

D. Pérez Surribas y E. Alonso Blázquez

37. Reconocimiento de alteraciones nutricionales y del metabolismo.............. ............ .

Sistemas analíticos a la cabecera del enfermo [POCT)

52.

691

D. Alba Redondo, B. Láiz Marro y M. L. Martínez Triguero

481

O. Fuster Lluch, L. Rivera Soria y S. Collado Lápez

Caracterización de las determinaciones de las hormonas............................. .......................

53. Caracterización de las determinaciones de los marcadores tumorales

705

M. Suescun Giménez, S. MedinaJouannys y B. Láiz Marro

MÓDULO V 54.

Análisis bioquímico 38. Espectrometría y otras técnicas fisicoquímicas... J F. Izquierdo Quirce 39. Medición de pH: técnicas cuantitativas de valoración

497

55.

Conceptos generales de farmacología clínica -..............................

y aplicaciones

A. Pérez Martínez

735

J F. Izquierdo Quirce 56.

533

719

J L. Marín Soria

515

40. Técnicas de separación de moléculas.... ........ ...... S. Izquierdo Álvarez

Magnitudes bioquímicas indicadas en cribados poblacionales

Reproducción asistida de semen

e Avivar Oyonarte

XVI

ERRNVPHGLFRVRUJ

y técnicas de mejora 755

índice de contenidos

MÓDULO VI

69. Técnicas de identificación genotípica de microorganismos. Análisis epidemiológico M. J Pérez Santos y N Bel Peña

Técnicas de inmunodiagnóstico 57. Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias................ ......... A. Pérez Martínez

769

70. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana 71. Patología infecciosa humana por aparatos

antígeno -anticuerpo primarias J Ferrer Cañabate yA. Pérez Martínez

.

787

59. Detección de anticuerpos J Ferrer CañabateyA. Pérez Martínez 60. Apl icación de técnicas de estudio

.

803

.

817

de hongos y parásitos M A. Morales Alcázar

987

73. Identificación de virus

1003

J

G. Córdoba Cortijo y J M. Molina Moreno

61. Aplicación de técnicas de identificación de poblaciones celulares por citometría de flujo . L. Cordón Gallego, A. Sempere Talens y R Cuñat Estellés

MÓDULO VIII 827

Técnicas de análisis hematológico 74. Fisiología, composición y características

62. Valorac ión de la funcionalidad de la inmunidad

Apl icación de estud ios de t ipificac ión de antígeno leucocitario humano A. Lápez Ruiz

969

R García Ruíz

72. Aplicación de técnicas de identificación

de hipersensibilidad A. M. GómezÁlvarezy J L. de la Fuente Madero

63.

955

F Cobo Martínez

58. Aplicación de técnicas basadas en reacciones

celular M C. SánchezPozo y V SánchezMargalet

945

.

841

.

851

fisicoquímicas de la sangre L. G. Gómez-Cambronero Lápez, F SánchezFragoso y E. BonetEstruch

1015

75. Manejo de equipos automáticos de análisis hematológ icos......

1031

J L. Hernández Tintorer, B. Andino Castro,

M Mi r bi

J

76. Aplicación de técnicas de análisis hematológico

líni

64. Introducc ión a la bacteriología M

M L. Martínez Triguero y M. A. Molina Arrebola

VII

al estudio de la serie roja M A. Molina Arrebola .

861

Gutiérrez Fernández

• Técnica s de procesami ento de muestras bacteriológicas M T. Cabezas Fernández

hematológico al estudio de las series blanca .

877

.

1063

J A. García Bautistay M A. Molina Arrebola

78. Realización de técnicas de valoración 895

7 Aplicación de técnicas de aislamiento

• Aplicación de técnicas de identificación bacteriana M J Pérez Santos y N Bel Peña

77. Aplicación de las técnicas de análisis y plaquetaria

• Apl icación de técn icas de tinción y observación de microorganismos: preparación de medios para el cultivo de bacterias . M. J Pérez Santos y N Bel Peña

y de recuento de microorganismos M. J Pérez Santos y N Bel Peña

1043

911

de la hemostasia y la coagulación M R. Pérez Moyano

1081

79. Procedimientos para garantizar la compatibilidad sanguínea M A. Molina Arrebola y M. R. PérezMoyano

SO. Preparación de hemoderivados

1105 1125

A. SánchezCrespo .

925

índice analítico

1147

XVII

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Organización sanitaria, calidad y gestión de muestras biológicas

CapítuLo CapítuLo 2. Economía sanitaria CapítuLo 3. Aplicación de protocolo

1l,• •móWt:,;,r ..¡

CapítuLo CapítuLo 5. Seguridad del paciente CapítuLo 6. Ética, bioética en los laboratorios clínicos CapítuLo 7. Identificación de la documentación del laboratorio CapítuLo 8. Calidad de la prestación del servicio o del producto CapítuLo 9. Muestras biológicas humanas ' CapítuLo 10. Muestras sanguíneas CapítuLo 11. Muestras de orina CapítuLo 12. Muestras de origen digestivo CapítuLo 13. Estudio del líquido seminal. Seminograma CapítuLo 14. Muestras del tracto respiratorio inferior CapítuLo 15. Muestras para diagnóstico microbiológico que no pueden ser recogidas directamente por el paciente

CapítuLo 16. Muestras obtenidas mediante procedimientos invasivos o quirúrgicos

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,

Indice de contenidos •

Introd ucción

•

Bases constitucionales del Sistema Nacional de Salud

•

Concepto de sistema de salud Modelos de sistema de salud

•

El Sistema Nacional de Salud español según la Ley General de Sanidad

•

Actuaciones del Sistema Nacional de Salud

•

Competencias de las administraciones públicas en materia de sanidad

•

Organización general del sistema sanitario público

•

Ámbito subjetivo

•

Prestaciones del Sistema Nacional de Salud

•

Actividades sanitarias privadas

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INTRODUCCiÓN Los fundamentos normativos del Sistema Nacional de Salud se encuentran en la vigente Constitución española de 1978. Puesto que la Constitución estructura la forma de organización política y regula la convivencia entre los españoles, son muchos los preceptos de ésta que determinan la regulación legal de los aspectos sanitarios, del mismo modo que en todos los demás ámbitos. En este primer capítulo se abordarán aquellos artículos de la Constitución que de forma más directa condicionan la estructura, organización y funcionamiento del Sistema Nacional de Salud español. Se analizarán las características de éste tal y como está configurado por la normativa legal o reglamentaria que, a lo largo de las décadas transcurridas desde la promulgación de la Constitución, han buscado desarrollar y dar cumplimiento a los mandatos en ella establecidos.

• • • • •

Sistema Nacional de Salud Organización sanitaria Niveles asistenciales Prestaciones Aseguramiento

BASES CONSTITUCIONALES DEL SISTEMA NACIONAL DE SALUD Comienza el primer artículo de la Constitución española de 1978 aseverando que España se constituye en un Estado social y democrático de Derecho, que propugna como valores superiores de su ordenamiento jurídico la libertad, la justicia, la igualdad y el pluralismo político. El análisis de la forma política del Estado español como un Estado social y democrático de Derecho permitirá presentar las raíces en las que se asienta la estructura del Sistema Nacional de Salud. Un Estado democrático es aquel cuya forma de organización permite que las decisiones colectivas sean adoptadas por el pueblo, a través de mecanismos de participación directa o indirecta (mediante representación, hablándose en tal caso de democracia representativa) que confieren legitimidad a sus representantes. En España, los representantes elegidos por el pueblo constituyen el poder legislativo, el cual, a su vez, mediante la investidura de un Presidente del Gobierno, determina la elección del máximo responsable del poder ejecutivo. La definición de Estado de Derecho hace referencia a la forma de gobierno en la que el poder ha de ejercerse con arreglo a los principios, procedimientos y limitaciones contenidos en la ley. Es una forma de gobierno en la que, en el supuesto de que se produzca una infracción del ordenamiento jurídico, todo ciudadano tiene derecho a obtener la correspondiente sat isfacción de cualquier otro ciudadano, por muy elevado que sea el cargo que ocupe, así como de la administración pública. Los rasgos que definen un Estado de Derecho incluyen , con carácter general, la separación de poderes (legislativo, ejecutivo y judicial) como garantía de freno a posibles abusos y la primacía de la ley, con vigencia del principio de legalidad, que im plica que toda actuación de la Administración y los Tribunales debe ajustarse al marco de actuación que la ley establece. En este sentido, las leyes se erigen en las reglas de 3

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En un Estado sociaL, los poderes públicos se implican para satisfacer determinadas necesidades de los ciudadanos.

La Constitución , a la cual se subordina toda la normativa jurídica, establece para los poderes públicos la obligación de velar por la salud de la población.

juego que todos los miembros de la sociedad aceptan y cumplen, independientemente de su posición en la jerarquía social. El propio ejercicio del poder público está sometido a los dictámenes de la ley y la discrecionalidad personal de quienes encar nan o representan a los poderes públicos queda encorsetada por las directrices marcadas por la ley. En el Estado de Derecho es relevante, también, la estructura del sistema normativo como una jerarquía en la que las distintas normas se someten a la supre macía de la Constitución y, por debajo de ésta, a las leyes como expresión de la volun tad general. Finalmente, el Estado social es un Estado que se propone como objetivo fortale cer los servicios y garantizar los derechos considerados esenciales, para mantener el nivel de vida necesario y participar plenamente como miembro en la sociedad. Ello supone el ejercicio de políticas activas encaminadas a corregir las desigualdades en la renta o las oportunidades, a superar las diferencias sociales y a proporcionar a la comunidad los servicios considerados imprescindibles. En general, se atribuye a los Estados sociales la legitimidad de intervención, como Estado, en la economía, para garantizar un modelo de crecimiento adecuado, que se manifestará en la provisión pú blica de una serie de prestaciones sociales, incluyendo transferencias para resolver necesidades básicas de los ciudadanos (educativas, sanitarias, de vivienda, etc.); y, como consecuencia de su legítima intervención, se acepta una responsabilidad exigible del Estado, que debe garantizar el mantenimiento de un nivel mínimo de vida, entendido como un derecho social. Para garantizar ese derecho, la Constitución española, en su Artículo 43, hace referencia expresa a la salud al reconocer, textualmente, «el derecho a la protección de la salud». Obviamente, ese enunciado resulta muy amplio y está sujeto a interpretaciones, por lo que, en el mismo artículo y justo a continuación, concreta un poco más sus pretensiones al respecto: «Compete a los poderes públicos organizar y tutelar la salud pública a través de medidas preventivas y de las prestaciones y servicios necesarios. La ley establecerá los derechos y deberes de todos al respecto». El concepto de poderes públicos es amplio y comprende, según la Sentencia del Tribunal Constitucional 35 /1983, de 11 de mayo, «todos aquellos entes (y sus órganos) que ejercen un poder de imperio derivado de la soberanía del Estado y procedente, en consecuencia, a través de una mediación más o menos larga, del propio pueblo».

CONCEPTO DE SISTEMA DE SALUD Un sistema de salud es la suma de todas las organizaciones, instituciones y recur sos (personales, materiales y económicos) organizados con el objetivo principal de pro teger o mejorar la salud. Como puede deducirse de esta definición, se trata de una estructura tremendamente compleja. La Organización Mundial de la Salud (O M S), en una definición intencionadamente amplia, lo describió como el conjunto de elementos interrelacionados que contribuyen a la salud en los hogares, los lugares de trabajo, los lugares públicos y las comunidades, así como en el medio ambiente físico y psicosocial y en el sector de la salud y otros sectores afines. Esta última consideración lleva a concluir que los sistemas sanitarios son sistemas dinámicos, abiertos e interrelacionados con factores determinantes de otros sistemas (político, económico, educativo, cultural, etc.). Un sistema de salud necesita personal, financiación, información, suministros, transportes y comunicaciones, así como una orientación y una dirección generales. Además, tiene que proporcionar buenos tratamientos y servicios que respondan a las necesidades de la población y que sean justos, asumibles desde el punto de vista finan ciero y aceptados, en general, por los ciudadanos. El principal responsable del desempeño global de tareas del sistema de salud en un país es el Gobierno, pero deben implicarse otros poderes públicos, así como instituciones privadas que guardan relación con la salud de la población y tienen un papel en su desarrollo y mantenimiento. 4

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MODELOS DE SISTEMA DE SALUD Existen diferentes modelos de sistemas de salud, que pueden concretarse, de modo general y con ánimo didáctico, en los tres siguientes: • Modelo de seguros sociales. • Modelo de Sistema.Nacional de Salud. • Modelo de libre mercado.

Modelo de seguros sociales El modelo de seguros sociales parte de la cons ideración de la salud como un bien que debe ser tutelado por los poderes públicos. La financiación de los servicios sanitarios se lleva a cabo mediante cuotas obligatorias que satisfacen trabajadores y empresarios (calculadas, en general, proporcionalmente al salario o a los beneficios estimados), con mayor o menor colaboración del Estado. Los servicios financiados de este modo suelen estar destinados a quienes han coti zado y a quienes dependen de ellos: los cotizantes generan, mediante su aportación al sistema, el derecho a la asistencia sanitaria, para sí mismos y para sus familiares o beneficiarios. Esta forma de organizar los servicios del sistema conlleva que una parte importante de la población no quede cubierta por éstos, por lo que es habitual la coexistencia de seguros voluntarios complementarios y la asistencia que proporcionan las redes de beneficencia.

¿Qué diferencias principales existen entre los tres modelos del sistema de salud? ¿En qué se parecen?

Modelo de Sistema Nacional de Salud Este modelo parte, igualmente, de la consideración de la salud como un bien que debe ser tutelado por el Estado. En este caso, la financiación de los servicios sanitarios se obtiene de fondos procedentes de los impuestos, con aportaciones complementarias variables de los sistemas de seguros sociales. Puesto que el coste de la provisión de los servicios sanitarios recae de modo directo sobre las arcas del Estado, es consustancial a este sistema la exigencia de un control gubernamental detallado de todo el proceso de financiación y de provisión de los servicios sanitarios. De igual modo, puesto que todos los ciudadanos están sujetos al pago de impuestos, la universalidad y la equidad son principios esenciales de la organización del sistema. Sin embargo, como consecuencia de lo anterior, este sistema debe soportar y enfrentarse a problemas frecuentes de burocracia administrativa, sobreutilización de los servicios y listas de espera en atención médica especializada.

Modelo de libre mercado El tercer modelo tiene un fundamento ideológico radicalmente diferente al de los anteriores: parte de la consideración de la salud como un bien de consumo, no nece sariamente protegido por los poderes públicos. Cada ciudadano o grupo de población se responsabiliza de su propia salud, en función de sus recursos y sus prioridades (en lo cual, obviamente, influyen con gran peso factores de muy diverso tipo que condicionan la accesibilidad a los servicios y prestaciones, que comprenden desde aspectos educacionales y culturales hasta factores económicos). En ese escenario, la contribución estatal al mantenimiento de los servicios sanitarios es más reducida y se ve limitada a proteger a grupos vulnerables o desfavorecidos. Ello conlleva una cierta desregulación por parte del Estado de la provisión de servicios sanitarios y en ocasiones su intervención se reduce a garantizar la habilitación de profesionales o establecimientos para el ejercicio de actividades mediante la expedición de títulos o licencias.

5

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En España, el modelo actual de sistema de salud es el modelo de Sistema Nacional de Salud, desarrollado por la Ley General de Sanidad.

Como se explica en el modelo de seguros sociales, con mucha más importancia en este caso, se hace necesaria la coexistencia de redes de beneficencia y seguros voluntarios privados. Se ha estimado que los costes que conlleva este modelo, en relación con el producto interior bruto de un país, son significativamente más elevados que los de países en los que existe un modelo de Sistema Nacional de Salud. De forma evidente, los principales inconvenientes de este sistema son las grandes diferencias de equidad y de accesibilidad que resultan. En España, a lo largo del siglo XX se sucedieron los tres modelos: en las primeras décadas del siglo regía un modelo de libre mercado; mediante la Ley de 1942, se constituyó el Seguro Obligatorio de Enfermedad, bajo el llamado (y actualmente extinto) Instituto Nacional de Previsión, con el que se implantó un modelo de seguros sociales, el cual se mantuvo hasta 1986, en que, finalmente, con la Ley 14/1986 se sentaron las bases del actual Sistema Nacional de Salud.

ELSISTEMA NACIONAL DE SALUD ESPAÑOL SEGÚN LA LEY GENERAL DE SANIDAD El Sistema Nacional de Salud que diseñó la mencionada Ley General de Sanidad no podía nacer ajeno a la realidad social del momento ni a los mandatos que la propia Constitución establecía. La realidad aportaba un sistema sanitario, como se ha dicho, basado en el modelo de seguros sociales, que incluía evidentes bolsas de ineficiencia, derivadas, entre otras cuestiones, de la coincidencia de una multiplicidad de organismos e instituciones con competencias sanitarias, con la consiguiente falta de coordinación, así como el distanciamiento de los programas y la falta de coordinación entre los cuidados personales de salud y las actividades preventivas y de higiene del medio. Los mandatos constitucionales habían configurado, como novedad ineludible y originalísima, el Estado de las Autonomías, en el que los territorios provinciales integrados ahora en comunidades autónomas se dotaban de poder legislativo y ejecutivo propio, llamados, como se verá, a desempeñar un papel esencial en la configuración y desarrollo del Sistema Nacional de Salud. La Ley General de Sanidad se planteaba como objetivo la regulación general de to das las acciones que permitieran hacer efectivo el derecho a la protección de la salud reconocido en el Artículo 43 y concordantes de la Constitución española de 1978. Siguiendo el modelo de sistema de salud óptimo propuesto por la OMS, el español se planteaba, en su nacimiento, como principios generales, la orientación prioritaria de los recursos y las actividades del sistema hacia la promoción de la salud y la prevención de las enfermedades, la extensión de la asistencia sanitaria pública a todos los ciudadanos, el acceso a las prestaciones en condiciones de igualdad, superando desequilibrios territoriales y sociales, la articulación de la participación comunitaria en la formulación de la política sanitaria y en el control de su ejecución, la búsqueda de la eficacia, la eficiencia y la flexibilidad, y el reconocimiento de los derechos de los ciudadanos en el ámbito de la Administración sanitaria. Respecto a esto último, cabe destacar que la Ley General de Sanidad, a pesar de que fijaba básicamente su atención en el establecimiento y ordenación del sistema sanitario desde un punto de vista organizativo, dedicaba a los derechos de los ciudadanos respecto a la Administración sanitaria diversas previsiones, entre las que incluía la voluntad de humanización de los servicios sanitarios. Así, preconizaba el máximo respeto a la dignidad de la persona y a la libertad individual, de un lado y, del otro, declaraba que la organización sanitaria debía permitir garantizar la salud como un derecho inalienable de la población mediante la estructura del Sistema Nacional de Salud, que debería asegurarse en 'condiciones de escrupuloso respeto a la intimidad personal y a la libertad individual del usuario, garantizando la confidencialidad de la información relacionada con los servicios sanitarios prestados y sin ningún tipo de discriminación. Tales aspectos fueron desarrollados 16 años más tarde en la Ley 41 /2002, de 14 de no viembre, básica reguladora de la autonomía del paciente y de derechos y obligaciones 6

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~:,~:':!7:~~~;': 50

.... Fi gura 13-13 . Es quem a de observa ción de espermatozoide con anticuerpos de superficie con balas de látex adosadas.

%

OM51999 4 a ed.

OM51992

OM51987

OM52010 sa ed.

RTE

> 20

> 20

> 20

15 [12-16)

NTE

40

40

40

39 [ 33-46 )

Movilidad (%)

> 50 a + b > 25 a

> 50 a + b > 25 a

> 50 a + b > 25 a

PR + NP [a + b + el 40 [38-42) PR [a + bl: 32 [31-44)

FN (%)

> 50

> 30

> 15 VP

4 [3-4) VP

> 50

> 50

> 70

58 [55-63 )

1

2,4

> 2,4

> 2,4

MAR-test (%)

LI R

Normozoospermia

Recuento, movilidad y movilidad dentro del LI R

Oligoastenozoospermia

O/o PR Y recuento

oli goaste notea tozo os pe rm ia

CONC, PR; MOR < L1R

Oligozoospermia

CON < LIR

Teratozoos pe rm ia

MORF < LIR

< LI R

CONC: concentración; L1R: límite inferior de referencia; MORF: morfología; PR: movilidad progresiva.

No debo olvidar que... •

Existen diferentes métodos para el análisis de semen y se recomienda seguir las indicaciones de la Organización Mundial de la Salud [OMS) que se incl uyen en el manual de la 5a edición de 2010, actualmente en vigor.

•

Los valores de referencia, en este caso el límite inferior de referencia, son sólo indicativos de la capacidad fertilizante de un individuo y no para catalogar a una persona como fértil o infértil; para esta cuestión se utilizarán los datos de la última edición del manual de la OMS.

•

Es importante conocer bien la morfología del espermatozoide para entender la técnica de reproducción asistida .

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Caso práctico

Preguntasde repaso 1. En Las normas de recogidade La muestra se estipuLa un período de abstinencia sexuaL de: a. b. c. d.

2-7 días. 4 semanas. No es necesaria la abstinencia sexual. Todo lo anterior es falso.

2. Los caracteres físicos de La muestra de semen que se estudian son: a. Sólo se mide el pH. b. Aspecto. pH y licuefacción. c. Sólo se mide la viscosidad. d. Aspecto, licuefacción, viscosidad. vol umen y pH.

Un paciente de 32 años entrega a las 8:3 0 horas una muestra de sem en para su análisis. El paciente refiere haber tomado la muestra en su casa a las 8:00 horas. haber depo sitado todo el conten ido en e l envase de boca ancha previamente suministrado por ellaboratorio, tras cumplir 10 días de abstinencia sexual y asegura que no ha tenido fiebre en el últ imo mes. La muestra de semen tiene un volumen total de 1.2 mL. ¿Se cumplen las normas de calidad preanalít ica según los datos que se aportan? ¿Qué pasos se seguirían para hacer el recuento? ¿Cuál es la dilución adecuada para esta muestra y qué cantidades se emplean para realizarla? ¿Qué resultados se obtienen?

BIBLIOGRAFíA Avivar C, Durán 1, Olea N, Fernández M , Castilla ]A . Estudio de la calidad seminal en población joven del sureste español. An Clin. 2004;29(4):81-92. Bjorndahl L, Soderlund 1, Kvist U . Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique of human sperm vitality assessment. Human Reproduction. 2003; 18:813-6. Cardona-Maya W, Berdugo], Cadavid A. Comparing the sperm concentration determined by the makler and the Neubauer chambers . Grupo Reproducción. Universidad de Antioquia. Medellín (Colombia). Actas Urol Esp. 2008;32(4):443-5. Castilla ]A, Álvarez C, Aguilar ], González-Varea C, Gonzalo MC, Martínez L. Iníiuence of analytical and biological variation on the clinical interpretation of seminal parameters. Human Reproduction. 2006;21 :847 -5I. ESHRE. Guidelines on the application of CASA technology in the analysis of spermatozoa. Human Reproduction. 1998;13:142-5. ]0rgensen N, Andersen AG, Eustache F, Irvine DS, Suominen], Petersen ]H, et al. Regional differences in semen quality in Europe. Human Reproduction. 2001;16:1012-19. World Health Organization WHO. Laboratory for th e examination and processing of human semen. 5th ed. 2010.

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,

Indice de contenidos • Introd ucción • Características generales de las muestras del tracto respiratorio inferior • Recuer do de anatomía y fisiología del aparato respiratorio • Obte nción de una muestra del tracto respiratorio inferior para análisis microbiológico • Preve nción de errores más comunes en la manipulación de una muestra del tracto respiratorio inferior por parte del paciente y el técnico • Susta ncias o elementos formes analiza bles en una muestra del tracto respiratorio inferior

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INTRODUCCiÓN Uno de los trastornos con mayor incidencia sobre la población son las infecciones respiratorias. Se adquieren tanto en el entorno social como en el medio hospitalario o nosocomial. Se pueden presentar de forma aguda o crónica y ser más o menos graves, por lo que se han de tratar oportuna y adecuadamente, ya que sus complicaciones pueden ser fatales. Son pautas imprescindibles para el cuidado de la salud acudir al médico ante cualquier síntoma respiratorio, seguir el tratamiento indicado por completo y abstenerse del contacto físico con otras personas para evitar el contagio. Algunas de estas enfermedades destacan por una prevalencia creciente en los países desarrollados, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Según la Organización Mundial de la Salud , el virus respiratorio sincitial y el virus tipo 3 de la parainfluenza son las causas principales de infecciones respiratorias agudas en la infancia y la niñez temprana, en particular del 20-25% de los casos de neumonía y del 45 -50% de bronquiolitis en niños hospitalizados. Aunque los procesos infecciosos de las vías respiratorias altas son los que más absentismo escolar y laboral originan, los síntomas remiten a los pocos días de su tratamiento. Sin embargo, las infecciones del tracto respiratorio inferior (TRI) provocan más hospitalizaciones y presentan mayores tasas de morbilidad y mortalidad. Por lo tanto, para un diagnóstico certero de las infecciones del TRI hace falta la labor conjunta de un equipo experimentado y multidisciplinar de trabajo formado por médicos, especialistas, personal de enfermería y técnicos de laboratorio, pues los síntomas de las distintas infecciones son similares y confundir una patología por otra podría significar una prolongada enfermedad y graves complicaciones.

• • • • •

Tracto respiratorio inferior Infecciones respiratorias Tipos de muestras Manipulación de las muestras Prevención de errores

CARACTERíSTICAS GENERALES DE LAS MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR Las muestras procedentes del TRI que se recogen para el estudio microbiológico son muy diversas y se pueden obtener mediante procedimientos no invasivos o invasivos. Las infecciones del TRI reciben su nombre según la localización. Pueden afectar a la tráquea y al árbol bronquial: traqueítis, bronquitis, bronquiolitis; o al tejido pulmonar: neumonía, alveolitis. Para el diagnóstico de las infecciones del TRI, en determinadas circunstancias también pueden emplearse muestras del tracto respiratorio superior, como exudados faríngeos y nasofaríngeos, que son útiles para la detección de microorganismos patógenos específicos (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemolítico del grupo viridans, ctc.). También se puede emplear sangre u orina para el cultivo y la detección de antígenos de algunos agentes infecciosos, como por ejemplo Legionella pneumophila sero-

Las muestras procedentes del TRI se pueden obtener mediante procedimientos no inva-

sivos o invasivos.

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[J tipo 1 (legionelosis), la causa principal de muchas neumonías adquiridas en la comunidad (NAC) en lugares como piscinas, duchas comunitarias o espacios con aire acondicionado. En determinadas situaciones, cuando no se consigue aislar el microorganismo en las muestras clínicas, la serología resulta de ayuda en el diagnóstico, con la salvedad de los casos de pacientes inmunodeprimidos, en que la respuesta serológica puede no llegar a producirse. En la actualidad es posible detectar en el suero de pacientes con aspergilosis sistémica (Aspergillus) el antígeno galactomanano, componente soluble mayoritario de la pared del hongo. Esta determinación antigénica tiene una alta especificidad y una sensibilidad cerca del 94 0/0. En la práctica hospitalaria también se pueden utilizar técnicas de aglutinación en muestras de líquido cefalorraquídeo para la detección de Haemophilus influenzae, S. pneumoniae o Neisseria meningitidis, entre otros microorganismos. Sin embargo, los métodos de detección de anticuerpos y de antígenos, así como los de amplificación genética, no se consideran métodos de referencia porque, a pesar de ser muy sensibles y específicos, tienen un alto coste. Por esta razón se reservan para el diagnóstico de agentes muy infecciosos, como L. pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae y otros virus respiratorios.

Muestras obtenidas por procedimientos no invasivos

Mediante procedimientos no invasivos se obtienen gran variedad de muestras.

Se obtienen gran variedad de muestras mediante procedimientos no invasivos, entre los que se incluyen: • Frotis faríngeo: la muestra se toma de la pared posterior de la garganta para la detección de las bacterias M. pneumoniae o Chlamydophila pneumoniae. Ambas causan neumonía atípica. • Frotis nasofaríngeo: se recoge con un escobillón de alambre flexible y curvado con punta de alginato cálcico o dacrón. Es útil para identificar virus respiratorios como la gripe A (HiNi) y bacterias específicas como N meningitidis o Staphylococcus

aureus. • Lavado nasofaríngeo: se obtiene por instilación de una solución salina y está indicado en pacientes pediátricos para la detección de Bordetella pertussis, agente causante de la tos ferina, una bacteria altamente infecciosa que se aloja en el sistema respiratorio humano (alvéolos pulmonares) y causa necrosis. • Esputo expectorado espontáneamente y esputo inducido: este último, estimulado con un nebulizador ultrasónico por inhalación de cloruro de sodio al 3 0/0, se indica en la detección de Pneumocystis jiroveciy Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch). • Aspirado traqueal o broncoaspirado: se consigue por absorción a través del tubo endotraqueal y se utiliza, por ejemplo, para el diagnóstico de la neumonía intrahospitalaria. No se deben confundir estas secreciones con las de broncoaspirado selectivo (BAS), que se obtienen mediante procedimientos invasivos, por fibrobroncoscopia o sin broncoscopia, con técnicas ciegas que aspiran la muestra a través de un catéter que se sitúa en un bronquio distal. • Hemocultivos o cultivos de orina: son útiles para la detección de antígenos microbianos, así como las muestras de suero son valiosas para distinguir la fase aguda de la de convalecencia.

Muestras obtenidas por procedimientos invasivos La técnica fibrobroncoscópica está indicada en el diagnóstico de la neumonía asociada a ventilación mecánica (NAV), la cual tiene gran incidencia en pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos, en la neumonía del paciente inmunodeprimido y en situaciones en las que no se obtiene respuesta al tratamiento o se sospecha otro diagnóstico no infeccioso. 160

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La fibrobroncoscopia permite obtener muestras del TRI sin microbiota procedente de la orofaringe o, al menos, con la menor contaminación posible, directamente de la vía aérea o del segmento pulmonar radiológicamente afectado. La extracción invasiva de las muestras más frecuente se realiza mediante distintas técnicas:

• Broncoaspirado selectivo: la muestra procede de las secreciones del árbol bronquial y no es representativa del territorio alveolar o bronquiolar. Su valor diagnóstico es similar al del esputo y sólo se indica cuando el volumen de líquido recuperado en el lavado broncoalveolar es insuficiente y existe la sospecha de una infección fúngica pulmonar por microorganismos primarios. • Lavado broncoalveolar (LBA): es una técnica esencial en el aislamiento de agentes oportunistas en pacientes inmunodeprimidos, así como en el estudio de la enfermedad pulmonar intersticial difusa en pacientes no inmunodeprimidos con sospecha clínica razonable, una vez se han descartado otros diagnósticos mediante datos radiológicos y estudio funcional completo. Para realizar la toma de la muestra, el fibrobroncoscopio debe enclavarse en el árbol bronquial e instilar unos 120 mL de solución salina que posteriormente será recuperada (10-100 mL). La muestra representa las secreciones presentes en aproximadamente un millón de alvéolos y sus correspondientes bronquíolos. Constituye una de las pruebas más rentables para el diagnóstico de la aspergilosis pulmonar. También se conoce como BAL por sus siglas en inglés (bronchoalveolar lavage). • Cepillado bronquial mediante catéter telescopado protegido (CTP): su única indicación es el diagnóstico de la neumonía bacteriana y se emplea para obtener muestras del foco de infección evitando la con taminación orofaríngea. Para la toma de la muestra se procede de igual manera que en el LBA, pero la introducción del broncoscopio se hace a través de la luz de un catéter con un globo final, que previamente se ha introducido e inflado con el fin de proteger la muestra de una posible contaminación por flora de las vías altas. Es de gran valor diagnóstico en las neumonías bacterianas, especialmente en pacientes sometidos a ventilación mecánica.

Los procedimientos invasivos obtienen las muestras del TRI mediante fibrobroncoscopia .

¿Qué valor diagnóstico aporta la muestra obtenida por el broncoaspirado selectivo respecto al esputo?

En menor proporción también se emplean otras técnicas invasivas de extracción de muestras:

• Lavado bronquial: equivale a un aspirado endotraqueal. La muestra obtenida no es representativa de material bronquiolar ni alveolar y con frecuencia está contaminada con flora orofaríngea, que proporciona información confusa. • Biopsia transbronquial (BTB): en algunos casos, como neoplasias o pacientes trasplantados de pulmón, la indicación general de la BTB o biopsia pulmonar broncoscópica es muy útil, ya que su sensibilidad diagnóstica es del 75-95 % y su especificidad fluctúa entre el 90 y 100°10. La BTB es capaz de facilitar la búsqueda de infiltrados pulmonares localizados o con patrón difuso y lesiones con patrón intersticial, reticular, miliar o alveolar, tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunosuprimidos; está indicada siempre que no sea posible el diagnóstico por otros métodos menos invasivos. El riesgo de esta técnica en pacientes conectados a ventilación mecánica es elevado. Las técnicas ciegas son más económicas y de menor riesgo que las broncoscópicas y pueden emplearse para la obtención de muestras del TRI en los pacientes intubados con cánulas de pequeño calibre. Incluyen:

Existen otras variantes para la toma de muestras menos invasivas [no requieren fibrobronco sccpial , como las técnicas

• Aspirado bronquial ciego: consiste en enclavar el catéter en un bronquio distal y aspirar 1-2 mL de secreciones bronquiales sin instilar suero u otra solución estéril. • Minilavado broncoalveolar (mini-BAL): técnica relativamente nueva que se ha desarrollado para establecer el diagnóstico de NAV y guiar el tratamiento con la administración de antibióticos.

ciegas.

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• Catéter telescopado no broncoscópico: la mayor parte de los estudios emplean un catéter telescopado estándar, aunque también se ha usado un dispositivo especial con un balón en su extremo distal para evitar la contaminación proximal. La principal limitación de las técnicas ciegas es la imposibilidad de seleccionar radiológicamente el segmento pulmonar afectado. Este hecho es especialmente importante cuando los infiltrados se localizan en los lóbulos superiores o en el pulmón izquierdo. Otras técnicas invasivas son:

• Aspiración transtraqueal: se usa para detectar neumonía por anaerobios y se recoge la muestra tras anestesiar la piel de la garganta, con la introducción en la tráquea de una aguja que aspira las secreciones a través de un catéter. • Biopsia por punción transtorácica: principalmente se indica en lesiones periféricas, como el nódulo pulmonar, que no es accesible mediante otras técnicas diagnósticas como la broncoscopia. • Biopsia a pulmón abierto: se obtiene por minitoracotomía para el estudio histológico del parénquima pulmonar. • Punción pleural: en caso de derrame pleural, esta muestra es representativa dellíquido que se encuentra en el espacio entre el revestimiento externo de los pulmones (pleura) y la pared torácica; se obtiene por toracocentesis. La pleura rodea ambos pulmones; la parte más interna se denomina pleura visceral y la más externa pleura parietal. Entre ambas se encuentra el líquido pleural, que evita el roce de los pulmones con la pared interna de la cavidad torácica durante los movimientos respiratorios.

#8 RECUERDO DE ANATOMíA Y FISIOLOGíA DEL APARATO RESPIRATORIO Cada proceso de respi ración se compone de una absorción de oxígeno o inspiración y una espiración que expulsa el dióxido de carbono.

Las células animales obtienen la energía por la degradación oxidativa de las sustancias nutritivas y, por lo tanto, necesitan el aporte de oxígeno y la eliminación continua de los productos de desecho del metabolismo (dióxido de carbono, ácido láctico, ácido úrico, etc.) para su funcionamiento. La inspiración consiste en crear una presión negativa intrapulmonar con respecto a la presión atmosférica aumentando el volumen pulmonar, lo que provoca que el aire entre. La espiración es el proceso contrario: los músculos inspiratorios se relajan y el pulmón, que es un órgano retráctil, vuelve a su estado original, por lo que disminuye el volumen intrapulmonar, aumenta la presión interna por encima de la atmosférica y el aire sale hacia el exterior. Sin embargo, la presión intratorácica (fuera del pulmón, pero dentro del tórax) siempre permanece negativa, porque de no ser así se detendría el retorno venoso. La función del aparato respiratorio es distribuir el aire atmosférico y facilitar el intercambio de gases, permitiendo a las células el abastecimiento de oxígeno y la eliminación del dióxido de carbono. Esta actividad se desempeña conjuntamente con el sistema circulatorio. Al inspirar, el aire entra por las fosas nasales y encuentra la primera barrera de defensa contra los gérmenes, el moco. A continuación, el aire pasa por la faringe, la cual posee una estructura de tejido linfoide llamada anillo de Waldeyer, que protege de la invasión de los gérmenes a las vías digestiva y respiratoria. Seguidamente, continúa su recorrido a través de la laringe y la tráquea. Las mucosas que recubren la tráquea y los bronquios poseen unas pestañas que se mantienen en continuo movimiento para retener las partículas de polvo y otros cuerpos extraños y los retorna a la laringe. El árbol bronquial conduce al aire hacia los alvéolos pulmonares, donde se efectúa el intercambio gaseoso entre la sangre y el aire exterior. En los alvéolos se encuentran los

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macrófagos alveolares, que son células con capac idad fagocitaria que provienen de los monocitos de la sangre, que pueden autorreplicarse en el revestimiento alveolar del pulmón sano y mantienen la esterilidad de las vías respiratorias inferiores. De esta manera, la sangre distribuye el oxígeno a todos los tejidos y células del organismo. Finalmente, el dióxido de carbono en la sangre se elimina por los pulmones y se expulsa durante la espiración. Para realizar el intercambio de gases, que el oxígeno llegue a la sangre y el dióxido de carbono se elimine de ella, son necesarios tres procesos:

El intercambio de oxígeno y dióxido de carbono que se produce en la sangre se denomina

hematosis.

• Ventilación: constituye todo el proceso de entrada y salida de aire. Su frecuencia normal es de unas 12-16 respiraciones por mi nuto. • Perfusión: comprende la circulación sanguínea a través de los capilares pulmonares. • Difusión: resulta del intercambio gaseoso entre el aire de los alvéolos y los capilares pulmonares (Fig. 14-1). Las estructuras del aparato respiratorio se dividen en dos grupos: vías de conducción y vías respiratorias. Las primeras canalizan el aire, lo calientan, purifican y humedecen; las segundas permiten la difusión de gases.

• Vías de conducción: son las fosas nasales, la faringe, la laringe, la tráquea y el árbol bronquial (bronquios lobulares, bronquios segmentarios y bronquíolos). • Vías respiratorias: comprenden los bronquíolos terminales y los sacos alveolares. Estos últimos están formados por alvéolos en íntimo contacto con los capilares pulmonares procedentes de la arteria pulmonar y componen la membrana alveolocapilar, a través de la cual se produce el intercambio de gases entre la sangre y los alvéolos. Por lo tanto, la unidad funcional del pulmón es el alvéolo, el cual contiene aire en su interior, más el capilar, que contiene la sangre. Este entramado se organiza en una «arquitectura» que se denomina intersticio pulmonar.

• Sistema mucociliar: está formado por el epitelio ciliar, que reviste la vía aérea desde la nariz hasta los bronquíolos y por una delgada capa de moco que recubre los cilios, capa que secretan las células calciformes y las células submucosas. Los cilios transportan el moco hacia la laringe para su deglución, exhalación o expectoración, por lo que este sistema proporciona un método mecánico para eliminar los microorganismos inhalados. • Sistema macrofagoalveolar: los macrófagos alveolares migran entre los neumocitos tipo 1 de la superficie alveolar y penetran en la luz del alvéolo. Estas células fagocíticas engullen el material en partículas, como polvo y bacterias, y conservan el espacio pulmonar estéril.

.--

Tejidos A

_

Capilar sanguíneo .___- -- - -A- --

-

Con la respiración se inhalan elevadas cantidades de microorganismos viables; no obstante, las vías respiratorias inferiores [por debajo de la epiglotis) son estériles en condiciones normales. Esto se debe a dos 'm ecanismos: el sistema mucociliar y el

sistema macrofagoaLveoLar.

Pulmones -

-

_

..__------A-- -_____

Alvéolos pulmonares

Figura 14-1. Intercambio gaseoso. CO 2 : dióxido de carbono; Hb: hemoglobina; Hb0 2 : hemoglobina conjugada; 02: oxígeno.

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OBTENCiÓN DE UNA MUESTRA DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO Cualquiera que sea la técnica utilizada, las muestras deben obtenerse antes de la instauración de una antibioterapia empírica, de lo contrario los resultados son difíciles de in terp retar. Es esencial realizar un examen microscópico y un cultivo de las secreciones respiratorias para el tratamiento de las infecciones del TRI, por lo que se hace imprescindible la obtención de muestras adecuadas y de calidad. Por lo tanto, excepto si la muestra se obtiene mediante una técnica invasiva (punción transtraqueal, broncoscopia), las secreciones del TRI se contaminarán por la microbiota del tracto respiratorio superior. Según la procedencia de la muestra, se destacan sus diferentes particularidades.

Esputo

El esputo se obtiene mediante un golpe de tos o con la expectoración.

Estas secreciones traqueobronquiales se eliminan al exterior mediante un golpe de tos o con la expectoración. Son una mezcla inconstante de agua, electrólitos y mucina (moco que segregan las células calciformes). A medida que estas secreciones atraviesan las vías respiratorias se les unen células de descamación de la mucosa del aparato respiratorio, secreciones nasales, de las glándulas salivales y la flora bacteriana habitual de la cavidad bucal, así como restos de alimentos. Por lo tanto, es necesario tomar una serie de precauciones: • El paciente debe lavarse la boca, cepillarse los dientes y enjuagarse con agua o suero estéril inmediatamente antes de recoger la muestra, para disminuir el número de bacterias contaminantes de la orofaringe. • La muestra más conveniente es la que se obtiene con la tos profunda a primera hora de la mañana (para recoger todo el conjunto de las secreciones nocturnas, en las cuales están más concentrados los microorganismos patógenos responsables de las infecciones). • El esputo debe recogerse directamente en un recipiente estéril, desechable, de boca ancha y con tapón de rosca. • Transportar la muestra de esputo al laboratorio rápidamente o refrigerarla (en la nevera) si se va a demorar el transporte más de 2 horas. Hay que tener en cuenta que previamente se aconseja no guardarla ni refrigerarla, puesto que se produce citólisis muy rápidamente. • Si la producción de esputo es escasa o el paciente no expectora espontáneamente, se inducirá la expectoración con nebulizaciones de solución salina (esputo inducido).

Aspiración endotraqueal o por traqueostomía Con esta técnica se aspiran las secreciones a través del tubo endotraqueal o por traqueotomía, con el fin de mantener las vías aéreas permeables en pacientes intubados o traqueostomizados. Se debe tener en cuenta que:

¿Qué consejos hay que darle al paciente para la obtención de una muestra ad ecuada de esputo?

• El catéter atraviesa zonas densamente colonizadas, lo que dificulta la interpretación del cultivo. • La muestra se recoge directamente en un recipiente estéril, desechable, de boca ancha y con tapón de rosca. • Transportar al laboratorio rápidamente y no refrigerar. • Cualquier microorganismo aislado a partir de esta muestra se considera un potencial agente causal de neumonía.

Broncoscopia (lavado bronquial y lavado bronquioalveolarJ La muestra de elección es el LBA si el cultivo de esputo no ha conseguido resulta dos de valor clínico y diagnóstico, ya que el análisis cuantitativo es más relevante que las muestras de esputo. Se debe tener en cuenta que:

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Para la recogida de la muestra se introduce una cantidad suficiente de solución salina estéril de forma que bañe el interior de los bronquíolos terminales y los alvéolos. A continuación se recoge esta solución directamente en un recipiente estéril, desechable, de boca ancha y con tapón de rosca; después se procederá al cultivo. e Transportar la muestra al laboratorio rápidamente y no refrigerar. e Si se trata de una muestra de cepillado bronquial, se sumerge en 1 mL de solución de Ringer lactato. Si la muestra que se recoge con el broncoscopio procede de una biopsia transbronquial, para el cultivo de hongos o micobacterias se envasa en un frasco estéril con un pequeño volumen de 1-2 mL de solución salina no bacteriostática y durante el transporte se debe mantener en posición vertical. • Es conveniente controlar que los LBA se procesen con la mayor rapidez, ya que el resto del material anestésico actúa como inhibidor del crecimiento bacteriano. e

¿Qué tipos de muestras no se deben refrigerar?

Biopsia de pulmón e

e

La muestra se recoge directamente en un recipiente estéril, desechable, de boca ancha y con tapón de rosca. Puede añadirse una pequeña cantidad de suero fisiológico (2-5 mL), pero no se debe agregar formalina a la muestra, ya que inhibe el crecimiento bacteriano. Avisar al laboratorio de microbiología para el procesamiento inmediato de la muestra, transportarla rápidamente y no refrigerar.

Hemocultivos En un porcentaje nada despreciable de casos se consigue aislar el agente causal de la neumonía en la sangre del paciente, por lo que, además de muestras de secreciones respiratorias, deberían realizarse hemocultivos de todos los pacientes con neumonía. Si se sospechan infecciones pulmonares causadas por virus, hongos o parásitos, deben utilizarse técnicas especiales para recuperar el agente etiológico. Hay que recordar que: e

e

e

e

e

El agente causal de la neumo-

nía también se puede aislar en la sangre del paciente.

Es.esencial en la toma de este tipo de muestras la correcta antisepsia de la piel y la prevención de la contaminación. Se ha de anotar el número de muestras cultivadas, el tiempo transcurrido entre las tomas y el volumen de sangre que se almacena en los frascos; este último es el aspecto más importante que se debe tener en cuenta para la posterior valoración de los resultados del cultivo (de 10-20 mL por extracción: 20 -30 mL en total en adultos y a partir de 0,5 -1 mL y hasta 5 mL en niños, según la edad y el tamaño corporal). Se recogen por paciente 2-3 tomas o extracciones. Asimismo, por cada toma se envasan dos frascos (aerobio y anaerobio) y uno pediátrico en el caso de que el pa ciente sea un niño. Excepto en septicemias, no se recomienda obtener muestras a intervalos menores de 1 hora y se ha de seleccionar un punto diferente de extracción en la vía venosa en cada toma (se evitará la obtención de la muestra de sangre a través de un catéter intravenoso o intraarterial). Es importante transportar la muestra al laboratorio rápidamente y no refrigerar en ningún caso. Mantenerla a temperatura ambiente.

PREVENCiÓN DE ERRORES MÁS COMUNES EN LA MANIPULACiÓN DE UNA MUESTRA DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR POR PARTE DEL PACIENTE Y EL TÉCNICO Para la obtención de una muestra correcta del TRI es necesaria una cuidadosa recolección de las muestras que evite o minimice la contaminación con los microorganismos que se encuentran en la boca y la faringe (orofaringe). Por esta razón, cuando se solicite la obtención de esputos por parte del paciente, hay que explicarle verbal165

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¿Qué medidas de seguridad debe tener el TEL en la manipulación de muestras?

mente cómo se debe realizar la obtención correcta de la muestra, e instruir al enfermo respecto a la diferencia entre saliva y esputo. De esta forma, el paciente aprende a desechar los esputos compuestos por saliva o secreciones posnatales, que no son útiles para estudio. Además, se debe entregar al paciente un recipiente especial de plástico con su nombre o identificación única y por escrito el protocolo modelo de las instrucciones, que normalmente facilita el servicio de laboratorio de microbiología donde se va a realizar el análisis de la muestra. Estas advertencias han de incluir otras, además de las recomendaciones que se han citado con anterioridad: • Extracción de la dentadura postiza si se utiliza. • Obtener la muestra en cuanto se despierte por la mañana y antes de comer o beber nada. • Cepillarse los dientes y enjuagarse la boca con agua o solución salina estéril. • No usar enjuague bucal. • No abrir el recipiente contenedor de la muestra hasta el momento de utilizarlo. • Enroscar la tapa firmemente para evitar que el contenido escape del recipiente. • Lavar y secar el exterior del recipiente sin dejar que le entre agua. • Para extremar las precauciones en caso de sospecha de tuberculosis, si es posible, salir al aire libre o abrir una ventana antes de recolectar la muestra de esputo. Esto ayuda a evitar que otras personas respiren directamente los gérmenes que expulsa el enfermo al toser. e Anotar en la etiqueta del recipiente la fecha en la que se recolectó el esputo. • Colocar el recipiente dentro de una bolsa especial para el transporte de este tipo de muestras al laboratorio. Para evaluar la calidad de las muestras recogidas que atraviesan la orofaringe se efectúa en el laboratorio una tinción de Gram previa al análisis de cada muestra, lo que resulta un paso limitante para continuar con el procesamiento. Para ello, las preparaciones deben observarse a bajo aumento (100x) y se considera que una muestra rica en leucocitos polimorfonucleares, histiocitos y células del epitelio del árbol traqueobronquial es representativa de una infección respiratoria de vías bajas, mientras que la presencia de células epiteliales escamosas es un claro indicador de contaminación de la cavidad oral.

Medidas de seguridad en la manipulación de la muestra por parte del técnico

En España, la protección de los trabajadores frente a los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos está regulada por el ReaL Decreto664/ 97 de 12de mayo (BOE de 24 de mayo de 1997) y la adaptación contenida en la Orden de 25 de marzo de 1998 (BOEde 30 de marzo de 1998).

Uno de los aspectos más importantes del trabajo diario de un técnico de laboratorio es conocer las medidas de seguridad que se han de seguir cuando se manipula una muestra biológica, así como los riesgos no biológicos (químicos, físicos, eléctricos, etc.) comunes al trabajo en cualquier laboratorio y recordar que debe aplicarlos siempre como condición imprescindible. En el laboratorio todo el personal contratado debe tener acceso al manual de seguridad de manipulación de muestras y a los proce dimientos normalizados de trabajo en donde se especifica claramente cómo proceder en cada caso. De nada sirven las tecnologías más avanzadas, el óptimo diseño arquitectónico del centro o la mejor ingeniería sanitaria, si el personal desconoce o incumple las medidas establecidas para su propia seguridad, la de sus compañeros y la de la comunidad. Precisamente, la seguridad se determina por la actitud y el modo de proceder de las per sonas que trabajan en el laboratorio. El riesgo puede ser muy alto o muy limitado y depende de la motivación del personal, de la infraestructura y de la metodología que se sIgue. Según el Real Decreto 664 /97, el responsable inmediato de la seguridad y las con diciones de trabajo en el laboratorio de microbiología clínica es el jefe de servicio o director del laboratorio. Debe supervisar y mantener actualizado el manual de seguridad que se entrega a todos los trabajadores del laboratorio, con constancia por

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escrito de este hecho. La clave de la eficacia de los programas de seguridad es la formación, ésta se debe facilitar a todas las personas que están expuestas a los riesgos del laboratorio: personal del laboratorio, de mantenimiento, de limpieza, etc. Los trabajadores deben responsabilizarse de su propia seguridad y de la de sus compañeros y velar por su adecuado cumplimiento una vez las normas de seguridad se hayan establecido, aprobado, escrito y asumido. Un programa de seguridad gestionado por profesionales bien entrenados, con un alto grado de participación por parte de los trabajadores, puede llevar no sólo a una disminución importante del número de lesiones y enfermedades, sino también a un incremento de la satisfacción del trabajador y de la productividad. Es indispensable, por lo tanto, estimular, desarrollar e implantar programas de seguridad y salud efectivos. Todas las muestras del TRI han de manipularse con las medidas de seguridad recomendadas para los agentes biológicos del grupo de riesgo descrito en el capítulo 3. Los agentes biológicos clasificados en este grupo pueden causar una enfermedad grave en el hombre e implican un gran peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la comunidad y frente a ellos generalme nte existe profilaxis o tratamiento eficaz. Por lo tanto, además de las medidas generales para la manipulación de muestras biológicas, deben procesarse en cabinas de seguridad biológica de clase 110 incluso 111, en las que el aire que entra y sale del lugar de trabajo se depura con la instalación de filtros de alta eficacia para partículas en el aire (high efJiciency particle arresting, HEPA) o con algún otro sistema, para evitar así el contagio por aerosoles. En todos los casos, una vez que se termine de trabajar en las cabinas, éstas deben descontaminarse.

Calidad en la manipulación de la muestra por parte del técnico El técnico debe adoptar una serie de medidas para procesar la muestra de manera óptima y obtener así unos resultados exactos y de calidad. Estas técnicas incluyen: • Procesar todas las muestras lo más rápidamente posible desde su recepción para mantener la viabilidad patógena. • Escoger la porción más purulenta o sanguinolenta de la muestra. • Utilizar una cito centrífuga reservada para las extensiones del LBA. • Emplear torunda, pipeta o asa estériles para inocular las muestras en los medios de cultivo. • Evitar por completo la contaminación de los cultivos. • Cumplir con las normas de seguridad, tanto generales como especiales, para los agentes biológicos del grupo 111. • Para la realización de cultivos cuantitativos, las muestras de CTP y LBA deben agitarse en vórtex pero no se centrifugarán. • El sobrenadante inicial de las muestras del LBA debe desecharse. • Las piezas de biopsia transbronquial se introducirán en un contenedor estéril junto con una pequeña cantidad de suero salino no bateriostático.

El técnico deberá adoptar medidas para procesar la muestra de manera óptima y obtener así unos resultados exactos y de calidad.

SUSTANCIAS O ELEMENTOS FORMES ANALIZABLES EN UNA MUESTRA DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR El número de pruebas que puede efectuarse cuando se tiene poco volumen de una muestra del TRI (p. ej., biopsias, aspirados, etc.) hace necesaria la priorización de las pruebas que se solicitan, para conseguir realizar un diagnóstico rápido y certero que permita el tratamiento del paciente. Cuando una muestra de TRI llega al laboratorio es conveniente anotar las características macroscópicas de ésta, la proporción de saliva que posee, la consistencia, su color, la presencia o ausencia de pus, sangre o moco, así como cualquier otra característica que se considere relevante. En las muestras que se recogen con fibrobroncoscopio, debe anotarse el volumen de solución salina recuperado en el LBA, así como el volumen en el que se encuentran diluidas las secreciones obtenidas mediante CTl?

En su opinión, ¿cuáles son los tres aspectos prioritarios para hacer una buena manipulación de las muestras?

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Igualmente, se anotará si se detecta, por ejemplo, masas gaseosas constituidas por tejido pulmonar necrótico, broncolitos propios del cáncer de pulmón y tuberculosis, tapones de Dittrich característicos de las bronquiectasias o cuerpos extraños de cualquier naturaleza (restos de alimentos, etc.).

Examen directo de muestras respiratorias Para llevar acabo el análisis microscópico se realiza una tinción de una extensión de las muestras, así se puede observar la morfología de los microorganismos o células que se encuentran en la muestra y las características tintoriales. El examen directo de las muestras respiratorias no debe sustituir al cultivo, pero es una técnica rápida que puede proporcionar al clínico una información muy útil y, en ocasiones, puede incluso llegar a ser diagnóstica. Por ejemplo, la observación de quistes o trofozoitos de Pneumocystis carinii en una muestra de LBA es evidencia de una neumocistosis; o la visualización de pequeñas levaduras en el interior de células histiocitarias es un signo patognomónico de histoplasmosis. Asimismo, en un paciente neutropénico la presencia de hifas tabicadas en una muestra respiratoria puede indicar la existencia de una posible aspergilosis pulmonar invasiva; así, la presencia de hifas no tabicadas en un paciente con cetoacidosis diabética es un dato de gran utilidad para iniciar el tratamiento de una posible mucormicosis. Por lo tanto, la observación de ciertos elementos característicos en el examen directo puede alertar sobre la necesidad de emplear técnicas de cultivo específicas o tiempos de incubación más prolongados.

• Estudio citológico: debe ser reciente para evitar la histólisis y la obtención de la muestra será, a ser posible , mediante broncoscopia. Se analizarán las células de dos tipos: Los estudios citoLógico y microbioLógico son los análisis microscópicos que se realizan con mayor frecuencia.

Células neoplásicas. Determinan tumores. El hallazgo de estás células es positivo en un alto porcentaje de casos y permite un diagnóstico precoz del cáncer. Las muestras se tiñen por el método de Papanicolau. Células hemáticas. La visualización de eritrocitos es muy importante para determinar las hemoptisis, que es la expulsión de sangre con la tos procedente de la vía respiratoria subglótica. El hallazgo de leucocitos está presente en todas las enfermedades infecciosas y el de eosinófilos en el asma bronquial (alergias).

• Estudio microbiológico: la muestra se colorea con la tinción diferencial de Gram y se estudia por microscopia directa para descubrir neumococos, estreptococos yestafilococos. Su determinación tiene gran importancia para determinar el microorganismo patógeno específico causante de las infecciones del aparato respiratorio, en especial de la neumonía. Por ejemplo, la realización de un examen en fresco para determinar el equinococo causante del quiste hidatídico puede advertir de su presencia. Igualmente, para el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar, el bacilo de Koch presente en el esputo indica tu berculosis abierta. Se utiliza una técnica de tinción diferencial rápida y económica denominada de Ziehl-Neelsen, específica para microorganismos o bacterias ácido alcohol resistentes (BAAR). Para la determinación de este bacilo, el paciente, además de cepillarse los dientes y enjuagarse la boca, debe realizar gargarismos con lugol (antimicótico) para evitar la contaminación de la muestra por los hongos de la boca. Además, para una confirmación positiva de la presencia de M. tuberculosis, es necesario realizar un cultivo en un medio selectivo, porque esta tinción también colorea otros microorganismos no necesariamente patógenos. Por este motivo, el medio de cultivo más usual para su determinación es el de Lowenstein-Jensen. En la tabla 14-1 se cita una selección de técnicas de examen directo que pueden aplica rse a muestras procedentes del TRI, y se indica su utilidad en función del tipo de m uestra del TRI, aunque no se entra en detalles metodológicos.

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Esputo Aspirado traqueal Broncoaspirado Tinción Ziehl-Neelsen [BAAR)

Tinción de Gram

Búsqueda de mico bacteria

Lavado broncoalveolar (LBAo SAL) Búsqueda de micobacteria

M. tuberculosis

M. tuberculosis

Evaluar la cali dad de las muest ras

Evaluar la calidad de las muestras

Tinta china

Biopsia bronquial Biopsia pulmonar

Sospecha de criptococosis

Tinción de ácido peryódico de Schiff [PAS) Diff - Qu ic k/ Giem sa

Búsqueda de elementos fúngicos Sospecha de histoplas mosis

Sospecha de neumocistosis Sospecha de histoplasmosis Sida [< 200 CD4)

Sospecha de histoplasmosis

Gomori-Grocott

Sospecha de neumocistosis [Diff-Quick negativa)

Búsqueda de elementos fúngicos

Anticuerpos marcados

Sospecha de neumocistosis [Diff-Quick, Grocott negativas)

Identificación de elementos fúngicos

Hematoxili na-eosi na Digestión KüH calcoflúor

+/-

blanco

Destacar la reacción tisular Búsqueda de elem ent os fúngicos

Búsqueda de elementos fúngicos

Búsqueda de elementos fúngicos Reservar para histopatología

Técnicas inmunológicas de examen directo El empleo de anticuerpos marcados puede facilitar la identificación de agentes etiológicos y resulta especialmente útil en cortes histológicos. Como ejemplo, en la neumocistosis, el empleo de anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína parece haber demostrado una sensibilidad mucho más alta que cualquier otra técnica de examen directo. No obstante, el arsenal disponible de anticuerpos marcados es muy escaso y, salvo contadas excepciones, sólo están disponibles en algunos centros de referencia; incluso algunos de los reactivos para la identificación de los agentes, como por ejemplo el específico para Aspergillus spp, están aún en fase de evaluación.

Técnicas microbiológicas indirectas: serología Las técnicas directas, como se ha dicho anteriormente, resultan de alto coste y se reservan para determinaciones concretas de algunos agentes infecciosos. No obstante, es importante no descartarlas a priori, puesto qu e, por ejemplo, ante una sospecha de NAC, las determinaciones directas (inmunológicas y por biología molecular) y sobre todo las indirectas (mediante técnicas inmunológicas) son las más indicadas. Para la realización de estas determinaciones no se utiliza n muestras del TRI, sino suero obtenido por punción cutánea. Para ello, se obtiene una muestra de sangre periférica en un tubo especial para la obtención de suero, que se trata de unos tubos en formato seco o de gel que ayudan a la obtención de este hemoderivado.

Las técnicas seroLógicas son de alto coste

y se

reservan para

determinaciones concretas de algunos agentes.

Cultivo de muestras del tracto respiratorio inferior La técnica de cultivo de las muestras respiratorias tiene una sensibilidad más alta que la de cualquier otra técnica diagnóstica y, además, permite el aislamiento del 169

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agente causal, lo que es indispensable para una correcta identificación de la especie implicada y, si así se indica, hace posible la práctica de estudios de sensibilidad o epidemiológicos. El procesamiento y cultivo de las muestras del TRI debe realizarse tan pronto como sea posible; una vez que se ha recopilado toda la información necesaria que oriente sobre el agente etiológico de la patología respiratoria, se procede a inocular distintos me dios de cultivo que se incuban en estufas a distintas temperaturas. Estos medios de cultivo se examinan diariamente para detectar el crecimiento de posibles microorganismos en las muestras. Una vez que se detecta el crecimiento de algún microorganismo, se procede a su identificación mediante distintas pruebas bioquímicas y se realiza un an tibiograma para estudiar la sensibilidad del microorganismo aislado frente a distintos antibióticos.

Medios de cultivo cualitativos Se realizan cultivos cualitativos de bacterias en todas las muestras respiratorias excepto en los aspirados endotraqueales, muestras obtenidas por fibrobroncoscopia (CTP y LBA) y muestras obtenidas por técnicas ciegas. La mayoría de los agentes cau santes de infecciones del TRI crecen en los medios de cultivo comunes, como agar san gre de carnero 5 % o agar sangre de caballo, agar chocolate y agar McConkey o agar EMB (para en tero bacterias) . No están indicados los caldos de enriquecimiento ni me dios para anaerobios excepto en el líquido pleural, la biopsia y el absceso pulmonar, puesto que todas las muestras pueden estar contaminadas por la microbiota normal respiratoria. En concreto, para las biopsias de pulmón están indicados, además de los medios anteriormente nombrados, los medios BHI y Tio. Ante la sospecha de infección por Legionella spp, se incluirán placas de agar BCYEu. En el caso de sospecha por M. pneumoniae o C. pneumoniae se inocularán las muestras en los medios de cultivo específicos para estos microorganismos y para B. Pertussis en agar Regan-Lowe o similar. En las placas de agar sangre y chocolate se inoculará la muestra mediante triple estría específica para el cultivo de bacterias aerobias. De este modo se consiguen tres áreas de reaislamiento, con el fin de evaluar la cantidad de crecimiento de los posibles patógenos. Los cultivos para anaerobios se podrían realizar en muestras obtenidas por aspiración percutánea (raramente se usa) o en las muestras de CTP con una solicitud específica. INCUBACIÓN: se incubarán las placas a 35 -37 ü C en un 5% de dióxido de carbono durante 48 -72 horas, excepto los cultivos de muestras pulmonares obtenidas por procedimientos invasivos, que se incubarán durante 4 días. Las placas de medio de Legionella y de Regan-Lowe se incubarán 7 días. Las placas para cultivo de Nocardia y Rhodococcus se incubarán hasta 2 semanas antes de descartarlas como negativas.

Medios de cultivo cuantitativos Se realizarán cultivos cuantitativos en muestras obtenidas por fibrobroncoscopia mediante la elección uno de estos dos métodos:

• Método de diluciones decimales seriadas: se elaboran diluciones decimales seriadas de las muestras en suero fisiológico salino y posteriormente se siembran en diferentes alícuotas en los medios de cultivo. • Método de la siembra con asa calibrada: posteriormente a la incubación, se cuentan las colonias y se multiplican por el factor de la dilución apropiado para determinar el número de bacterias presentes en 1 mL de líquido. En la tabla 14-2 se muestra la relación de medios de cultivo y técnicas bioquímicas en los principales agentes causantes de enfermedades respiratorias.

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Técnica diagnóstica

Agente causal Neumococo

Tinción de Gram. Cultivo en agar sangre + sensibilidad a la optoquina. Detección de antígeno polisacárido en distintas muestras

Haemophilus influenzae

Tinción de Gram. Cultivo en agar chocolate + requerimientos nutricionales. Detección del polisacá rido capsular

Moraxella catarrhalis

Tinción de Gram. Cultivo en agar sangre + pruebas bioquímicas

Enterobacterias

Tinción de Gram. Cultivo en agar McConckey + pruebas bioquímicas

Mycoplasma pneumoniae

Cultivos en m edios especiales. Serología

Chlamydia pneumoniae

Cultivos ce lulares. Serología

Legionella spp

Tinción de Giménez. Cultivo en medios especiales [BCYE). Inmunofluorescencia directa. Serología. Detección de antígeno en orina

Mycobacterium tuberculosis

Tinción de Ziehl-Neelsen. Tinción de auramina. Cultivos en medio sólido [Lowenstein, Coletsosl. Cultivos en medio líquido [Middlebrook 7H9). PCR sobre muestras respiratorias

Micobacterias atípicas

Tinción de Ziehl-Neelsen. Tinción de auramina. Cultivos en medio sólido ll.owenstein, Coletsosl. Cultivos en medio líquido [Middlebrook 7H9). PCR sobre muestras respiratorias

Criptococcus neoformans

Tinciones de plat a. Cultivo en medios para hongos [SabouraudJ

Virus

Técnica de Shell-vial. Cultivos sobre líneas celulares. Serologías

Hongos y levaduras

Cultivos en m edios especiales [SabouraudJ

Pneum ocystis carinii

Tinciones de plat a. Inmunofluorescencia directa

Ascaris lumbricoides

Examen en fresco de secreciones respiratorias

PCR: reacción en cadena de las polimerasas.

No debo olvidar que... •

Los mecanismos involucrados en la respi ración son: - Ventilación: intercambio de gases desd e la atmósfera a los alvéolos p mona res y viceversa. - Hematosis: difusión e intercambio gaseoso en la superficie pulmonar. - Transporte de oxígeno: se sucede a tra vés de la sangre. - Difusión: intercambio gaseoso a nivel celular. - Respiración real: consumo de oxígeno y producción de dióxido de carbono por la célula. - Perfusión: paso de sangre por el capilar. Este sangre se oxigena y más tarde regresa al corazón.

•

Las vías respiratorias inferiores (por deba jo de la epiglotis) son estériles en condiciones normales gracias al sistema mucociliar y al sistema macro-

fagoaLveoLar. •

Las muestras procedentes del tracto respiratorio inferior (TRI) pueden obtenerse mediante procedimientos invasivos o no invasivos.

•

Para la correcta obtención de una muestra del TRI es necesaria una cuidadosa recolección de las muestras. con el fin de evitar o minimizar la contaminación con los microorganismos de la orofaringe.

•

El técnico de laboratorio debe conocer los procedimientos de trabajo y las medidas de seguridad y seguir rigurosamenrte su obligado cumplimiento.

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Caso práctico

Preguntas de repaso 1. En La vía respiratoria, ¿en qué Lugar de Los puLmones tiene Lugar eL intercambio gaseoso? a. b. c. d.

En En En En

la pleura visceral. el anillo de Waldeyer. los alvéolos pulmonares. la pleura parietal.

2. Indicar cuáL es eL orden correcto de entrada de oxígeno aL organismo:

Un paciente acude a su consulta de atención primaria, donde su médico de cabecera le indica una exploración radiográfica de tórax y un análisis de esputo para evaluar una posible infección por neumococo. El paciente recoge el contenedor de la muestra en el mostrador del laboratorio y, tras la toma de la muestra, se dirige al departamento de rayos X. Pero el análisis del esputo finalmente no se pudo realizar. ¿Qué ha ocurrido?

a. Fosas nasales, faringe, laringe, tráquea, bronquios, bronquíolos. b. Fosas nasales. laringe, faringe, tráquea, bronquíolos. c. Fosas nasales, faringe, laringe, tráquea, bronquíolos, bronquios. d. Fosas nasales, laringe, faringe, tráquea, bronquios, bronquíolos.

BIBLIOGRAFíA BaselskiVS, Wunderink RG. Bronchoscopic diagnosis of pneumonia. Clin Microbiol Rev October. 1994;7(4):533-58. Esteban J. Tuberculosis in special groups and occupational hazards. En: Madkour MM, ed. Tuberculosis. Berlin: Springer-Verlag, 2003; 93-111. Infect ious Diseases Society of AmericalAmerican Thoracic Society. Consensus guidelines on the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis. 2007;44 Suppl 2:27-72. Latge Jl? Aspergil1us fumigatus and aspergil1osis. Clin Microbiol Rev. 1999;12:310-50. Mesenguer MT, Cacho JB, Oliver A, Puig de la Bellacasa J. Diagnóstico microbiológico de las infecciones bacterianas del tracto respiratorio inferior. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2008;26(7) :430-6. Sharp SE, Robinson A, Saubolle M , Santa Cruz M , Carroll K, BaselskiV Cumitech 7B, lower respiratory tract infections. En : Sharp SE, editor. Washington: ASM Press. 2004.

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r

Indice de contenidos Introd ucción •

Exudados de piel y tejidos blandos

•

Exudados del tracto respiratorio superior: exudados faríngeos y nasofaríngeos

•

Exudados oculares

•

Exudados óticos : oído externo y oído med io

•

Exudados genitales : exudado uretral, exudado vaginal, exudado endocervical y exudado balanoprepucial

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ras para diagnó eden ser rec iente

INTRODUCCiÓN El laboratorio de microbiología es el lugar donde se realiza el diagnóstico de las enfermedades infec ciosas que afectan al ser humano. Para ello se utilizan diferentes técnicas diagnósticas que se basan en la localización e identificación de microorganismos (diagnóstico directo) o en la detección de la «huella» que el microorganismo ha dejado en el contacto con su huésped (diagnóstico indirecto). El laboratorio de microbiología se diferencia fundamentalmente de otros laboratorios clínicos por el manejo de una gran diversidad de muestras clínicas y la aplicación de múltiples métodos diagnósticos. El factor limitante inicial en el diagnóstico microbiológico es la correcta obtención de la muestra clínica apropiada. La muestra debe seguir una serie de indicaciones y ser representativa del proceso infeccioso que se quiere diagnosticar. Además, debe cumplir los requisitos que aseguren su idoneidad, como el procedimiento que se utiliza para su obtención, la cantidad de muestra remitida, así como la conservación y el trans porte adecuado al laboratorio. Una vez que se ha recibido la muestra, se ha de determinar si cumple los requisitos de calidad necesarios antes de ser procesada. Éstos incluyen su correcta identificación y, de nuevo, la existencia de una cantidad suficiente de producto para los estudios solicitados y la comprobación de que las condiciones de transporte y conservación hayan sido adecuadas. Posteriormente, se procede al procesamiento de las muestras y se sigue un protocolo diagnóstico establecido por cada laboratorio de forma específica, mediante medios de cultivo primarios que permiten el aislamiento de la mayoría de los agentes etiológicos más frecuentes para la confirmación de los distintos procesos infecciosos. No obstante, aunque el aislamiento por cultivo continúa siendo la técnica más frecuentemente empleada en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, existen en la actualidad otras técnicas cuya principal ven taja sobre el cultivo es la rapidez diagnóstica. Estas técnicas de diagnóstico indirecto se basan en la detección de an tígenos y de ácidos nucleicos o en la detección de la respuesta inmunológica (anticuerpos). En este capítulo se detallan una serie de mue stras clínicas cuya recogida no puede realizar el propio paciente. Concretamente, se trata el procesamiento de los exudados de piel y tejidos blandos, las muestras del tracto respiratorio superior, exudados conjuntivales, exudados óticos y exudados genitales. En la tabla 15-1 se resume lo más importante en cuanto al tipo de muestra, procesamiento y etiología predominante.

EXUDADOS DE PIELY TEJIDOS BLANDOS

• Exudado de la piel • Exudado de tejidos blandos • Muestras del tracto respiratorio superior • Exudados conjuntivales

Para tener un correcto diagnóstico microbiológico , la obtención de la muestra clínica debe ser adecuada.

Las infecciones de piel y tejidos blandos incluyen las que afectan a la piel y anejos cutáneos, tejido celular subcutáneo, fascias y músculo estriado; son, junto a las de vías respiratorias, las infecciones más frecuentes en el ser humano. 175

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Etiología más frecuente

Muestra

~ - h em o lít i c o s,

5. aureus,

Procesamiento

AS, ACH, MCK 35-3 7 -c aerobiosis ASCH 35-37 -c anaerobiosis ASB 3D oC (si sospecha fúnqical BHI. TG 35-37°C

Exudados de piel y partes blandas

Estreptococos

Exudado faríngeo

5. pyogenes, estreptococos grupo C y G, virus , M. pneumon iae

AS 5% CO 2 35-37 -c anaerob iosis N. gonorrhoeae : VCAo TM Técnicas de diágnostico rápido (antígenos, PCR)

Exudado nasofaríngeo

B. pertussis, M. pneumoniae, G. diphteriae, virus respiratorios

PCR. IF, cultivo

Exudado conjuntival

5 . aureus, 5. pneum oniae, 5. pyogenes y H. influenzae

AS. ACH 35-37 oc aerobiosis con 5% CO2 MCK 35-37 -c aerobios is VCA, TM 35-37 -c aerobiosos

Exudado corneal

Cocos grampositivos, enterobac terias y Pseudomonas spp

AS, ACH 35-37 -c aerobiosis con 5% CO2 MCK 35-37 -c aerobiosis ASB 3D -c aerobiosis BHI, TG 35-37 -c aerobiosis

Exudado endoftálmico

Estafilococos coagulasa negativos , 5. aureus, 5. pneumoniae

AS, ACH 35-37 -c aerobiosis con 5% CO 2 MCK 35-37 -c aerobiosis ASB 3D -c aerobiosis BHI, TG 35-37 -c aerobiosis

Exudado ático

5 . aureus, 5. pyoge nes, P. aeruginosa, Aspergill us spp, 5. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis

AS. ACH 35-37 -c aerobiosis con 5% CO 2 MCK 35-37 -c aerobiosis ASB 3D -c aerobiosis BHI, TG 35-37 -c aerobiosis

Exudados genitales

N. gonorrhoeae, G. trachom atis, M. hominis, U. urealyticum, Gandida spp, 5. agalactiae, 5. aureus, H. influenzae , T. vaginalis

ACH, VCA o TM 35-37 -c aerobiosis CAN aerobiosis DIAMOND

P. aeruginosa, enterobacte rias

ACH: agar chocolate ; AS: agar sangre; ASB: agar Sbourau d; ASCH: agar Schaedler; BHI: caldo de cerebro lbreui! y corazón ltieert], CAN : agar cand ida eromogénico; IF: inmunofluorescencia; MCK: McConkey; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; TG: tioglicolato; TM: Thayer-Martin; VCA: agar vancom icina-colistina .

La s infecciones s e c la sifi can en agudas o cró n icas se gú n el mom ento de aparición y su evolu ció n .

Estas infecciones pueden estar causadas por una gran variedad de microorganismos, algunos de los cuale s forman parte de la microbiota o flora normal de la piel y mucosas. Estos microorgani smos pueden penetrar en el cuerpo a través de lesiones en la piel o en las mucosas, producidas por heridas traumáticas, quemaduras o como complicación de pr oced imi entos quirúrgicos, o bien desde un foco de infe cción distante m ediante diseminación hematógena o por contigüidad. Se con sideran mi crobi ota habitual los siguientes microorganismos: estafilococos coagulasa negativos, corinebacterias, Micrococcus spp, Aerococcus spp, estreptococo s a y no hemolíticos, algunas especies de Neisseria y algunos anaerobios (Propionibacterium spp, Clostridium spp y Peptostreptococcus spp). Por su parte, se consideran mi croorganismos patógenos los estreptococos ~-hemolíticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus sp p, Pseudomonas aeruginosa, entero bacterias y algunos microorganismos ana erobios (Bacterioidesspp, Prevotella spp, etc.), En fun ción del momento de aparición y de su evolución, estas infe cciones se clasifican en agudas o crónicas. Las agudas se producen por algún daño externo sobre la piel intacta (infección de herida quirúrgica, infección de herida traumática, quemadura, mordedura). A su vez, las infe cciones crónicas están favorecidas por factores del huésped, como la diabetes, la edad avanzada, la obesidad, la malnutrición, la inmunosupresión y las alteraciones en la circulación sanguínea.

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Diagnóstico microbiológico de las infecciones de piel

y partes blandas. Obtención de la muestra La muestra, como en otros tipos de infecciones, debe obtenerse de una zona representativa del proceso infeccioso. Además, debe evitarse en lo posible la contaminación con la flora microbiana habitual y enviar una cantidad adecuada y suficiente para las determinaciones que se solicitan. Siempre se recomienda la obtención de la muestra antes del inicio de una pauta antibiótica empírica, para evitar los resultados falsamente negativos debidos a este tratamiento. Además, la toma de la muestra debe estar precedida por la limpieza y desinfección del área circundante a la lesión. En biopsias y heridas cerradas se recomienda la desinfección con clorhexidina al 2 % o con etan ol al 70 %, seguido de povidona iodada al! 00/0. En heridas abiertas, asimismo, se recomienda eliminar el material neerótico y los tejidos desvitalizados y lavar la heri da con suero salino estéril. Es de mayor utilidad la toma de la muestra de tejido viable infectado y no de restos cutáneos superficiales. Desde el punto de vista microbiológico, la obtención de tejido o de la muestra mediante aspiración es la opción óptima. En general no se recomienda la toma de muestras superficiales mediante torunda, porque los microbios patógenos que se encuentran en la superficie de la herida pueden no reflejar exactamente lo que ocurre en pro fundidad. Sin embargo, cualquier microorganismo presente en profundidad es muy probable que también esté en la superficie. Además, la toma de muestra mediante to runda es un procedimiento sencillo, barato y no invasivo. Si la muestra se toma con torunda, se aconseja que se utilicen dos, una para realizar la tinción de Gram y otra para la inoculación en los medios de cultivo. Si sólo se recibe una torunda en el laboratorio de análisis, primero se inocularán los medios de cultivo y finalmente se realizará la tinción. En los abscesos cerrados se recomienda aspirar el material purulento con jeringa y aguja a través de una zona de piel sana y previamente desinfectada. Si no hay muestra suficiente , se inyecta suero salino estéril sub cutáneo y se aspira de nuevo. Tras expulsar el aire y cambiar de aguja, se inoculará el contenido en un vial de transporte para anaerobios o en un frasco de hemocultivos, o en ambos si hay cantidad suficiente. En heridas abiertas, se debe tomar la muestra de tejido celular subcutáneo de los bordes de la herida o de la base de la lesión. En caso de heridas secas, se recomienda impregnar la torunda con suero salino estéril antes de realizar la toma. La torunda debe ser de alginato y se guarda en un recipiente con medio de transporte específico, como el medio de Stuart-Amies. El material purulento se aspira de la zona más profunda de la herida con jeringa y aguja, siendo inoculada en un vial de transporte para anaerobios. Para los tejidos que se obtienen mediante biopsia se recomienda evitar en todo lo posible las zonas necróticas. Estas muestras pueden obtenerse mediante punción-aspiración con aguja fina (PAAF), mediante punch o a través de un procedimiento quirúrgico abierto.

La obtención de La muestra debe hacerse antes del inicio de una pauta antibiótica para evitar falsos resultados y la aspiración es la opción óptima para la obtención de la muestra.

En los abscesos cerrados se debe tomar la muestra mediante aspiración con jeringa y aguja a través de una zona de piel sana y previamente desinfectada; en heridas abiertas, de los bordes o de la base de la lesión.

Identificación de la muestra y transporte al laboratorio La muestra clínica se debe remitir siempre acompañada de un formulario de petición, que puede ser un volante de petición clásico o por vía telemática. En dicha petición deben constar varios datos identificativos: información personal del enfermo, fecha y hora de la toma, tratamiento antimicrobiano previo, enfermedades de base, juicio clínico , tipo de muestra y localización anatómica y determinaciones microbiológicas que se solicitan. La muestra se debe introducir en contenedores estériles con cierre hermético, adecuados en tamaño. Ante la sospecha de la presencia de anaerobios, se recomienda enviar la muestra en sistemas de transporte específicos y enviarla al laboratorio lo antes posible, preferiblemente en las 2 horas posteriores a la toma, aunque las muestras en medio de transporte específico pueden demorarse hasta 24 horas a temperatura ambiente.

La muestra clínica siempre debe ir acompañada del formulario de petición.

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Constituyen criterios de rechazo de las muestras la discrepancia entre la identificación de la muestra y la identificación en el formulario de petición, las muestras en formol y torundas sin medio de transporte cuando haya transcurrido más de 1 hora desde la toma de la muestra. Si la muestra es insuficiente para todas las determinaciones que se solicitan, se contactará con el médico peticionario para decidir qué determinaciones analíticas hay que priorizar. ¿Qué se pretende averiguar con los cultivos cualitativos?, ¿y con los cuantitativos?

Es esencial una buena elección de los medios de cultivo. Los medios sólidos y líquidos se observan diariamente, excepto la placa cultivada en anaerobiosis, cuya primera lectura se realiza a las 48 horas.

Procesamiento de la muestra El laboratorio de microbiología procesa la muestra según sus protocolos de trabajo y a partir de la información que aporta el médico que la solicita, respecto a la muestra en sí y a las características del paciente. Las muestras de gran tamaño (biopsias) no requieren trituración; se procede a fraccionar la muestra con la ayuda de un bisturí y se realizan las improntas en los medios analíticos y en el portaobjetos. En cambio, las muestras muy pequeñas se pueden inocular directamente en el medio de enriquecimiento y, posteriormente, tras 18 horas de incubación, iniciar los subcultivos en medios sólidos. Otros tipos de muestras se han de homogeneizar antes de proceder a su cultivo. Como en otro tipo de muestras, es necesaria una buena elección de los medios de cultivo. Lo habitual es realizar el cultivo en medios de agar sangre, agar chocolate y agar McConkey, que se incuban en atmósfera aerobia a 35-37°C y en agar Schaedler, en atmósfera anaerobia a 37 oC. Otros medios son optativos, pues dependen de las pruebas que se han solicitado y de la sospecha clínica; si se solicita el estudio de hongos, se procede al cultivo en medio de agar Sabouraud en atmósfera aerobia a 30 oC. Se pueden utilizar también caldos de enriquecimiento como BHI (brain heart infusion) o caldo de tioglicolato, que se incuban a temperatura ambiente o a 37 oC; sólo se realizará en muestras invasivas en las que la carga microbiana puede ser baja. Finalmente, se procede a realizar extensiones para llevar a cabo tinciones de Gram. Lo habitual es efectuar el cultivo cualitativo: se siembra la muestra sobre uno de los cuadrantes de cada placa y con un asa estéril se marcan estrías desde la zona de descarga por el resto de los cuadrantes. En ocasiones se procede al cultivo cuantitativo: se introduce la muestra en 5 mL de suero salino estéril (dilución 1:5) y, tras homogenizar la muestra, se inocula 0,1 mL de la sustancia homogeneizada en los medios de cultivo. Se realizan tres diluciones seriadas del homogeneizado (0,5 mL de muestra en 4,5 mL de suero salino estéril), con lo que se obtienen tres diluciones 10- 2, 10- 3 Y 10-4. Los medios sólidos y los medios líquidos se observan diariamente, excepto la placa cultivada en anaerobiosis, cuya primera lectura se realiza a las 48 horas. Los medios de cultivo para aerobios se incuban durante 48 horas si se trata de muestras no invasivas y al menos 4 días si son invasivas. Los medios de cultivo para anaerobios se incuban durante 5-7 días. Sin embargo, este tiempo de incubación varía según el tipo de muestra y los microorganismos patógenos que se sospechan. Los medios líquidos se incuban durante al menos 4 días. Si se observa turbidez en los medios líquidos, se realiza un subcultivo en medios sólidos, sobre todo si en las placas originales no se visualiza crecimiento o si la muestra se ha inoculado en ese medio líquido únicamente.

Interpretación de los resultados Los cultivos cualitativos evalúan la microbiota presente en las heridas con infección clínica o que no cicatrizan bien. Los cultivos cuantitativos proporcionan información sobre la densidad o carga bacteriana de la herida. Es un hecho confirmado que la probabilidad de infección aumenta a medida que lo hace la carga bacteriana. Los resultados de la tinción, especialmente si la muestra se considera crítica, se deben informar. Por su parte, cualquier aislamiento o hallazgo que pueda tener significado clínico también debe ser informado. En muestras de buena calidad, cuando los microorganismos revelados en la tinción de Gram concuerdan con los aislados en el 178

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cultivo, se valora el aislamiento de hasta tres patógenos potenciales, que se identifican en género y especie, y se determina su sensibilidad a antimicrobianos. Se valora siempre el crecimiento de microorganismos patógenos, como P aeruginosa, S. aureus, Streptococcuspyogenes, H influenzae, etc. El aislamiento de enterobacterias y de otros bacilos Gram negativos no fermentadores se considera significativo cuando se aísla un número de especies ~ 3, siempre que la tinción de Gram indique que es una muestra de buena calidad. Cuando se aíslan en un número> 3, se informan como flora mixta. El aislamiento de estafilococos coagulasa negativos tiene valor microbiológico en las muestras en las que se aíslan en cultivo puro, especialmente en muestras invasivas cuando la tinción de Gram sugiere su presencia o asociadas a implantes de materiales protésicos y en muestras de enfermos inmunodeprimidos. El aislamiento de estreptococos del grupo viridans y de Enterococcus spp se considera significativo cuando se aíslan de muestras invasivas en cultivo puro y con tinción de Gram indicativa. El aislamiento de bacilos Gram positivos en cultivo tiene valor si se aíslan en muestras de localizaciones anatómicas habitualmente estériles o en muestras invasivas. A su vez, el aislamiento de levaduras se considera mi crobiota comensal, aunque se valoran los aislamientos en cultivo puro y en muestras de localizaciones anatómicas estériles.

Los resultados de la tinción, especialmente si la muestra se considera crítica, deben informarse.

EXUDADOS DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR: EXUDADOS FARíNGEOS Y NASOFARíNGEOS Los procesos infecciosos de las vías respiratorias superiores constituyen la causa más frecuente de consulta en la práctica clínica diari a. En España, casi el 30% de las consultas médicas relacionadas con la infección respiratoria se deben a resfriados ye120 0/ 0 a faringitis. Las vías altas o superiores incluyen nasofaringe y orofaringe, laringe, epiglotis, oído externo y medio y senos paranasales; y las vías bajas o inferiores incluyen todas las estructuras de la parte posterior a la laringe. Existen microorganismos que pertenecen a la microbiota normal de las vías respiratorias superiores.

Exudados faríngeos La faringitis aguda causada por S. pyogenes produce odinofagia (dolor de garganta), fiebre, cefalea (dolor de cabeza), náuseas, vómitos y exudado amigdalar. Sin embargo, si la sintomatología es a causa de un virus u otras bacterias, resulta muy inespecífica. Los factores epidemiológicos que sugieren una infección por estreptococos son la edad entre 5-15 años, presentación en invierno o principios de primavera y antecedentes de contacto previo con otro paciente infectado por S. pyogenes. La faringitis infecciosa puede estar causada por diversos microorganismos. S. pyo genes es la bacteria responsable del 20-40% de los episodios de faringitis aguda en la edad pediátrica y del 2-26 % de los casos en la edad adulta. Otros estreptococos ~-hemolíticos (grupos C y G) también se han asociado a brotes de faringitis. Otras faringitis bacterianas no estreptocócicas incluyen microorganismos como Arcanobacterium haemolyticum, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma pneumoniae, Corynebacterium diphteriae, etc. Por otra parte, los virus son la causa más frecuente de faringitis infecciosa aguda, sobre todo los virus respiratorios como rinovirus, adenovirus, virus respiratorio sincitial, influenza y parainfluenza y coronavirus.

La faringitis es la inflamación o infección de la faringe o el área periamigdalar y es uno de los motivos más frecuentes de consulta médica y prescripción de antibióticos. La técnica de referencia para el diagnóstico del exudado faringoamigdalar en bacterias es el cultivo en el laboratorio.

Recogida de la muestra La técnica de referencia para realizar el diagnóstico etiológico del exudado faringoamigdalar en bacterias es el cultivo en el laboratorio. La muestra debe obtenerse lo antes posible tras la aparición de los síntomas y previam ente a la instauración del tratamiento antibiótico, y recogerla con hisopos o torundas de dacrón o alginato cálcico. 179

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Con la ayuda de un depresor lingual, se inmoviliza la lengua y se realiza la toma del área amigdalar y faringe posterior, así como de cualquier zona inflamada o ulcerada. Es muy importante evitar rozar la torunda con zonas que puedan estar contaminadas con flora epitelial, tanto antes como después de la toma, pues podría producirse el sobrecrecimiento de estos microorganismos y enmascarar los verdaderos patógenos. Una vez se ha tomado la muestra, la torunda se introduce en un tubo con medio de transporte (Stuart-Am ies).

Transporte, conservación y procesamiento de la muestra en el laboratorio de microbiología La muestra se debe remitir lo más rápidamente posible al laboratorio tras su obtención. Se conserva un máximo de 24 horas a temperatura ambiente. Como todas las muestras, debe estar correctamente identificada, acompañada de un formulario de petición o mediante petición por vía telemática. Se debe comprobar siempre que el contenedor de la muestra sea el adecuado y que cuente con medio de transporte oportuno. La torunda que contiene la muestra se inocula en una placa de agar sangre (agar con sangre de carnero al 5 %) mediante rotaciones repetidas de la torunda para asegurar el depósito de toda la muestra sobre la superficie del agar. A continuación, se extiende la muestra con un asa estéril por el resto de la placa para obtener colonias aisladas. La placa de agar sangre se incuba en una estufa a 35 -37°C con un 50/0 de dióxido de carbono (C0 2 ) , preferentemente en atmósfera anaerobia, durante 48 horas. Una alternativa a este procedimiento es realizar el cultivo en medio de agar sangre selectivo (agar sangre con ácido nalidíxico y colistina). En caso de sospecha de infección por N gonorrhoeae, los medios de cultivo utilizados serán enriquecidos y selectivos (ThayerMartin, Martin-Lewis, New York City, VCA). Todos estos medios poseen antibióticos (vancomicina, trimetroprima, colistina, nistatina) que inhiben el crecimiento de la microbiota normal. Estas placas deben incubarse a 35-37 oC en atmósfera aerobia con un 5 0/0 de CO 2 durante 72 horas.

Técnicas de diagnóstico rápido Debido al tiempo prolongado de cultivo, que retrasaba el diagnóstico de s. pyogen es, se han desarrollado técnicas para el diagnóstico más rápido. Un grupo de las técnicas basadas en la detección del antígeno de s. pyogenes presenta la inestimable ven taja de la disponibilidad del resultado en el mismo momento de la consulta. Se basan en la detección del carbohidrato de la pared celular mediante técnicas de inmunoensayo, más sensibles que otras pruebas, que consisten en técnicas de aglutinación con látex. Otro tipo de técnicas se centra en la detección de ácidos nucleicos, bien mediante la aplicación de sondas de ADN, que detectan secuencias específicas de ARN ribosómico con el empleo de quimioluminiscencia, o mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La sensibilidad y especificidad de las sondas de ADN es del 86-95 y 95 -1000/0, respectivamente, mientras que las que se atribuyen a la PCR son del 93 y 98 0/0, respectivamente. La obt ención de más de una torunda aum entará la posibilidad de detecció n de ciertos microorganismos.

Exudados nasofaríngeos La obtención de muestras de exudado nasofaríngeo mediante aspirado o lavado o con torundas nasofaríngeas (esta última menos recomendada) es la técnica de elección para el diagnóstico de las infecciones causadas por ciertos microorganismos como Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae, Corynebacterium diphteriae y virus respiratorios causantes de laringitis, laringotraqueítis y epiglotitis. Además, también se pueden obtener para el estudio de los portadores de s. aureus y Neisseria meningitidis.

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Recogida de la muestra

¿ Para qué sirv e el uso de anti -

Las muestras que se recogen mediante estas técnicas, para obtener una mayor rentabilidad diagnóstica de virus respiratorios, deben contener el mayor número posible de células epiteliales, que son las que fundamentalmente mantienen la replicación vírica. Las muestras de torunda o hisopo nasofaríngeo se obtienen introduciendo el dispositivo en el conducto nasofaríngeo hasta alcanzar un punto donde se produzca una resistencia. En ese momento, se debe rotar el hisopo varias veces para impregnar bien de material mucoso y posteriormente se introduce en un medio para su transporte al laboratorio de microbiología. En cambio, la mejor opción es la recogida de muestras mediante aspirado o lavado nasofaríngeo porque incrementa la rentabilidad diagnóstica. Para la recogida de este tipo de muestras, se debe pasar un catéter de succión estéril o un tubo de teflón e in troducirlo por la nasofaringe hasta encontrar resistencia. Entonces, se retira el catéter 1-2 cm y se procede a la succión y aspiración de la muestra, que se deposita en un contenedor estéril o en un recipiente con medio de transporte específico para virus. Una vez recogida la muestra, ésta se debe enviar inmediatamente al laboratorio de microbiología.

biót ico en m edio de tran sporte de un exudado nasofaríngeo?

Conservación, transporte y procesamiento de la muestra Las muestras de exudado nasofaríngeo se pueden conservar a 4 oC durante un máximo de 72 horas. Si no es posible cumplir ese plazo, se deben congelar a - 70 oC hasta su procesamiento. Conviene usar un medio de transporte específico para virus que generalmente consiste en una solución salina con pH neutro con estabilizadores de proteínas (seroalbúmina) y con antibióticos, para disminuir en lo posible el sobre crecimiento de bacterias comensales. Una vez en disposición de trabajar con la muestra y según la sospecha diagnóstica previa, se procede a la práctica de las técnicas de identificación apropiadas para cada germen patógeno. En el caso de sospecha de B. pertussis, la técnica de elección en la actualidad es la PCR sobre el producto aspirado. Para el diagnóstico de virus se pueden utilizar técnicas de PCR o de inmunofluorescencia. Si la muestra se envía a un laboratorio de referencia, habitualmente se suelen inocular algunas gotas en distintas líneas celulares para realizar el cultivo de virus. En algunos casos, como el virus respiratorio sincitial, existen técnicas de detección rápida que revelan antígenos específicos víricos y poseen una gran sensibilidad y especificidad. El hallazgo de otras bacterias se realiza mediante cultivo en medios adecuados. Para el diagnóstico de pacientes portadores de s. aureus y N meningitidis, se debe realizar el cultivo de sus muestras en los medios adecuados para confirmar el diagnóstico de dichos microorganismos.

__ EXUDADOS OCULARES La infección ocular es una afección relevante en los países industrializados, sobre todo por el auge del herpes y por el aumento de las complicaciones infecciosas asociadas a intervenciones quirúrgicas, así como al uso de lentes de contacto. Las manifestaciones clínicas provocadas por estas infecciones son a menudo inespecíficas, por lo que el diagnóstico microbiológico es muy importante para lograr el establecimiento del tratamiento adecuado. Sin embargo, es un hecho demostrado el bajo ren dimiento de las muestras clínicas oculares, sobre todo por el pequeño volumen de material que puede obtenerse. En este caso, además, es necesario el empleo de medios de transporte adecuados que eviten la dilución excesiva, la deshidratación o la pérdida total de la muestra. En algunos casos es necesaria la recogida y el procesami ento de la muestra in situ.

Cab e señala r el bajo ren dimi en t o de las mu est r as clín icas oc ulares, f und am ent alm ent e por el pequ eño volume n de m ate rial que se ob tie ne , además de la necesid ad de m edi os de t ra nsport e adecu ado s qu e evi te n la diluci ón excesiva, la deshidrat aci ó n o l a pérd ida t ot a l d e la m uest r a.

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Tipos más importantes de Lesiones oculares Conjuntivitis La infección de la conjuntiva es uno de los motivos más frecuentes de consulta médica. Actualmente la etiología vírica es la más frecuente, seguida por la bacteriana. La conjuntivitis vírica tiene un curso autolimitado en la mayoría de los casos, cuyas causas más frecuentes son adenovirus, virus respiratorios y virus del grupo herpes. La conjuntivitis bacteriana puede clasificarse en hiperaguda, aguda, crónica y causada por Chla mydia. La infección aguda es la más frecuente y su origen se relaciona sobre todo con S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes y H influenzae. El microorganismo N gonorrhoeae es la causa más frecuente de la forma hiperaguda, que se considera una entidad rara en la actualidad.

Queratitis Sólo se debe tomar una muestra ocuLar para estudio microbiológico cuando la ulceración sea profunda, la inflamación sea significativa, el infiltradose extienda a la profundidad del estroma, la úlcera sea crónica o se sospeche queratitis fúngica, ameb iana o micobacteriana.

Es una infección del epitelio de la córnea y, en ocasiones, de otras de sus capas. La amplia utilización de lentes de contacto, junto con la cirugía no invasiva de la córnea, han supuesto un cambio en la epidemiología de esta infección, ya que la queratitis es ahora seis veces más frecuente con las lentes de contacto. La mayoría de las queratitis adquiridas en la comunidad se resuelven con tratamiento empírico, pues las características clínicas permiten adivinar su etiología en la mayoría de los casos. La mayoría de las queratitis infecciosas están causadas por bacterias, sobre todo cocos grampositivos, seguidas de enterobacterias y Pseudomonas spp . La incidencia de queratitis por Acanthamoeba y por hongos es baja.

Endoftalmitis Se trata de una inflamación de tejidos y acumulación de fluidos intraoculares. Los microorganismos pueden alcanzar el globo ocular por inoculación directa o por diseminación hematógena. La endoftalmitis posquirúrgica es la más frecuente y constituye hasta un 70% de todas las formas de endoftalmitis. Los microorganismos más comunes en las formas agudas son estafilococos coagulasa negativos, seguidos de S. aureus y S. pneumoniae. En las formas tardías, los microorganismos más frecuentemente im plicados son Propionibacterium acnes y otras micobacterias atípicas. Las endoftalmitis pos traumáticas están causadas sobre todo por Bacillus cereus.

Recogida de la muestra

¿Cuál es la temperatura ideal de transporte para las mue stras oculares?

Para recoger el exudado se frota la conjuntiva tarsal con un escobillón de dacrón o alginato cálcico conservado en el medio de transporte adecuado. Si la mucosa está seca, hay que empapar la torunda en algún tipo de caldo con tripticasa de soja antes de pro ceder a la toma. Si se sospecha infección por Chlamydia o virus, se debe tomar una to runda adicional y conservar la muestra en el medio de transporte específico. Para la toma de una muestra con raspado de la córnea se emplean diferentes instrumentos, como hojas de bisturí por el extremo no cortante, espátulas de Kimura u hojas de Bard-Parker. Se debe raspar 'tanto el fondo de la úlcera como los bordes. En la mayoría de los hospitales, el técnico de laboratorio se desplaza a la consulta de oftal mología con los medios de cultivo para realizar la siembra in situ. Si la infección no responde al tratamiento o si los cultivos resultan negativos y continúa la sospecha clínica, está indicada la realización de una biopsia corneal, En casos de lente de contacto, su cultivo se realizará tras incubar 18-24 horas la lente en caldo de tioglicolato y posterior subcultivo. Las muestras para el diagnóstico microbiológico de humor vítreo deben obtenerse mediante aspiración con jeringa en el quirófano o por vitrectomía y lavado para evitar tracciones vítreas .

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Transporte y conservación de la muestra En general, para el transporte de las muestras se recomienda la utilización de medios como el de Stuart-Amies y la conservación a 4-8 oC hasta su procesamiento en el laboratorio de microbiología. Para el raspado corneal existe la opción de su recogida en la consulta de oftalmología (lo cual tiene varios inconvenientes) o la utili zación de medios de transporte, con lo que se obtiene un rendimiento similar al de las pruebas.

Procesamiento de la muestra en el Laboratorio de microbiología Los exudados de la conjuntiva se inoculan directamente en medios sólidos , mientras que para las muestras de córnea o de humor vítreo debe emplearse también un caldo de enriquecimiento (BHI o tioglicolato). Si se ha empleado un caldo como medio de transporte, éste debe homogeneizarse en vórtex antes de inocularlo en los medios sólidos. En el caso de utilizar la lente intraocular, se debe homogeneizar en vórtex durante al menos 10 minutos. Los hongos pueden diagnosticarse mediante preparación en 'fresco de hidróxido de potasio (KOH), tinción de Ciemsa o calcoflúor, con una sensibilidad que varía entre el 50-800/0. Si existe sospecha clínica de queratitis por Acanthamoeba, se debe realizar un examen en fresco del raspado o biopsia corneal, cultivo en medio de PACE o PCR específica para Acanthamoeba. En caso de sospecha de infección por Chlamydia, se realizará inmunofluorescencia directa, pruebas de detección de antígenos o PC R. Los medios de cultivo sólidos deben incluir agar sangre de' carnero al 5 % Y agar chocolate, incubados ambos a 37°C en atmósfera aerobia con un 5 % de CO 2 y agar McConkey a 37 oC en atmósfera aerobia. Si se trata de una conjuntivitis hiperaguda o en un recién nacido, se debe sembrar parte de la muestra también en medio selectivo, para la búsqueda de gonococo (agarThayer-Martin, Martin-Lewis, New York City o VCA), e incubar a 37°C en atmósfera aerobia con un 100/0 de CO 2 • Ante la sospecha de infección fúngica, se siembra en agar Sabouraud y se incuba a 25-30 oC. El resto de muestras debe inocularse en caldo de enriquecimiento a 37 oC incubado durante un mínimo de 5 días (BHI, tioglicolato).

La tinción de Gram tiene una sensibilidad baja en los raspados corneales (30-60 0/01, así como en las muestras de humor vítreo.

EXUDADOS ÓTICOS: OíDO EXTERNO Y OíDO MEDIO La otitis es una inflamación del oído (del con ducto auditivo externo o medio) y está producida más frecuentemente por infecciones bacterianas. Se considera que la otitis media aguda (OMA) es una de las patologías más frecuentes en niños.

Etiología La otitis externa es la infección del conducto auditivo externo, habitualmente causada por humedad excesiva, aunque también puede ser el resultado de un traumatismo o de alteraciones dermatológicas. Las causas más frecuentes de otitis externa son S. aureus, S. pyogenes, R aeruginosa o, si la infección es de etiología fúngica, Aspergillus spp. La otitis media se asocia a la presencia de líquido en el conducto auditivo medio y se relaciona con la presencia de otorrea. Existen tres microorganismos que representan aproximadamente el 80% de las causas de otitis media: S. pneumoniae, H influenzae y M catarrhalis. Los neumococos son responsables del 25-500/0 de los casos, seguidos de H influenzae en un 15-30%. Otras bacterias causantes de otitis media pueden ser S. aureusy S pyogenes. Sin embargo, la coinfecci ón con virus se observa en el 30-400/0 de los casos, aunque la proporción de otitis media de etiología vírica exclusivamente es de menos del 100/0.

Las causas más frecuentes de

otitis externa son 5. aureus, 5. pyogenes, P aeruginosa, o si la infección es de etiología fún gica, Aspergillus spp. La otitis media suele estar provocada por 5. pneumoniae, H. influenzae y M. ca tarrha lis.

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Recogida de La muestra Si se trata de una otitis externa, se toma la muestra del conducto auditivo externo mediante una torunda. Si se trata de un forúnculo, debe realizarse mediante aspiración o desbridamiento quirúrgico. Para el estudio de otitis de causa fúngica, la muestra debe obtenerse por raspado del canal ótico. La mejor manera de obtener una buena muestra para el diagnóstico microbiológico de la otitis media es mediante timpanocentesis. Sin embargo, si existe una perforación timpánica, se puede obtener el exudado o pus mediante una torunda, con la precaución de evitar la contaminación epitelial. Para ello se debe efectuar una limpieza previa con una torunda empapada en solución salina antes de la toma de la muestra.

Transporte y conservación de La muestra Como se ha descrito en otros casos, las muestras deben transportarse de forma rápida para que su procesamiento sea adecuado. Las muestras obtenidas con torunda deben guardarse en un medio de transporte (Stuart-Amies) y se pueden mantener a temperatura ambiente durante 48 horas como máximo. Los raspados para cultivo de hongos se trasportan en recipiente estéril y se pueden mantener un máximo de 2 horas a temperatura ambiente antes de su procesamiento. Si se va a prolongar el tiempo de espera, es necesario refrigerarlos a 4 oC. El resto de muestras líquidas deben refrigerarse a 4 oC si no se van a procesar en las 2 horas siguientes.

Procesamiento de la muestra Para muestras con torunda, ésta se inocula en el agar rotando la superficie de la torunda sobre el primer cuadrante de la placa y, a continuación, se extiende la muestra con un asa estéril por el resto de la placa. Si se trata de muestras líquidas, habrá que depositar 3-4 gotas en la superficie del agar y extenderlas con el asa estéril. Para las pruebas de ambas otitis, externa y media, se deben utilizar placas de agar sangre y agar chocolate incubadas en atmósfera aerobia a 37°C con So/o de CO 2 , así como agar McConkey, caldo de tioglicolato y agar Sabouraud (ante la sospecha de otitis fúngica) incubados en aerobiosis a 37 oC. Si se sospecha la presencia de anaerobios, se debe emplear un agar selectivo y no selectivo para anaerobios (agar Schaedler y Schaedler con neomicina y vancomicina, respectivamente), que se incubará durante al menos S días en una atmósfera anaerobia a 37 oC.

EXUDADOS GENITALES: EXUDADO URETRAL, EXUDADO VAGINAL, EXUDADO ENDOCERVICAL y EXUDADO BALANOPREPUCIAL

La enfermedad de transmisión sexual (ETS) más frecuente en el mundo es la que provoca el

virus del papiloma humano.

Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) son un grupo de infecciones muy prevalentes en todo el mundo, y se comunican unos 3S0 millones de casos nuevos por año en adultos entre lS-49 años. Por microorganismos patógenos, 90 millones corresponden a infección por Chlamydia trachomatis y unos 63 millones a N gonorrhoeae. Por otro lado, los casos nuevos de infección por Treponema pallidum (sífilis) suponen unos 13 millones al año y se dan unos 20 millones de casos de infecciones por el virus del herpes simple (VHS). Sin embargo, la ETS más frecuente en el mundo es la que provoca el virus del papiloma humano, con 270 millones de casos anuales. Por último, Trichomonas vaginalis supone unos 170 millones de nuevos casos al año. En las ETS siempre se deben tener en cuenta los principios generales de la recogida de muestras. En general, se emplean torundas de dacrón (sirven para detectar C. trachomatis, Mycoplasma y VHS) con medio de transporte del tipo Stuart-Amies. Se recomienda la inoculación directa de las muestras en los medios de cultivo, incluso en la misma consulta donde se obtienen.

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Tipos de muestras más frecuentes

Exudado uretral La muestra debe obtenerse preferentemente a primera hora de la mañana. De lo contrario, se debe indicar al paciente que no orine en las 2 horas previas a la toma de la muestra. Se deben utilizar torundas finas con varilla de alambre, de alginato cálcico o dacrón, y emplear un medio de transporte tipo Stuart-Amies. Si existe abundante secreción, se debe recoger con la torunda; sin embargo, lo más frecuente es que la secreción sea escasa o nula, por lo que se debe introducir la torunda suavemente por la uretra hasta unos 2 cm con un movimiento de rotación y meter la muestra en el medio de transporte. Se deben obtener al menos dos torundas, una de ellas para realizar la tinción de Gram.

¿Cuál es la temperatura de conservación y transporte de los exudados genitales?, ¿se pueden congelar?

Exudado vaginal yendocervical La muestra se obtiene con la ayuda de un espéculo sin utilizar lubricante. Con una torunda, se debe obtener el exudado presente o, en su defecto, muestra del fondo de saco vaginal posterior. Conviene obtener la muestra del endocérvix (e introducir la torunda en el conducto endocervical), sobre todo si se sospecha-infección por N gonorrhoeae o C. trachomatis. Así, se deben obtener dos torundas de exudado vaginal y otras dos de exudado endocervical.

Exudado balanoprepucial En este caso, se debe recoger la muestra con una torunda e introducirla en el medio de transporte, sobre todo para el estudio de Candida spp y S. agalactiae. La toma se realiza frotando la torunda en el surco balanoprepucial.

Transporte, conservación y procesamiento de las muestras El transporte de las muestras al laboratorio debe realizarse lo antes posible, sobre todo ante la sospecha de infección por N gonorrhoeae. Además, la temperatura de conservación y transporte ha de ser de 35-37 vC o a temperatura ambiente, aunque en ciertos estudios recientes se destaca que N gonorrhoeae puede resistir la temperatura de refrigeración. Una vez en el laboratorio de microbiología, las muestras se siembran en los medios adecuados. Primero se cultivan en los medios más generales, como agar chocolate, posteriormente en los medios más selectivos, como agar Thayer-Martin (o similares) y agar Sabouraud o agar Candida (medio cromogénico). Además de la tinción de Gram, se deben cultivar en medio Roiron o Diamond para la búsqueda de T. vaginalisy emplear una galería para búsqueda de micoplasmas en el caso de muestras uretrales y endocervicales. Las muestras se deben incubar durante al menos 48 horas en una atmósfera aerobia a 37°C.

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No debo olvidar que... •

Las muestras para el estudio microbiológico se deben enviar lo antes posible al laboratorio [< 2 horas) o conservarlas de manera adecuada .

•

Para la obtenc ión de las muestras en el diagnóstico de infección de piel y tejidos blandos se ha de tener cuidado con la microbiota normal de la piel, que puede contaminar y distorsionar el resultado del cultivo .

•

Tr ansportar las muestras en me dio de tra nsporte adecuado , como el medio de Stuart -Amies [en muestras tomadas con to runda).

•

Las muestras nasofaríngeas so n las m ás adecua das para el diagnóstico de

B. pertussis.

• 5treptoeoeeus pyogenes es el más frecuente product or de faringitis bacter iana en personas de 5-15 años y en los meses de invie rno y primavera. •

La enfermedad de t ransm isión sexual más frecuente en el m undo es la que provoca el vi r us del papil om a humano .

Caso práctico

Preguntas de repaso 1. En la correcta obtención de una muestra clínica para el diagnóstico microbiológico, señalar la respuesta falsa: a. Debe ser representativa del proceso infeccioso . b. Las m uestras no relacionad as di rectamen te con la infección no poseen nunca ren di miento microbiológico . c. Deben obtene rse de forma adecuad a. d. La cantidad de muestra debe ser adecuada pa ra las pet ici ones qu e se realiz an.

J avier es un pacien te joven, de 23 años de edad , que acude a la consulta de su médico de familia por haber t enido un contacto sexual de riesgo sin la utilización de medidas de barrera. A los pocos días manifiesta febrícula , malestar general y escalofríos , que trata con paracetamol y ceden en poco tiempo . ¿Qué le puede ocurrir? ¿Cómo averiguarlo?

2. Señalar cuál de los siguientes microorganismos se considera microbiota normal de la piel: a.

5taphyloeoeeus aureus .

b. Eseheriehia eolio c. d.

Baeteroides fragilis . Mieroeoeeus spp.

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,

Indice de contenidos •

Introducción

•

Características generales de los diferentes tipos de muestras

•

Prevención de errores más comunes en la manipulación de las muestras

•

Sustancias analizables a partir de cada muestra

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INTRODUCCiÓN Durante el proceso de caracterización del cuad ro patológico de un paciente, la clave no siempre se encuentra en muestras fáciles de extraer o en procedimientos que resultan sencillos de realizar. En muchas ocasiones es necesario el uso de técnicas invasivas y a menudo cruentas, que suponen un riesgo para el paciente y que condicionan la muestra, ya que hace prácticamente imposible o muy dificultoso repetirla. Por lo tanto, el estudio de este tipo de muestras cuenta con la complejidad añadida de la manipulación de especímenes que posiblemente no puedan volver recogerse, por lo que se debe afinar en todo el proceso de laboratorio.

• • • • •

Líquido Líquido Líquido Líquido Líquido

cefalorraquídeo ascítico articular pleural pericárdico

CARACTERíSTICAS GENERALES DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MUESTRAS Líquido cefalorraquídeo El líquido cefalorraquídeo (LCR) se encuentra en el espacio subaracnoideo, entre la membrana aracnoides y la piamadre, en los ventrículos del cerebro y en las cisternas que lo rodean. El LCR se produce en su mayor parte en los plexos coroideos, por ultrafiltración a través de la pared capilar coroidea y secreción po r el epitelio coroideo yextracoroideo del cerebro, así como en el revestimiento ependimario de los ventrículos y en el espacio cerebral subaracnoideo. Ante la sospecha o evidencia de síndrome me níngeo se impone la realización de una punción lumbar para extraer y analizar el LCR. Se efectúa con el paciente en decúbito lateral y las piernas flexionadas, en posición fetal (Fig. 16-1). Si no es posible para el paciente adoptar esta postura, la punción lumbar se realiza sentado, a pesar de que en esta posición aumenta el riesgo de enclavamiento y se impide la correcta medición de la presión del LCR. Una anestesia de la piel y los planos profundos con lidocaína o procaína hace la punción menos traumática y, por lo general, suele emplearse en niños. Se localiza el espacio interespinoso que queda entre una línea horizontal imaginaria que une el punto más elevado de ambas crestas ilíacas y que suele corresponder con L4-L5. Se introduce el trócar con el fiador y el bisel paralelo al raquis (para evitar un desgarro dural y el derrame posterior de líquido, minimizando el síndrome pospunción lumbar) a una profundidad variable entre 4 y 8 cm, perpendicularmente a la superficie de la espalda y ligeramente inclinado en sentido cefálico. Al atravesar el ligamento interespinoso y la duramadre, se reconoce una resistencia que les es propia, indicando que la extremidad de la aguja ya está en el espacio meníngeo. Se retira lentamente el fiador, se mide la presión y se recoge el LCR que gotea.

Médula LCR Duramadre

----~~ I

Espacio epidural Punción lumbar

~

Filo terminal Sacro

--~.... \

... Figura 16-1. Punción lumbar. LCR: líquido cefalorraquídeo.

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El análisis deL LCR es fundamental para el diagnóstico de los procesos patológ icos relacionados con el encéfa lo, la médula y las meninges, así como con los procesos hemorrágicos producidos en las cavidades que lo contien en.

Tras realizar la punción Lumbar se recogen tres tubos estériles de forma secuencial para bioquímica, microbio logía y citología.

Tras recolectar el LCR, se extrae el trócar con el fiador incorporado y se cubre la zona con apósitos estériles.

Examen macroscópico El LCR normal es claro y transparente como agua de roca. Como consecuencia de diversas enfermedades puede presentar otros aspectos (turbio, hemorrágico, xantocrómico, hemático, etc. ):

Aspecto turbio. El LCR aparece turbio cuando el recuento de leucocitos es superior a 400/flL o se encuentra una proteinorraquia > 150 mg /dL. El aspecto turbio se asocia también con la presencia de bacterias y altas concentraciones de lípidos. • Aspecto hemorrágico. Puede originarse en una hemorragia subaracnoidea o bien tras una punción traumática. Se pueden distinguir ambas porque en la punción traumática se produce un aclaramiento progresivo a medida que se extrae la muestra (restar un leucocito por cada 700 hematíes en el caso de una punción traumática) . • Aspecto xantocrómico. La xantocromía se produce por lisis de eritrocitos y hace referencia a la coloración rosada, anaranjada o amarillenta de sobrenadantes del LCR. Aparece entre 2 y 4 horas después de producirse una hemorragia subaracnoidea.

Líquido ascítico El LCR normaL es claro y transparente como agua de roca.

La muestra de líquido ascítico se deposita en tres tubos para el estudio bioquímico, microbiológico [recipi ente estéril) y citológico.

El peritoneo es la membrana serosa más extensa del organismo. El peritoneo parietal reviste las paredes de la cavidad parietal y el peritoneo visceral recubre las vísceras abdominales. El espacio situado entre estas dos capas o cavidad peritoneal contiene el líquido peritoneal. La cavidad peritoneal es un espacio potencial completamente cerrado en el hombre, mientras que en la mujer comunica con el exterior a través de las trompas de Falopio, el útero y la vagina. Con una secreción normal de líquido permite los movimientos de las vísceras abdominales con la respiración, el peristaltismo o los cambios de posición (Fig. 16-2). Se denomina ascitis a la acumulación patológica de líquido (> 25 mL) dentro de la cavidad peritoneal (Fig. 16-3) Y la etiología más frecuente es la cirrosis hepática. La obtención del espécimen para su estudio se realiza por paracentesis con jeringa heparinizada y se deposita en tres tubos para el estudio bioquímico, microbiológico (recipiente estéril) y citológico.

Examen macroscópico El líquido ascítico puede presentar distinta apariencia macroscópica: • • • • •

Normal: transparente o levemente amarillento. Turbio o purulento: abundante número de leucocitos. Hemorrágico: sugiere la presencia de hematíes. Lechoso: indica alta concentración de triglicéridos. Verdoso: puede indicar contaminación biliar.

Líquido articular

... Figura 16-2. Peritoneo.

Prácticamente todas las articulaciones de las extremidades son de tipo sinovial o diartrodial y poseen una cavidad articular que contiene líquido y permite la movilidad articular. La cara interna de la cápsula articular o sinovial es una condensación de tejido conectivo y forma un saco que encierra espacio sinovial.

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En condiciones normales, el espacio sinovial tiene una pequeña cantidad de fluido sumamente viscoso o líquido sinovial, que desempeña las siguientes funciones: • Lubrica las superficies de rozamiento. • Aporta nutrientes al cartílago articular. El líquido sinovial deriva del plasma sanguíneo, que se filtra a través de los capilares sinoviales difundiendo hasta la cavidad articular, a la que se añaden algunas sustancias sintetizadas en la membrana sinovial com o proteínas y ácido hialurónico, macromoléculas complejas que le confieren viscosidad. La toma de muestras se realiza por artrocentesis (Fig. 16-4). Para el estudio de cristales se utiliza un tubo con heparina sódica como anticoagulante. La inflamación y otros procesos patológicos que afectan a la membrana sinovial alteran la composición, el contenido celular y las características físicas del líquido sinovial. El estudio de este líquido tiene un lugar importante en el diagnóstico de las enfermedades articulares, junto con la valoració n de los signos y síntomas articulares, las exploraciones radiológicas y otras pruebas de laboratorio (químicas, histológicas y serológicas). Principalmente se observan las variaciones que hay en el líquido sinovial en la artritis.

... Figura 16-3. Ascitis.

Examen macroscópico El líquido sinoviaL deriva del plasma sanguíneo y la toma de muestras se realiza por pu nción de la articulación.

En condiciones normales es un líquido claro, que puede tener un tono amarillento. Otros tonos distintos de este color pueden ayudar a diferenciar: • • • •

Coloración clara y aspecto turbio: se asocia a aumento celular. Turbio y purulento: se asocia a artritis sépticas bacterianas. Turbio y de aspecto lechoso: se asocia a artritis gotosas. Color rojizo: hemorragia de la cavidad art icular (hemartrosis, característica de hemofilia), toma de muestra con punción traumática.

La viscosidad y filancia del líquido sinovial normal lo describe como muy viscoso y pegajoso al tacto. Cuando hay inflamación de la articulación, por la destrucción de ácido hialurónico por la hialuronidasa de los leucocitos, se origina un descenso apreciable de la viscosidad. Al echar una gota de líquido sinovial en un tubo con ácido acético diluido se observa un coágulo o precipitado de mucina, firme en condiciones normales, debido a la precipitación del ácido hialurónico. Este fenómeno está disminuido en la artrosis , gota e infecciones articulares. • Figura 16-4. Artrocentesis de rodilla.

líquido pleural La pleura es una membrana serosa transparente que rodea a cada pulmón y consta de dos capas (Fig. 16-5 ): • Pleura visceral: se adhiere a la superficie del pulmón. • Pleura parietal: reviste la superficie interna de la pared torácica. En el espacio situado entre ambas pleuras (cavidad pleural) se encuentra el líquido pleural. En condiciones normales, el espacio pleural contiene de 1 a 10 mL de fluido . Se considera patológico un volumen de líquido pleural que pueda detectarse radiológicamente, lo que se denomina derrame pleural (Fig. 16-6). Este derrame puede ser un trasudado o un exudado. Los trasudados son consecuencia de un aumento de la presión microvascular o de la disminución de la presión oncótica de la sangre o de la combinación de ambos factores . Sus características son:

Pleura parietal (hoja externa)

•

Figura 16-5. Pleura.

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Determinación

Prueba

Gast r ina en ayunas

La gastrina aumenta en obs t rucciones y neofo r macione s

Hip ersecreción ácida

Se esti m ula o inhi be el estómago con prot eínas o se cretina

Hollander

Est imula ción gástrica co n insu lina y determ inación de posterior de la conce nt ración de glucosa

Tejidos Las muestras de tejidos se de ben colocar en un recipiente estéril de boca ancha.

La toma de muestras de tejidos de forma quirúrgica tiene un considerable riesgo para el paciente y es muy costosa; por lo tanto, corresponde al cirujano tomar una muestra suficiente para el estudio microbiológico e histopatológico. Las torundas suelen ser poco adecuadas en este caso. Las muestras que se obtienen quirúrgicamente para el cultivo deben colocarse en un recipiente estéril de boca ancha. El cirujano debería separar asépticamente el tejido en el quirófano y remitirlo para análisis histopatológico y microbiológico. Los tejidos que se reciben en el laboratorio deben examinarse antes de ser analizados. El tejido se corta muy fino con tijeras estériles y se deja en un mortero, donde se mezcla con un abrasivo también estéril en el caldo para hacer una suspensión al 20%. Esta suspensión se usa para inyectar todo el medio de cultivo necesario y después se deja refrigerar durante por lo menos dos semanas antes de desecharlo.

PREVENCiÓN DE ERRORES MÁS COMUNES EN LA MANIPULACiÓN DE LAS MUESTRAS En l a man ipulación de mu estras biológicas se pueden cometer diversos errores durante las fases preanálit ica, a na l ít ica y postana lítica.

Para la manipulación de las muestras analíticas hay que tomar ciertas precauciones un iversales, que recomiendan el uso cuidadoso de los fluidos corporales de todos los pacientes. Estas pautas están destinadas a minimizar las exposiciones laborales de los trabajadores del laboratorio. Las precauciones incluyen la utilización de las barreras de protección adecuadas: guantes, batas largas, mascarillas y gafas, que deben usarse para prevenir la exposición de la piel y las membranas mucosas cuando se prevé el con tacto con sangre u otros fluidos corporales. Cada laboratorio debe tener actualizados los procedimientos y seguir las directrices adecuadas para tratar con estos materiales biológicos potencialmente peligrosos. Los errores en la manipulación pueden ser innumerables, por lo que aquí se citan algunos de los más importantes y frecuentes según el tipo de muestra.

Líquido cefalorraquídeo • Líquido hemorrágico por punción traumática. Se produce un aclaramiento progresivo a medida que se extrae la muestra (restar un leucocito por cada 700 hematíes en el caso de una punción traumática). • Imposibilidad de realizar la prueba por dificultades técnicas. • Cantidad de líquido escasa para realizar determinaciones analíticas. • Recogida en contenedores inadecuados. • Errores en la identificación de la muestra. • Retraso en el procesamiento de las muestras. • Preparación deficiente de la persona que realiza el recuento celular microscópico. • Errores en controles de calidad y calibración del analizador. • Fallos en la emisión de informes. • No existe comunicación de los valores críticos. 194

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Líquido ascítico • • • • • • • • • •

Dificultades en la realización de paracentesis. Paracentesis traumática con líquido de aspecto hemorrágico. Cantidad de líquido escasa para realizar determinaciones analíticas. Recogida en contenedores inadecuados. Errores en la identificación de la muestra. Retraso en el procesamiento de las muestras. Preparación deficiente de la persona que realiza el recuento celular microscópico. Errores en los controles de calidad y la calibración del analizador. Fallos en la emisión de los informes. No existe comunicación de los valores críticos.

Líquido articuLar • • • • •

Artrocentesis traumática, que produce un líq uido hemorrágico. Recogida en contenedores inadecuados. Errores en la identificación de la muestra. Preparación deficiente de la persona que realiza el recuento celular microscópico. Fallos en la emisión de informes.

Líquido pLeuraL • Toracocentesis traumática, que produce un aclaramiento progresivo durante la obtención del líquido. • Recogida de la muestra en contenedores ina decuados. • Errores en la identificación de la muestra. • Retraso en el procesamiento de las muestras. • Preparación deficiente de la persona que realiza el recuento celular microscópico. • Errores en los controles de calidad y la calibración del analizador. • Fallos en la emisión de informes. • No existe comunicación de los valores críticos.

Líquido pericárdico • • • • • • • •

Punción traumática. Error en la recogida de la muestra en contenedores inadecuados. Error en la identificación de la muestra. Retraso en el procesamiento de las muestras. Preparación deficiente de la persona que realiza el recuento celular microscópico. Errores en los controles de calidad y la calibración del analizador. Fallos en la emisión de informes. No existe comunicación de los valores críticos.

Absceso • • • • •

Dificultades en la recogida de la muestra. Muestra insuficiente. Uso de contenedores inadecuados. Errores en la identificación de la muestra. Errores analíticos.

Jugo gástrico • Dificultades en el sondaje del paciente. • Técnica traumática.

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• • • •

Recogida incorrecta de la muestra. Errores de identificación. Retrasos en el procesamiento de la muestra. Errores en la fase analítica.

Tejidos • • • •

e

Toma de muestra dificultosa. Contenedor inadecuado. Retraso en el procesamiento de la muestra. Errores en la fase analítica.

SUSTANCIAS ANALIZABLES A PARTIR DE CADA MUESTRA En este apartado se describen las que se consideran más importantes.

Líquido cefalorraquídeo • • • •

Recuento celular. Glucosa, proteínas, LDH. Adenosina desaminasa (ADA). Cultivo.

Líquido ascítico • Recuen to celular. • Gradiente de albúmina. • Proteínas, glucosa, LD H, amilasa.

Líquido articular • • • •

Recuento celular. Glucosa, proteínas. Cristales. Cultivo.

Líquido pleural • Recuento celular. • pH. • Glucosa, amilasa, proteínas, LDH. • ADA. • Cultivo.

Líquido pericárdico • Recuen to celular. • Glucosa.

Absceso • Recuen to celular. • Cultivo.

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Jugo gástrico • pH. • Acidez total. • Recuento celular. • Cultivo.

Tejidos • Análisis histopatológico. • Análisis microbiológico.

No debo olvidar que... •

El anál isis del líquido cefalorraquídeo es fundamental para el diagnósti de los procesos patológicos relacionados con el encéfalo, la médula y las meninges, así como con los procesos he morrágicos que se producen en las cavidades que lo contienen .

•

Se denomina ascitis a la ac umulación patológica de líquido [> 25 mL) dent ro de la cavida d peritoneal , cuya eti olo gía más frecuente es la ci rrosis hepática.

•

Se considera patológico un volumen de líquido pleural que pueda ser detectado ra dio lógica me nte , que se co nvie r te en lo que se denomina derrame pLeural.

•

La acumulación de líquido debida a un fallo en los mecanismos de formaci ón o re absorción entre las dos hoj as del perica rdi o se de nom ina derrame pericárdico .

•

En la manipulación de muestras biológ icas se pueden cometer diversos erro res durante las fases preanálitica , analítica y postanalítica .

Preguntas de repaso

Caso práctico

1. La presencia de un líquido cefalorraquídeo turbio no se asocia con: a. Presencia de bacterias . b. Concentración elevada de lípidos. c. Elevada proteinorraquia. d. Líquido de características normales.

2. La causa más frecuente de ascitis es:

Llaman al laboratorio a las doce de la noche de un día del mes de agosto del servicio de urgencias del hospital para comentar que tienen un paciente con sospecha de una posible meningitis. La persona que se pone en contacto con el laboratorio es un residente interno de medicina de familia y no sabe qué tiene que hacer para la recogida y envío de la muestra de líquido cefalorraquídeo al laboratorio. ¿Qué instrucciones hay que darle?

a. Insuficiencia cardíaca. b. Apendicitis aguda. c. Cáncer de páncreas . d. Cir rosis hepática.

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Técnicas generales de la oratorio

Capítulo 17. Clasificación de materiales, equipos y reactivos Capítulo 18. Análisis de muestras biológicas humanas Capítulo 19. Realización de disolucion es y diluciones Capítulo 20. Aplicación de procedimie ntos de separación de sustancias Capítulo 21. Control de calidad de los procedim ient os de medida Capítulo 22. Realización de técnicas de microscopia y digitalización de imágenes

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Indice de contenidos • Introducción • Tipos de materiales y utilización • Limpieza, desinfección y esterilización de material de laboratorio • El agua del laboratorio Reactivos químicos en el laboratorio clínico • Equipos básicos utilizados en el laboratorio • Procedimientos normalizados de trabajo

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Clasificación de materiales, equipos y reactivos

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El agua es uno de los principales componentes que se emplean en la mayoría de las aplicaciones que se llevan a cabo en los laboratorios. Es muy importante utilizar agua de muy buena calidad.

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La precisión analítica depende de un circuito de purificación de agua bien diseñado y cuidado con un mantenimiento regular, por lo que se aconseja monitorizar la pureza del agua y verificar los resultados del sistema periódicamente, así como disponer de un mecanismo de dispensación de agua de fácil acceso. Los sistemas que más se utilizan en los laboratorios clínicos para obtener agua de calidad combinan la desionización, la destilación y, en muchos casos, la ósmosis inversa, de forma que se garantiza la eliminación de los iones y las sustancias orgánicas no volátiles. Cuando se combinan diferentes técnicas se asegura la máxima eliminación de impurezas, por ejemplo para la eliminación en el agua ultrapura de partículas y bacterias se utiliza la ósmosis inversa, o ultrafiltración, mientras que para la eliminación de endotoxinas se emplea el intercambio iónico o la ultrafiltración. Es muy importante, como ya se ha mencionado, que el sistema de producción de agua ultrapura disponga de un depósito de almacenamiento de agua, ya que así se podrá mantener su calidad de forma constante. Esto es posible si el equipo dispone de filtros y se hace recircular el agua de forma periódica utilizando tecnologías de purificación, como la adsorción e intercambio iónico y la fotooxidación ultravioleta a 254 nm de longitud de onda para evitar y minimizar el crecimiento bacteriano. Las pruebas bacterianas demuestran que el agua ultrapura contiene valores inferiores a 1 unidad formadora de colonias (UFC)/lOmL.

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REACTIVOS QUíMICOS EN EL LABORATORIO CLíNICO

Un reactivo es cualquier sustancia que, por interacción con otra en una reacción, da lugar a otras sustancias, de propiedades, características y conformación distinta, denominadas producto de reacción o simplemente producto, que la mayor parte de las veces es precisamente lo que se mide en una valoración determinada. Las pruebas de laboratorio son muy diversas y muchas de realización compleja (con gran variedad en las técnicas, sensibilidad de las pruebas, etc.), por lo que todos los reactivos, sustancias químicas, preparados y materiales que intervienen en ensayos y valoraciones deben ser de gran calidad y pureza. En el laboratorio se dispone de distintos tipos de reactivos (sólidos, liofilizados, líquidos y disoluciones preparadas ya comercializadas). Todos los envases que contienen reactivos o soluciones preparadas deben etiquetarse adecuadamente con el nombre del reactivo, los datos de referencia si los tienen, la fórmula química o si contiene ingredientes especiales, el grado de pureza, la fecha de envasado, la fecha de caducidad, el número de lote, las condiciones de almacenamiento y, si es el caso, su clasificación como material peligroso (Fig. 17-1). El Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Sustancias Químicas (GHS/SGA), la Organización Internacional del Trabajo (OIT), la Organi-

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Figura 17-1. Pictograma de peligro-

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Peligroso para el medio ambiente

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Técnicas generales de laboratorio

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Módulo 11

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zación de Cooperación y Desarrollo Económicos (OCDE) y la Organización de las Naciones Unidas (ONU) tienen como objetivo brindar un marco sólido para los países que no cuentan con reglamentación sobre identificación y comunicación de peligros de sustancias químicas, y armonizar los sistemas nacionales para mejorar la seguridad en el uso, manejo y disposición de las sustancias químicas. Hay que considerar que la buena comunicación de peligros y la información contribuye a la reducción de los riesgos para el medio ambiente y la salud.

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Es muy importante conocer bien las condiciones óptimas de almacenamiento de los reactivos, el buen uso dentro del laboratorio e interpretar bien el etiquetado.

EQUIPOS BÁSICOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO

Los instrumentos que existen en los laboratorios clínicos se pueden clasificar en dos tipos: equipamiento básico, también llamado auxiliar o complementario. Incluye, por ejemplo, las neveras, congeladores, baños de agua, centrífugas, destaponadares, balanzas, agitadores, microscopios, estufas o pH-metros, entre otros; y equipamiento específico, que puede alcanzar diversos grados de automatización. Existen analizadores muy manejables, con lo que la participación del usuario es mayor, y otros equipos con una alta complejidad y automatización que requieren técnicos expertos. Los avances tecnológicos que se aplican al diagnóstico dan cuenta de la enorme capacidad de dar respuesta a las necesidades clínicas, cada vez más exigentes y complejas, con la utilización de instrumentación de alta tecnología y, en algunos casos, con una sofisticada automatización. Es fundamental la fiabilidad y practicabilidad del analizador y de los demás equipos para cubrir las necesidades del laboratorio. Por ello se deben tener muy en cuenta las prestaciones de los dispositivos, como la velocidad de procesamiento, el tratamiento de la información, la integración y conectividad de los sistemas automáticos del laboratorio, la capacidad para gran volumen de muestras, la precisión y exactitud de los medidores, el mantenimiento programable, el control de calidad interno, la lectura de códigos de barras, la carga de muestras por racks de tubo primario y secundario, el tiempo de procesamiento prioritario de muestras urgentes, los programas informáticos para el inventario de reactivos actualizado en tiempo real, las diluciones automáticas de muestras, las dimensiones, la versatilidad, etcétera. Los analizadores o equipos específicos más comunes que se pueden encontrar en los laboratorios de diagnóstico clínico son:

• Analizadores de química clínica: son sistemas que permiten detectar y cuantificar la gran mayoría de las magnitudes bioquímicas mediante espectrometría, potenciometría, turbidimetría, colorimetría, análisis enzimáticos y otros métodos que se emplean con menor frecuencia. • Analizadores de inmunoquímica: son sistemas que permiten detectar y cuantificar la gran mayoría de las magnitudes de los inmunoensayos. Los métodos que más se utilizan son quimioluminiscencia, enzimoinmunoensayo, turbidimetría, nefelometría, técnicas radioinmunológicas, fluoroinmunológicas, inmunocitoquímicas y otras técnicas como la inmunodifusión radiaL • Analizadores de hemostasia o coagulómetros: se usan para evaluar la capacidad del sistema de coagulación y miden el tiempo necesario para que ocurra la formación de redes de fibrina bajo condiciones cuidadosamente controladas. Los métodos más extendidos son los cromogénicos o colorimétricos, coagulativos y turbidimétricos. • Contadores hematológicos: permiten el recuento celular de la serie blanca, así como su fórmula; los recuentos de la serie roja, reticulocitos, y plaquetas en sangre total. La gran mayoría de los contadores ut ilizan técnicas de citometría de flujo (p. ej., la basolobularidad o densidad nuclear) y métodos calorimétricos (p. ej., citoquímica de peroxidasa). • Equipos de medida de gases en sangre y cooximetría: permiten medir parámetros como el pH, las presiones de pC0 2 y p02' que ayudan al diagnóstico del equi-

¿Cómo se podría clasificar a un analizador de inmunoquímica desde el punto de vista de su función?

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Clasificación de materiales, equipos

y reactivos

librio ácido-base, y el estado de oxigenación de los pacientes. También permiten medir electrolitos: Na', K, Ca'", Cl- -; metabolitos: lactato, glucosa; parámetros hematológicos: hematocrito, y oximetría: tHb, 02Hb, HHb, COHb, MetHb, Bil. La gran mayoría de los equipos miden mediante conductímetros, potenciómetros y amperómetros, y métodos espectrofotométricos. • Analizadores para la identificación bacteriana: son sistemas que permiten identificar la bacteria en cuestión y en muchos casos determinan la concentración inhibitoria mínima (CIM), para verificar el grado de resistencia frente a los antibióticos. En la gran mayoría de los equipamientos se utilizan técnicas eromógenicas y fluorogénicas, que se basan en la medida de la turbidez, los cambios de color y las variaciones en la fluorescencia. Actualmente se está implantando con éxito la metodología de espectrometría de masas para la identificación bacteriana.

¿Recuerda al menos tres datos que debe contener el inventario de equipos?

Otros equipos que se encuentran en los laboratorios son agitadores magnéticos y mecánicos, autoclaves, baños, estufas, dosificadores, placas calefactoras, pH-metros, etcétera.

Otros sistemas específicos que se encuentran en muchos laboratorios clínicos son, por ejemplo, lector para tiras de orina y sedimento, sistema para lectura de velocidad de sedimentación, citómetro de flujo, termociclador, secuenciador para ADN, extractores de ácidos nucleicos, espectrofotómetros, HPLC, etcétera. Entre los equipamientos básicos más frecuentes y de mayor uso dentro del laboratorio destacan:

• Balanzas analíticas. Las que se emplean en el laboratorio son en general de dos tipos: la balanza de doble platillo para pesar grandes cantidades y la balanza deprecisión, con correcciones de tara y para pesadas menores, en la que se admite un margen de error mínimo. • Microscopios. Son sistemas de lentes que se utilizan para ampliar la imagen de los objetos. En los laboratorios clínicos se emplean para observar células, microorganismos o cristales en una gran variedad de muestras biológicas. Con frecuencia se utilizan métodos de contraste para las observaciones microscópicas, entre las que la microscopia de campo oscuro, contraste de fase y fluorescencia son las más representativas. • Centrífugas. Son instrumentos destinados a acelerar la separación gravitacional mediante fuerza centrífuga de las sustancias o muestras que difieren en su masa. En el laboratorio clínico se utilizan para obtener suero o plasma a partir de sangre total, y también se usan para contabilizar la concentración de células en sangre total, así como en otras muestras biológicas. Los componentes principales de una centrífuga son el rotor, el sistema de transmisión, el motor, la tapadera y el cuadro o tacómetro (para seleccionar tiempo y velocidad de giro en unidades de revoluciones por minuto). Para un correcto funcionamiento de las centrífugas es importante cargar adecuadamente las muestras, ya que una carga descompensada puede ocasionar que las centrífugas vibren durante el proceso de centrifugación y que el rotor sufra grandes daños. • Cabinas de bioseguridad. Las cabinas de seguridad biológicas que se encuentran en los laboratorios se pueden clasificar según la protección que procuran. Frente a agentes patógenos se utilizan cabinas de extracción de clase 1, que tienen su frontal abierto y el técnico puede llevar a cabo manipulaciones de agentes biológicos de riesgo bajo o moderado. Las cabinas de seguridad de clase 11, además de proporcionar el mismo nivel de protección al técnico que las cabinas de clase 1, también protegen la esterilidad del material que hay en su interior. Por último, las cabinas de seguridad de clase III son cerradas, y para trabajar en su interior sólo se puede acceder mediante unos puertos con guantes, de modo que se garantiza la completa protección del operario. Es importante tener actualizado un registro de inventario, donde se debe incluir la identificación del equipo, el número de serie, su nombre y descripción, la fecha de recepción, la fecha de puesta en marcha, la ubicación en el laboratorio y cualquier

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Módulo 11

Técn icas genera les de labor at ori o

otro dato de interés. De igual forma, también es útil un registro del mantenimiento, donde se hacen constar las reparaciones de los equipos, la fecha de intervención, el motivo o causa de la avería y cualquier otro registro de calibración y control posterior.

P OCEDI lE TOS

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Todos los PNT se deben documentary estar dispon ibles en el puesto de trabajo. y cualquier modificación deberá comuni carse y documentarse.

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El procedimiento normalizado de trabajo (PNT) se define como el proceso mediante el cual se establecen las pautas y accio nes que permiten ejecutar cualquier procesado, directo o indirecto, y las medidas que se deben tomar de forma estandarizada. En este caso, se refiere a los procesos analíticos de los laboratorios clínicos. Se debe asegurar que todo el personal que interviene en las tareas del proceso en cuestión sabe perfectamente qué es lo que tiene que hacer, cuándo hacerlo y cómo realizarlo. Un laboratorio de análisis clínicos debe contar con unos PNT escritos y aprobados por la dirección, y siempre con el fin de garantizar la calidad e integridad de los datos que obtiene el laboratorio. La planificación, estructuración y desarrollo de las actividades de un laboratorio cuando utiliza PNT aporta numerosas ventajas. Se indican algunas de ellas a continuación: • • • • •

Garantiza el registro de los datos. Mejora la organización y ejecución de las actividades en el laboratorio. Facilita el seguimiento y control de las operaciones que se realizan. Facilita el trabajo al personal técnico, administrativo o facultativo. Proporciona uniformidad en los procesos pre analíticos, analíticos y postanalíticos, y disminuye la casuística de errores en el ma nejo yen los resultados. • Proporciona datos comparativos dentro del propio laboratorio como para contrastar con otros laboratorios. • Facilita la formación de nuevo personal, así com o las rotaciones en las funciones profes ionales dentro de las distintas secciones del laboratorio. Para una mayor estandarización es aconsejable que se elaboren PNT para las siguientes categorías de actividades del laboratorio: • Productos de ensayo y de referencia: recepción, identificación, etiquetado, manipulación, muestreo y almacenamiento. Materiales, equipos o analizadores: uso, mantenimiento, validación, limpieza, seguridad y calibración y copias de seguridad. • Reactivos: preparación y etiquetado. • Calibración de las distintas metodologías. • Mantenimiento de registros: informes, almacenamiento y recuperación de datos (codificación de estudios, recopilación de datos, preparación de informes, tratamiento de datos), que hoy día incluye el uso de sistemas informatizados. • Procedimientos de garantía de calidad: actuación del personal de garantía de calidad en la planificación, programación, realización, documentación y redacción de informes de auditoría.

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Capítulo 17

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Clasificación de materiales, equipos ,

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No debo olvidar que... •

Hay que conocer y diferenciar claramente los conceptos de limpieza, desinfección y esterilización, y según el material del laboratorio a tratar, saber cuáles son los métodos más apropiados. Siempre hay que recordar que la limpieza es obligatoria, y después se puede optar por una desinfección o esterilización de mayor o menor intensidad.

•

En el laboratorio es muy importante usar reactivos de muy buena calidad. respetar las condiciones para su almacenamiento y tener muy bien identificados todos los reactivos med iante etiquetas infor m at ivas.

•

El reactivo más común en los laboratorios es el agua, considerada el disolvente universal y, por lo tanto, es vital el uso de agua de muy buena calidad para evitar interferencias y sesgos en los resultados.

•

Cualquier material y equipamiento en el laboratorio debe estar bien limpio, ordenado y clasificado. Todo instrumental que lo necesite debe estar bien calibrado y no se debe olvidar su buen uso y mantenimiento.

•

El proceso normalizado de trabajo es una herramienta de normalización que ayuda a establecer una base estandarizada para todos los procesos y procedimientos del laboratorio y apoya la tarea del personal.

Caso práctico

Preguntas de repaso 1. ¿Con qué equipo o instrumental se mide indirectamente en el agua el contenido en sales? a. b. c. d.

Espectrofotómetro. Conductímetro. pH-metro. Potenciómetro.

Hoyes su primer día de trabajo en el laboratorio central, el nuevo técnico está muy tranquilo, ya que el supervisor le ha facilitado el procedimiento normalizado de trabajo (PNT) de su puesto de trabajo en la sección de urgencias. Describir cuáles son las tareas rutinarias más comunes que tienen que estar detalladas en el PNT.

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BIBLIOGRAFíA

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Material complementario

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y reactivos

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Tipos de balanzas

La balanza es el instrumento que se emplea para determinar la masa de una sustanc ia mediante el proceso de pesada, que consiste en comparar la masa que se quiere determinar con una masa patrón.

La balanza es el instrumento que se emplea para medir la masa de un cuerpo o sustancia y para conocer su peso, puesto que entre la masa y el peso existe una relación bien definida. Para dar una medida, se compara la masa que se quiere conocer de una sustancia determinada con la masa de un patrón de referencia (interno o externo), ambos en las mismas condiciones de aceleración de gravedad. El proceso de comparar masas se denomina pesada. En el laboratorio clínico la balanza se utiliza para pesar compuestos sólido s, para preparar mezclas de componentes en proporciones predefinidas, para determinar densidades y pesos específicos o para efectuar actividades de control de calidad, como la calibración de las pipetas. Por su mecanismo de funcionamiento, las balanzas se pueden clasificar en dos gran des grupos: mecánicas y electrónicas. Dentro de cada grupo las hay de distintos tipos y pueden tener uno o dos platillos. En la actualidad, las balanzas que más se utilizan son las electrónicas y con un solo platillo, por lo que este apartado se centrará en los tipos de balanzas electrónicas más comunes en los laboratorios. Una clasificación metrológica para las balanzas de laboratorio considera los dos parámetros más importantes: la carga máxima (Máx.) y el valor de la división digital (dd), los cuales permiten el cálculo de división de escala (n) mediante la siguiente fórmula: n

= Máx./dd

La Organización Internacional de Metrología Legal (OIML) acepta la siguiente convención:

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Técnicas generales de laboratorio

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1. Ultramicroanalíticas dd = O, l11g = 0,0000001 g. 2. Microanalíticas dd = l11g = 0,000001 g. 3. Semimicroanalíticas dd = 0,01 mg = 0,0000 1 g. 4. Balanzas analíticas (rnacroanalíticas) dd = 0, 1 mg 5. Balanzas de precisión dd = 1 mg.

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0,0001 g.

Se consideran balanzas de precisión las que tienen una división de escala entre 1g Y O,OOlg (es decir, de cero a tres decimales). Este tipo de balanzas son las que se encuentran con mayor frecuencia en el laboratorio clínico. Entre estas balanzas más comunes de precisión (Fig. 19-1 ), se distinguen las que tienen una dd de 0,1 g Y las balanzas analíticas, en la imagen con una dd de 0,0001 g. Cuando se realiza una pesada de un compuesto sólido, el recipiente más adecuado para pesar es un vidrio de reloj.

Balanza electrónica de precisión

Balanza electrónica analítica

Vidrio de reloj

... Figura 19-1. Tipos de balanzas.

Manejo de las balanzas Las balanzas de precisión y las analíticas son instrumentos de medición de máxima precisión, por lo que es necesario seguir unas normas generales para asegurar su correcto funcionamiento y mantenimiento. La ubicación de la balanza puede condicionar la exactitud y reproducibilidad de los resultados de pesada. Es necesario colocar las balanzas fuera de las zonas de paso y de corriente de aire. Además, deben estar protegidas de la luz solar directa, apoyadas en superficies perfectamente horizontales sin vibraciones y alejadas de radiaciones electromagnéticas. Las condiciones ambientales de medida han de ser constantes: la temperatura y la humedad relativa del aire son factores que afectan a la pesada. Hay que adoptar una serie de cuidados básicos:

Las balanzas electrón icas de precisión son las que más se utilizan en el laboratorio clínico y tienen una división de escala ent re 1 y O, OO1 g.

• Comprobar que el plato y la cámara de medida estén limpios. Limpiar la balanza antes y después de usarla (con un pincel suave). • Verificar siempre la nivelación de la balanza. • Conectar y esperar un tiempo de calentamiento. Si se deja en el modo «stand by», se evitan posteriores esperas. • Usar siempre un recipiente de pesada limpio, seco y lo más ligero posible, adaptado a la sustancia que se quiere pesar. • El frasco y su contenido deben estar a la misma temperatura ambiente de la cámara de medida. Las diferencias de temperatura causan corrientes de aire que desestabilizan la balanza. • En una balanza analítica, hay que evitar el contacto directo con los dedos al poner o sacar los recipientes de pesada de la cámara de medida y colocarlos en el centro del plato. • Verificar que la pantalla indica cero al empezar la operación de pesada. Verificar la tara de la balanza si es necesario. • Calibrar la balanza a menudo. Las balanzas analíticas de precisión que utilizan patrones internos pueden calibrarse automáticamente. • No trasladar la balanza, salvo que sea estrictamente necesario y, en ese caso seguir las instrucciones del fabricante. • Para el buen funcionamiento de la balanza hay que ubicarla en el lugar adecuado, mantener las condiciones ambientales lo más constantes posible y procurar una serie de cuidados básicos. Para pesar una sustancia en una balanza de precisión, se han de seguir los siguientes pasos: • Asegurarse de que la balanza esté nivelada. • Encender el equipo.

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c::======.=======-=====-=-===-=====-.:..:====-======-=Capítulo 19

Realización de disoluciones y diluciones

• Colocar un recipiente de pesada (preferentemente un vidrio de reloj) en el centro del plato. El tamaño y volumen del recipiente han de ser adecuados a la cantidad de sustancia que se quiere pesar. • Poner a cero la balanza, verificar la tara. • Ir añadiendo con una cucharilla la cantidad de sustancia hasta alcanzar el peso deseado. • Apagar la balanza y limpiar el plato con un pincel.

e Se puede determinar el volumen de muestras sólidas, líquidas o gaseosas.

La unidad en el SI para medir el volumen es el metro cúbico lrn-l, pero en el aboratorio clínico se utilizan más las unidades de capacidad, el [LL el mililitro lrnl.l y el microlitro (IJL): 1 L = 1.000 mL y 1 mL = 1.000 IJL. La equivalencia entre estas un idades es, asimismo,1 L= 1 drrr'y 1 mL= 1crrr' .

MEDIDAS DE VOLUMEN MEDIANTE MATERIAL VOLUMÉTRICO

Concepto de volumen y unidades de medida El volumen de una muestra es la cantidad de espacio que ocupa. La unidad de volumen en el SI es el metro cúbico (m'). Es una unidad derivada, resultante de multiplicar otras tres unidades básicas: longitud (m) X altura (m) X anchura (m) correspondientes al volumen de un sólido cuadrangular de 1 m de lado. El volumen de 1 m' como unidad se utiliza poco en los laboratorios, es más común emplear algunos submúltiplos como el decímetro cúbico (drn"), que equivale a 10-3 m', el centímetro cúbico (cm "), equivalente a 10- 6 rn' y el milímetro cúbico (m m"), 10-9 m'. En el laboratorio, para medir el volumen de líquidos y gases, se elige el soporte según la capacidad del recipiente que los va a contener y se utilizan para ello las unidades de capacidad. La unidad que se toma como referencia es el litro (L), que corresponde al volumen que ocupa 1 kg de agua destilada a 4 oC y 1 atmósfera de presión. También se utilizan múltiplos y submúltiplos (igual que se ilustra en la tabla 19-1 para las medidas de masa). Los submúltiplos que más se emplean en el laboratorio clínico son el mililitro (mL), equivalente a 10-3 L Yel microlitro (ul.), que equivale a 10- 6 L. Existe una equivalencia entre las unidades de volumen y las de capacidad:

• 1 L = 1 dm 3 = 0,001 m 3 • • 1 mL = 1 cm' = 0,001 drn'. Un cm' también se suele abreviar como 1 ce. Para la conversión de unas unidades en otras, es útil recordar que las medidas de volumen van de 1.000 en 1.000 unidades y las de capacidad de lOen 10.

Tipos de material volumétrico

Probeta

Bureta

Pipeta

250 mL 25 -c

15 mL

15 mL

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Matraz Erlenmeyer 250 mL 25 -c

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Matraz aforado

Vaso de precipitados

250 mL 25 -c

250 mL 25 -c

Figura 19-2. Material volumétrico.

La medida del volumen se lleva a cabo con una serie de utensilios denominados, de forma genérica, materiales volumétricos. En este apartado se considera el material clásico y se dejan para el apartado siguien te los sistem as automáticos. Estos recipientes suele ser de plástico o de vidrio y la mayoría se fabrica con una marca incorporada que indica su capacidad y la temperatura que se recomienda para su uti lización, a la que han sido calibrados. Además, la mayoría presenta también indicaciones intermedias de volumen que determinan la escala de medida. Según el tipo de recipiente, la medida del volumen es más o menos exacta. Por ejemplo, un vaso de precipitados o un matraz Erlenmeyer tienen una graduación poco precisa, que indica aproximadamente el volumen que contienen. Sin embargo, una probeta, una pipeta o una bureta tienen una graduación mucho más precisa. La medición exacta del volumen se lleva a cabo con matraces aforados, pipetas y buretas. El resto del material se deja para medidas que requieren menos exactitud o como simples recipientes contenedores. Desde un punto de vista operacional, el material volumétrico se puede dividir en dos grupos: instrumentos para contener e instrumentos para medir y transferir líquidos (Fig. 19-2).

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Módulo 11

Técnicas generales de laboratorio

Utensilios para contener líquidos Se utilizan para pesar sustancias, calentar, preparar disoluciones o contener líquidos. Son utensilios poco exactos para medir y sólo se deberían emplear para obtener una medida aproximada. Vasos de precipitados: son recipientes cilín dricos de boca ancha. Los volúmenes más corrientes son: 50, 100, 250, 500, 1.000 Y2.000 mL. Matraces Erlenmeyer: son recipientes cónicos con la boca más estrecha que los vasos de precipitados, de modo que se reduce la posibilidad de evaporación de los líquidos que contienen. Los volúmenes que más se ut ilizan son los mismos que para los vasos de precipitados.

Los vasos de precipitados y los matra ces Erlenmeyer permiten medir volúmenes sólo de forma muy aproximada. Su uso más extendido es como recipientes contenedores .

Utensilios para medir y transferir líquidos Suelen estar calibrados por el fabricante, quien indica su precisión en función de la división de escala y la temperatura a la cual su funcionam iento es óptimo. Los principales utensilios para medir el volumen son: probetas, matraces aforados, buretas y pipetas. Probetas: son recipientes cilíndricos altos, que se utilizan ampliamente en ellaboratorio para medir volúmenes. Con ellas se pueden realizar medidas con mayor precisión que con los vasos de precipitados y los matraces Erlenmeyer, pero no son tan precisas como las pipetas, las buretas y los matraces aforados. Se suelen utilizar para medir volúmenes mayores de 15 mL. Se prefieren las probetas de vidrio a las de plástico, puesto que permiten obtener medidas más fiables. Cuando se introduce un líquido en una pro beta, la superficie del líquido se hace curva, cóncava o convexa según su densidad. A ésta se la llama curvatura menisco. La línea tangente al menisco es el punto de referenc ia para la lectura del volumen, con el fin de evitar errores de paralaje. Matraces aforados: son recipientes redondeados y con una boca alargada y muy estrecha que se utilizan para medir volúmenes con gran exactitud. Se utilizan habitualmente en la preparación de disoluciones para enrasar el volumen final con el disolvente. El volumen exacto del matraz viene definido por una marca llamada línea de aforo. Igual que en otros recipientes, en la línea de aforo el líquido produce menisco, cuya tangente es la línea de lectura del volumen. Los volúmenes más comunes son: 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1.000 mL. Buretas: son tubos de vidrio graduados, de diámetro interno uniforme, con un sistema de cierre con llave giratoria que permite dispensar un volumen exacto seleccionado de líquido. Presentan varias divisiones de escala y se puede trabajar con una precisión de 0,01 mL. El llenado de Ía bureta se realiza vertiendo el líquido desde la parte superior de la misma llave cerrada. La medición se realiza leyendo el nivel de la base del menisco antes y después de verter la solución. Para no cometer errores en el volumen que se dispensa, con una bureta se debe comprobar la ausencia de burbujas de aire y vaciar lentamente para reducir el efecto de adhesión del líquido a la pared (se recomienda no exceder de 20 mL/ min). Pipetas: se utilizan cuando es necesario medir pequeños volúmenes de líquidos, normalmente menores de 25 mL, con una buena precisión. Hay varios tipos de pipetas; las más comunes son las graduadas y las volumétricas y para su manejo es necesario el uso de sistemas de aspiración (o propipetas), bien manuales o automáticos:

¿Cuantos tipos de cuerda?

• Pipetas graduadas: permiten medir y dispens ar volúmenes variables de líquidos según su capacidad. Se utilizan igualmente pip etas de vidrio o de plástico, estas últimas más comunes en el laboratorio clínico porque son estériles y desechables. Los volúmenes más comunes son: 1,5,10 Y 15mL. • Pipetas volumétricas o aforadas: se utilizan para transferir un volumen único de líquido (indicado por la línea de aforo) cuando se requiere una gran exactitud y precisión. Cuando se mide el volumen con una pipeta aforada, por la tensión superfi-

225

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cial que se produce, siempre queda una pequeña cantidad de líquido remanente en la punta, que nunca debe expulsarse, porque la pipeta se calibra teniéndolo en cuenta. • Pipetas de doble enrase: el volumen medido es el que se encuentra entre dos líneas de aforo. Para medir volúmenes de forma exacta es necesario utilizar buretas, pipetas y matraces aforados. Las probetas, aunque se emplean habitualmente, no son tan exactas.

Sistemas automáticos: dispensadores y pipetas Los sistemas automáticos son los dispensadores y las pipetas. Se utilizan las pipetas cuando se quieren medir y transferir volúmenes muy pequeños de líquidos con gran exactitud.

Vídeo 19-1. Utilización correcta de pipetas automáticas.

Dispensadores. Son sistemas que proporcionan repetidamente un volumen de líquido seleccionado previamente. Los dispensadores llevan incorporados adaptadores que permiten su acoplamiento a las botellas de reactivos con los diámetros de boca más extendidos. Hay una amplia gama de volúmenes de uso, los más utilizados son los de 1-15 mL. Para dispensar el volumen de líquido seleccionado, se sube el émbolo hasta el tope y se dispensa el líquido hasta bajar completamente el émbolo. Es necesario purgar de burbujas de aire del circuito para que el volumen dispensado sea el que se pretende. Se utilizan sobre todo para añadir reactivos a lotes de muestras, pero su precisión, alrededor del l So, es menor que la de las pipetas. Entre las ventajas que presentan están la rapidez de dispensación, la disminución de la probabilidad de contaminar los reactivos por no tener que pipetear repetidamente y la minimización de la exposición directa del operario a posibles sustancias nocivas. Son útiles para los reactivos de uso muy frecuente. Pipetas automáticas. Las pipetas son dispositivos de amplia utilización en los laboratorios. Se usan para medir y transvasar pequeños volúmenes de líquidos con gran exactitud. El sistema de dispensación de líquidos que más se emplea es el mecánico, aunque también se usan sistemas electrónicos. La pipeta mecánica o de pistón funciona transmitiendo la fuerza que un operador ejerce con el dedo pulgar sobre un émbolo unido a un pistón mediante un eje que se desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija, forzando un volumen predefinido de líquido hacia fuera de la pipeta. Hay pipetas de volumen fijo o variable; estas últimas son más ampliamente utilizadas, ya que permiten ajustar el volumen que se va a dispensar, dentro de un rango determinado en las especificaciones técnicas de la pipeta. El mecanismo de funcionamiento de las pipetas puede ser de desplazamiento por aire o de desplazamiento positivo. Las primeras tienen la ventaja de que presentan menor riesgo de contaminación cuando el uso es continuado, pero cuando se trabaja con volúmenes muy pequeños de líquido, no son tan precisas como las de desplazamiento positivo. Todas las pipetas automáticas disponen de puntas desechables para los distintos rangos de volumen. A menudo las puntas que se utilizan son estériles y contienen un filtro para minimizar los riesgos de contaminación de las muestras y de la pipeta. Es muy importante utilizar siempre las puntas recomendadas por el fabricante, para garantizar su ajuste perfecto al cuerpo de la pipeta y dispensar los volúmenes con la exactitud prevista para el instrumento. Para facilitar la identificación de las pipetas con el rango de volumen en el que operan se ha adoptado un código de colores. Los rangos de volumen más comunes son: 0,12,5 ul.: negro; 2-20 ul.: amarillo; 0,5-10 rL: gris; 10-100 rL: amarillo; 20-200 rL: amarillo; 100-1.000 ul.: azul y 500-5.000 uL: morado. Para el manejo adecuado de una pipeta automática, antes de su uso, hay que verificar que está calibrada y que su rango de volumen es adecuado para el trabajo que se va a realizar. La pipeta se ha de utilizar en posición vertical para eliminar la incertidumbre por variaciones mínimas en la cabeza del líquido. Las pipetas mecánicas tienen tres posiciones en el émbolo, se indican en la figura 19-3 como A, B y C. Para el manejo correcto de la pipeta se siguen los siguientes pasos:

• Seleccionar el volumen que se va a pipetear y colocar una punta nueva, ajustándola bien.

226

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Módulo 11

Técnicas generales de laboratorio ..

• Presionar el émbolo hasta el primer tope ante s de sumergir la punta de la pipeta en el líquido (posición B; Fig. 19-3 ) y, a continuación, sumergir la punta de la pipeta. • Soltar el émbolo suavemente (posición A; Fig. 19-3) para que la pipeta absorba el líquido y esperar dos segundos para asegurar que la aspiración ha sido completa. • Apoyar la punta sobre la pared del recipiente en el cual se dispensa el líquido con un ángulo de 30-45°. • Dispensar el contenido de la pipeta presionando el émbolo de forma suave pero firme, hasta el primer tope (posición B; Fig. 19-3 ). Mantener en todo momento el contacto entre la punta de la pipeta y la pare d del recipiente y frotar la punta de la pipeta para asegurar que no quede ninguna gota adherida. • Presionar el émbolo suavemente hasta el segundo tope (posición C; Fig. 19-3 ) para expulsar cualquier fracción de líquido residual de la punta. Mantener el émbolo presionando en el segundo tope , mientras se retira la pipeta del recipiente receptor. Una vez retirada la pipeta, liberar suavemente el émbolo (posición A, Fig. 19-3 ) Y desechar la punta presionando el botón de eyección.

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Posición del émbolo

•

Figura 19-3. Manejo de la pipeta

automática.

En resumen, para tomar un líquido hay que presionar con el pulgar hasta la posición

B y, a continuación, sumergir la pipeta y soltar el émbolo hasta la posición A para que el líquido ascienda por la punta (pasos 1 y 2). Para depositar el líquido en un nuevo recipiente, se sumerge la punta apoyando ligeram ente en la pared del tubo y se presiona hasta la posición B (pasos 3 y 4). El volumen residual que queda en la punta se expulsa apretando el émbolo hasta la posición C (paso 5). Finalmente, se suelta el émbolo hasta la posición A o de reposo y se desecha la punta apretando el botón de eyección (paso 6). Otros tipos de pipetas automáticas que hay disponibles en el mercado son las pipetas repetidoras, capaces de dispensar repetidamente un mismo volumen sin tener que tomar líquido cada vez, y pipetas multicanal, qu e permiten dispensar un volumen concreto de muestra al mismo tiempo en distintos recipientes.

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CÁLCULO Y PREPARACiÓN DE DISOLUCIONES

Concepto de disolución y tipos En multitud de operaciones químicas y biológicas resulta indispensable que las reacciones ocurran con sustancias en disolución. Las disoluciones (o soluciones) son mezclas homogéneas de dos sustancias o más, que se dispersan como moléculas, átomos o iones. Cualquier disolución está formada por una parte dispersa o soluto y un medio dispersante o disolvente (o solvente) . Una disolución puede estar formada por un soluto y un diluyente, o más de uno, aunque las más frecuentes son las binarias. El soluto da el nombre a la disolución y a su naturaleza, que se debe al color, el olor, el sabor y la conductividad eléctrica de la disolución. El disolvente es el medio en que se disuelve o dispersa el soluto; generalmente se encuentra en mayor proporción y marca el aspecto físico de la disolución. La concentración, cantidad de soluto que contiene una disolución, es una de las características más importantes porque determinará las propiedades físicas de la disolución. En el capítulo anterior se expusieron las distintas formas de expresar la concentración de una disolución según las unidades qu e se emplean para expresar la cantidad de soluto y de disolvente: molaridad, porcentaje (peso/volumen, peso/peso, volumen/ volumen), densidad, etcétera. Otra propiedad importante de las disoluciones es la solubilidad, que expresa la cantidad de gramos de soluto disueltos por cada 100 g de disolvente a una temperatura determinada.

Las pipetas mecánicas tienen tres posiciones del émbolo que permiten tomar y verter un volumen de líquido seleccionado previamente. Para medir y transferir volúmenes de forma exacta es fundamental manejar las pipetas adecuadamente.

Una disolución es una mezcla homogénea de dos sustancias o más. Las sustancias que se dis persan son los solutos y el medio en el que se dispersan, el di-

solvente.

Solubilidad

=

masa soluto (g)/masa disolvente (g) X 100

Una sustancia se considera insoluble cuando su solubilidad es menor a 0,1 mg de soluto por cada 100 g de disolvente.

227

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Realización de disoluciones y diluciones

CapítuLo 19

Los factores que afectan a la solubilidad son la naturaleza del soluto y del disolvente, la temperatura y la presión.

Dos características importante s de las disoluciones son la concentra ción y la soLubili dad, la cual depende de la naturaleza del soluto, de la del disolvente y de la temperatura.

• Para que una sustancia se disuelva en otra ambas deben ser semejantes a nivel molecular. Existen disolventes polares (agua, alcohol etílico, amoniaco), que constituyen disoluciones acuosas, y no polares (benceno, éter, tetracloruro de carbono). • Generalmente, un aumento de la temperatura favorece la solubilidad. • La presión tiene un efecto sólo apreciable en la solubilidad de gases. Existen diversos tipos de disoluciones y se pueden utilizar distintos criterios para clasificarlas (Tabla 19-2): • En función del estado físico se clasifican en disoluciones líquidas, sólidas y gaseosas. • Según la proporción de soluto que contienen respecto al disolvente se clasifican en diluidas, concentradas y saturadas. Algunos autores con sideran que esta clasificación no es muy adecuada, porque la cantidad de soluto que admite una disolución depende de su solubilidad a una temperatura determinada. • En función de las propiedades electroquímicas se agrupan en electrolíticas y no electrolíticas.

Las di soLuciones se pueden clasificar según diferentes crit er ios; el más común es en funció n de l estado físico, según el cual pueden ser: sólidas , líqu idas o gaseosas.

Preparación de disoluciones A la hora de preparar una disolución es muy importante prestar atención a la técnica que se va a seguir y realizar los cálculos previos de forma correcta. Las disolucio nes más habituales que se preparan en el laboratorio clínico son disoluciones de sólido en líquido y disoluciones de líquido en líquido. En la figura 19-4 se muestra un diagrama con el resumen de los pasos que se han de seguir para preparar una disolución de sólido en líquido y de líquido en líquido. Los datos de masa molecular, densidad y pureza, necesarios para realizar los cálculo s previo s, obli gatoriamente se encuentran en las etiquetas de los productos.

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)."TabLa 19-2. miROS de disoLuciones Según la proporción de soluto respectoal disolvente

Según el estadofísico de la disolución Soluto

Disolvente

Sólidas Gas

Ejemplos

Diluidas

Concentradas

Saturadas

Electrolíticas

No electrolíticas

Aleaciones metálicas lacero]

La proporción de soluto respecto a la deldisolvente es muy pequeña

La proporción de soluto respecto a la deldisolvente es alta

No admite más cantidad de soluto sin aumentar la cantidad del disolvente

Se llaman también disoluciones iónicas y presentan una apreciable conductividad eléctrica. Ejemplos: soluciones acuosas de ácidos, bases ysales

Suconductividad es prácticamente nula; no forma iones yel soluto se disgrega hastael estado molecular. Ejemplos: soluciones de alcoho l en agua, de glicerina en agua,de sacarosa

Disolución

Sólido Sólido

Amalgama [Hg más meta l! Hidrógeno ocluído [Pd y Ptl

Líq uido

Azúcar en agua

Sólido Líqu idas Gas

Alcohol en agua

Líquido

Líquido

Amoniaco en agua

Sólido

: : : Suspensiones lhurnol

Gas Líqu ido

Gas

Gaseosas

Según las propiedades electroquímicas

: : : Suspensiones [aerosoles]

Aire

228

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Técnicas generales de laboratorio

Iif.

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Sólido-líquido 250 mL de disolución de NaoH 1M

Líquido-líquido 250 mL de disolución de HN0 3 1M

Disolveren unvasode precipitados conaproximadamente "---'" 100mLde agua destilada

2

251lmL 25~C

3

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....

.... Figura 19-4. Preparación de disoluciones.

Medir 16 MI de HN0 3 al 70 %, (d = 1,41 g/mL) con una pipeta y ayuda de un pipetador automático

Pesar10 g de NaOH

2

~

Módulo 11

.

Enrasar conagua hasta 250mL en unmatraz aforado

3

Se vierte el ácido sobre unos 150 mL de agua que hay en el matraz

"---'" 250 mL 2S~C

Enrasar conaguahasta 250mL en el matraz aforado

Preparación de una disolución de sólido en líquido Cuando se prepara una disolución de sólido en líquido es importante conocer la solubilidad del compuesto en el disolvente que se elige. En ocasiones , es necesario calentarlo para favorecer la disolución. A continuación, se muestra un ejemplo para prepa rar 250 rnL de una disolución de sosa cáustica o hidróxido sódico (NaOH) 1M. Primero se calcula la cantidad de soluto (NaOH) nec esario para pr eparar 250 mL de disoluci ón de concentración 1M. Para ello, se utiliza la fórmula de la molaridad, que se ha visto en el capítulo anterior, para calcula r los m oles de soluto ne cesanos: M

=

nN (L); 1 = n/0,2 5; n

=

0,25 m oles de NaOH

¿Se debe verter el agua sobre el ácido en una disolución?

Se calcula el peso mol ecular del NaOH: 23 + 16 + 1 = 40 g/mol. Cuando se con ocen los moles, con el peso molecular, se pueden calcular los gramos de NaOH que se necesita pesar: 0,25 moles x 40 g/mol = 10 g de NaOH. A continuación, se prepara la disolución. Para ello, se pesa la sosa y se disuelve en 100 mL de agua destilada en un vaso de precipitados. Seguidamente, se vierte la disolución en un matraz aforado de 250 mL y se enrasa con agua.

Preparación de una disoLución de Líquido en Líquido Para preparar una disolución de líquido en líquido, se mide el líquido que se va a disolver con la probeta (medida aproximada) o con una pipeta (m edida más precisa) y se enrasa con el disolvente en un matraz aforado. Cuando se tiene qu e mezclar un ácido y una base, siempre se pone el ácido sobre la base, por ejemplo, cuando se trata de disolver ácido sulfúrico en agua: se añade el ácido sobre el agua, muy poco a poco, agitando para evitar elevaciones excesivas de temperatura: nunca se debe verter el agua sobre el sulfúrico. Como ejemplo de disolución líquido-líquido se puede citar la preparación de 250 mL de una disolución de ácido nítrico (H N0 3) 1M. Se dispone de una botella de ácido nítrico al 70 % (d = 1,41 g/cm 3) . Prim ero se realizan los cálculos pertinentes 229

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Para preparar una disolución es muy importante realizar de forma adecuada los cálculos previos y seguir la técnica más apropiada.

disolucione~ y diluci~nes

para saber qué cantidad de ácido nítrico es necesario tomar de la botella. Se calcula la cantidad de soluto (HN0 3) necesario para preparar 250 mL de disolución de concentración 1M. Masa molecular (HN0 3) = (1 + 14 + 16 x 3) = 63 g/mol A partir de la cantidad de HN0 3 se calcula el volumen de ácido al 700/0 que contiene la cantidad que se calcula de HN0 3 • Para preparar la disolución, se miden con una pipeta 16 mL de ácido al 700/0, a continuación se vierte agua (unos 150 mL) en un matraz aforado de 250 mL y se vierte el ácido sobre el agua. Por último, se enrasa con agua, vertida con cuidado y despacio, hasta completar los 250 mL.

e

CÁLCULO Y PREPARACiÓN DE DILUCIONES

Concepto de dilución y tipos Una dilución es la disminución de la concentración de soluto de una disolución al añadi r más disolvente. El uso de diluciones a partir de una disolución más concentrada, llamada disolución madre o stock, es una práctica muy habitual en ellaboratorio. Entre las razones que llevan al uso de diluciones se encuentra que las soluciones más concentradas se conservan mejor o que, a menudo, la cantidad de soluto que se va pesar o medir es tan pequeña que se necesita, de forma previa, preparar una disolución más concentrada. El número total de volúmenes al que se lleva un volumen determinado de disolución madre para preparar una dilución se llama factor de dilución (Fd). Por ejemplo, si se quiere llevar 10mL de una disolución de NaOH 1M a 100 mL de volumen final, el factor de dilución se calcularía: Fd = Vf (dilución) /Vi (disolución) = 100 mL /10 mL = 10 Según el patrón que se sigue del factor de dilución se consideran los siguientes tipos de diluciones:

El número de volúmenes al que se lleva un volumen determinado de disolución para preparar una dilución se denomina factor de dilución. Según el patrón que sigue el factor de dilución se obtienen diluciones seriadas, no seriadas e independientes.

• Seriadas: sucesión de diluciones, con una reducción progresiva, a intervalos regulares, de la concentración del soluto en la disolución. Las diluciones en serie se uti lizan para crear disoluciones muy diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretende dibujar una recta patrón, por ejemplo, para cuantificar una proteína. • No seriadas: sucesión de diluciones a intervalos progresivos, no regulares, en los cuales cada dilución es menos concentrada que la anterior en una proporción no conocida. • Independientes: soluciones que no tienen ningún patrón en cuanto al factor de dilución y se resuelven con la fórmula: Vinicial X C inicial = V final x C fina1 Una dilución es la disminución de la concentración de soluto de una disolución al añadir más disolvente.

Preparación de diluciones En este apartado se detallan los cálculos y el proceso que se ha de realizar para preparar los tipos de diluciones que, de forma más habitual, se llevan a cabo en el laboratorio clínico.

Diluciones seriadas Cuando se preparan diluciones seriadas se parte de una disolución madre de la que se toma un volumen determinado, para llevarlo a un volumen final establecido 230

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Módulo 11

Técnicas generales de laboratorio

y, a continuación, progresivamente, de cada dil ución que se ha realizado se toma ese mismo volumen para llevar a cabo la dilución siguiente. De esta forma el factor de dilución es el mismo en cada paso de dilución y aumenta de forma regular respecto a la disolución madre de partida. Por ejemplo: se dispone de una disolución mad re de albúmina sérica en agua a 1 mg/mL y se quieren realizar diluciones seriadas con un factor de dilución 2 hasta tener 0,12 mg/mL. El volumen final de cada dilución es de 100 ul.. Primero se calcula el volumen que se debe tomar de diso.lución madre para preparar la primera dilución que, en este caso, ya que se trata de diluciones seriadas, será el volumen que se toma de cada dilución para preparar la siguiente.

A continuación se prepara la serie de diluciones. En la figura 19-5 se muestra un esquema de la técnica para la preparación de diluciones seriadas de álbumina sérica. El factor de dilución es 2, porque cada dilución está la mitad de concentrada que la anterior. La proporción de la dilución se exp resa como 1:2. Es habitual preparar estas diluciones cuando se quiere construir una recta patrón para cuantificar una proteína. Las diluciones a menudo se expresan como una fracción: 1/10; 1/5; 1/3, donde el valor del numerador indica la proporción de solución madre respecto a la de disolución, o con dos puntos, 1:10; 1:5; 1:3, donde el primer número indica la proporción de solución madre y el segundo la de disolución. Por ejemplo, para preparar una dilución 1/10, se toma 1 parte de la solución madre y 9 partes de disolvente, siendo 9 + 1 las partes totales de disolución.

Si el factor de dilución no cambia, ¿de qué tipo de dilución se trata?

Diluciones independientes Para preparar una dilución independiente se parte de una disolución madre de concentración conocida y se quiere conocer el volum en necesario para preparar una disolución a menor concentración (dilución). Por ejemplo, se dispone de etanol absoluto (1000/0) y se quiere preparar una disolución al 70% en agua.

SO IJI disolución madre + 50 !JI agua

SO IJI dilución 1 + 50 !JI agu a

1:2

1:2

SO IJI dilución 2 + 50 !JI agua

1:2

1:4 1:8 Disolución madre Albúminasérica 1 mg/mL

Disolución 1 Albúmina sérica 0,5 mg/mL

Disolución 2 Albúmina sérica 0,25 mg/mL

Disolución 3 Albúmina sérica 0,12 mg/mL

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Figura 19-5. Preparación de dilucio-

nes seriadas.

231

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CapítuLo 19 r

Realización de disoluciones \

y diluciones

Primero se calcula el volumen de etanol absoluto que se tiene que tomar. En este caso, se puede utilizar la fórmula: V inicial x

100 0/0 = 250 mL

x

80 0/0; Vinicial = 200 mL

Luego se prepara la disolución. Para ello, se miden 200 mL de etanol absoluto en una probeta, se vierten en un matraz aforado de 250 mL y se enrasa a dicho volumen con agua destilada.

e MÉTODOS ELECTROQuíMICOS: EL PH-METRO Concepto de pH

Vídeo 19-2. Determinación del pH de una muestra.

A principios del siglo xx, un químico danés, Soren Sórensen, introdujo el concepto de pH y lo definió como una función logarítmica de la concentración de hidrogenlones:

pH

=

-log [H +]

El producto iónico del agua es la base de la escala de pH, cuyo rango es de 0-14:

A partir de aquí resultó relativamente sencillo establecer una escala de acidez: cuando el pH = 7, se considera neutro; si un pH > 7, se denomina básico; y si el . pH < 7, ácido. En esta misma época se desarrollaron los métodos electroquímicos para determinar el pH de una disolución. Las células electroquímicas consisten en dos electrodos que se insertan en una disolución y forman un circuito eléctrico, cuyo po tencial depende principalmente de la naturaleza y de la concentración de los iones presentes en la disolución, en este caso de los cationes H ". De esta manera es fácil relacionar la diferencia de potencial entre los electrodos con la concentración de hidrogeniones (H+), es decir, el valor de pH.

Medida de pH y manejo del pH-metro El pH-metro mide la diferencia de pot encia l que se ge nera en tre la concentra ción de H+ de una disolución y la de unos patrones de referencia qu e transforman esa med ida en una lectura de pH.

Los pH-metros son los equipos que se utilizan para medir el pH. En el laboratorio clínico se emplean fundamentalmente para la medida del pH de rea ctivos, disoluciones, tampones y medios de cultivo. Los pH-metros más comunes en los laboratorios tienen un electrodo combinado de vidrio selectivo para el H +y un electrodo de referencia. Los electrodos constan de una membrana delgada de vidrio que separa d os disoluciones con diferente concentración de iones de hidrógeno. A través de esta membrana se establece una diferencia de potencial que el pH-metro mide y, gracias a su calibración interna, puede traducir en una lectura de pH. El pH-metro se calibra con dos patrones de referencia de pH conocido (n o rm almente, uno de pH = 7 y otro a 4,01 ). La calidad de lo s val ores que se miden depende de las soluciones patrón con las que se calibra el equipo. En un laboratorio clínico también se utilizan los sistemas de los analizadores de gases y pH, que poseen un microelectrodo de medida de vidrio selectivo y un electrodo de referencia metálico de plata/cloruro de plata (Ag/ClAg) inmerso en una solución de clo ruro potásico (CIK). En la figura 19-6 se muestra el pH-metro y el diagrama de un electrodo combinado de vidrio con un electrodo de referencia de Ag /AgCl. El electrodo se su merge en una disolución de pH desconocido, en contacto con la membrana porosa del electrodo. El voltaje que se detecta entre los dos electrodos indica la medida de pH.

232

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Módulo 11

Técnicas generales de laboratorio

Manejo del pH-metro y cuidados A la hora de medir con el pH-metro se han de seguir los siguientes pasos: • Encender el equipo y ajustar la temperatura de medida a la temperatura ambiente. • Sacar el electrodo combinado de la solución conservante (habitualmente, KC1) y lavarlo con agua destilada; a continuación, secarlo bien con un papel que no deje residuos. • Seleccionar el botón de calibración y añadir la primera solución patrón (pH = 7). • Lavar con agua destilada y secar con un papel que no deje residuos. • Seleccionar el botón de calibración y añadir la segunda solución patrón (pH = 4,01). • Lavar con agua destilada y secar con un papel que no deje residuos. • Seleccionar el botón de pH y medir la solu ción problema, homogeneizándola. Cuando la lectura se estabiliza, se obtiene el valor de pH de la solución. • Lavar con agua destilada y secar con un papel que no deje residuos. • Guardar el electrodo en la solución conservadora.

Electrolito (referencia)

[ pH-metro

I [W]

Membrana de vidrio

e

VALORACIONES ÁCIDO-BASE

Concepto de ácido-base Los conceptos ácido (compuesto que produce protones, H+) y base (compuesto que produce iones hidroxilo, OH-) fueron pro puestos inicialmente por el químico sueco Svante Arrhenius a finales del siglo XIX. Esta definición sólo se podía aplicar a disoluciones acuosas. Posteriormente, los químicos Lars Bronsted y Thomas Lowry ampliaron los conceptos de ácido y base:

,\W] [W]

Electrodo ~7W] (sensor) [W]

A la hora de manipular los electrodos hay que tener una serie de cuidados: • Manejarlos con suavidad, porque son muy frágiles. Tener especial cuidado cuando se sacan o introducen dentro de los recipientes de medida y de no golpearlos con el agitador. • A la hora de medir, asegurarse de que el nivel del líquido moja el contacto del electrodo de referencia en los electrodos combinados. • No sacar el electrodo de la disolución mientras el instrumento está midiendo. • Guardar siempre el electrodo en solución conservante y rellenarlo -con la solución de KCl cuando sea necesario.

,!

\

Disolución problema

A Figura 19-6. pH-metro y electro combinado.

Para ajustar el pH de una disolución se utilizan soluciones de ácido fuerte, cua ndo se desea disminuir el pH, o de base fuerte, cuando se quiere incrementar el pH. Normalmente se utiliza ácido clorhídrico [HCl) 1N y NaOH 1M.

• Ácido: cualquier sustancia que puede dar pro tones a otra. • Base: cualquier sustancia que puede aceptar protones. De acuerdo con esta definición, un ácido y un a base que pueden transformarse entre sí por la pérdida o ganancia de un protón se denominan «par conjugado ácido-base».

HA (ácido conjugado)

A- (base conjugada)

Finalmente Lewis, en 1923, propuso una n ueva definición para ácidos y bases, como aceptores y dadores, respectivamente, de un par electrónico. Así, se amplió el grupo de los ácidos con la inclusión, entre otros , de los iones positivos.

Valoraciones ácido-base Una valoración o titulación es el proceso de analizar la composición midiendo el volumen necesario de una solución que reaccio na con otra. Cuando una de las soluciones contiene un ácido y la otra una base, se habla de «valoración ácido-base».

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Al realizar una valoración ácido-base se quiere calcular la concentración de una de las dos soluciones.

15 mL

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MóduJo 11

Técnicas generales de laboratorio

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Actualmente, el tamaño de los poros de los filtros que se utilizan en técnicas de filtración puede ser lo suficientemente reducido para separar macromoléculas, como las de distintas proteínas. En estos casos se habla de ultrafiltración. Este tipo de técnicas puede utilizarse, por ejemplo, para la desproteinización de muestras biológicas sin necesidad de utilizar agentes caotrópicos.

Diálisis Se basa en la utilización de una membrana sem ip erm eable que permite el paso de moléculas hasta un determinado tamaño y previene al mismo tiempo el paso de moléculas mayores. Las moléculas que atraviesan la membrana quedan en suspensión en el disolvente. La velocidad de diálisis depende de las condiciones de:

• Permeabilidad de la membrana. El acetato de celulosa es uno de los materiales que más se emplea. Su tamaño de poro no perm ite el paso de moléculas mayores de 10.000 Da (daltons). • Disolvente. La velocidad de diálisis es máxima en el agua destilada; sin embargo, las moléculas biológicas requieren soluciones acuosas de pH y fuerza iónica controladas. • Condiciones físicas. Son de gran trascendencia la temperatura y la presión. La velocidad de diálisis depende de la temperatura, de modo que a mayor temperatura, menor es la viscosidad del disolvente y mayo r es la difusión hacia él. La diálisis se utiliza para separar moléculas pequeñas como iones, sales y metabolitos (glucosa, aminoácidos, lactato, piruvato, etc.) de las macromoléculas, como las proteínas, los ácidos nucleicos, etcétera.

Centrifugación La centrifugación es un método básico pa ra separar sustancias sólidas en suspensión en un medio líquido, por ejemplo, las células y el sedimento de una orina del líquido que las contiene. El fundamento es aplicar cierta velocidad angular a la suspensión, de forma que las partículas más pesadas se depositen en el fondo del recipiente, lo que constituye un precipitado, mientras que las más ligeras quedan por encima, disueltas o contenidas en el líquido, lo que se conoce como sobrenadante. Las centrífugas están constituidas por un ro tor o cabezal, el lugar donde se colocan las muestras. Tienen que ser de materiales muy resistentes. Hay distintos tipos de rotores, que se clasifican en función de cómo se orientan las muestras respecto al campo centrífugo (Fig. 20-2). Los rotores pueden ser oscilantes, de ángulo fijo o verticales. Según el tipo de rotor, la fuerza centrífuga actúa de manera diferencial sobre el tubo y hace que el sedimento se deposite en una zona característica. Las letras a, b y c de la figura 20-2 indican la distinta fuerza centrífuga que se aplica en distintas zonas del tubo, de las que se toma normalmente la fuerza promedio (b). Los diferentes rotores tienen características distintas:

• Rotor flotante u oscilante. Consiste en un aspa de donde cuelgan unas carcasas flotantes, lugar en el que se colocan los tu bos, que se orientan en el sentido del campo centrífugo y pasan a estar en posición horizontal cuando la centrífuga está en funcionamiento. El campo centrífugo que actúa sobre las muestras no es uniforme, ya que la distancia al eje de giro de la centrífuga no es la misma en la parte del tapón que en el fondo de los tubos (se considera la distancia promedio). Una de las características principales de estos roto res es que pueden soportar menos cantidad de muestra, debido a que el peso de la muestra de cada tubo se multiplica tantas veces como el número de fuerzas centrífugas (rcf, fuerza centrífuga relativa) que actúan y ese peso lo soporta el eje sobre el que flota la carcasa.

Vídeo 20-1. Instrucciones para el correcto manejo de una centrífuga.

El tamaño es una de las propiedades físicas que más se utiliza para segregar Los distintos

tipos de biomoLécuLas de una muestra. Si las moléculas que se quieren separar difieren mucho en su tamaño, se emplean técnicas como la filtración o la diálisis. Pero si las diferencias son más pequeñas, se utiliza la centrifugación.

245

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_'Capítulo 20

Aplicación de procedimientos de separación de sustancias

~ Figura 20-2. Tipos de rotores y distribución del sedimento.

Eje de giro I

Rotor oscilante

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a·Carcasa

bi

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I I

f#é9 ' 1

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I

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sustitución de nucleótido o proteína. • : para separar anterior y actual descripción de una variante. • ; para separar diferentes cambios en un alelo. • ,separador entre diferentes nucleótidos o proteínas. • [] varios cambios en un alelo. • () duda en la descripción de un cambio. • {} acceso a las bases de datos, número de acceso. • ? desconocido. • = no hay cambio, secuencia salvaje. • O no hay producto, nada. • chr cromosoma. • del deleción. • dup duplicación. • ins inserción. • inv inversión. • con conversión. • t translocación.

• fs frame shit. • X codón parada. Hay que destacar la nomenclatura en las enfermedades recesivas, en las que hay cambio de la secuencia en los dos alelas y hay que hacer referencia a los dos cambios: [] + [ ] , por ejemplo: c.[546C>T] + [1398delT].

e

TÉCNICAS DE EXTRACCiÓN DE ADN EN SANGRE PERIFÉRICA, BIOPSIAS Y TEJIDOS

El TEL desempeña un papel fundamental en los laboratorios de genética molecular dedicados al diagnóstico clínico, en la fase preanalítica de la preparación de la muestra; por ello es vital que se realice una correcta y apropiada extracción de los ácidos nucleicos (ADN, ARN) en función del estudio genético que se haya solicitado y se vaya a realizar. En la mayoría de los laboratorios de genética molecular, la primera etapa es la obtención de ADN en los diferentes tipos de muestras recibidas en el centro. Las muestras a partir de las cuales se puede obtener ADN (Fig. 26 -6 ) son varias, entre las que destacan: 326

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Biología molecular y citogenética

Módulo 111

Figura 26-6. Tipos de muestras en las que se puede realizar extracción de ADN. Muestras de las que se puede extraer ADN

Tejido fresco o congelado

Bloques de parafina

Sangre periférica con EDTA

Plasma/suero

Sangre seca en Guthrie Cards

Laminillas histológicas

Vellosidades coriónicas

Saliva

Líquido amniótico

• La sangre periférica: con anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), que señaliza el contendor con tapón malva, es quizá la muestra más fácil para la obtención de ADN. El ADN aislado de los leucocitos de sangre periférica es la muestra de elección mayoritaria, ya que es el más adecuado para el diagnóstico de las enfermedades genéticas. El contenido deADN de las células humanas es de unos S picogramos (pg), de forma que, a partir de 20 mL de sangre anticoagulada con EDTA pueden obtenerse entre 2S0 y sao microgramos (Jlg) de ADN. En ocasiones, especialmente para el diagnóstico molec ular de enfermedades metabólicas, se puede usar sangre seca impregnada en cartón de Guthrie Cards. • El suero o el plasma: muestras en las que el ADN que se obtiene no es de muy buena calidad y requiere una amplia experiencia por parte del TEL que la realiza. • El tejido fresco o congelado: se puede obtener ADN en cantidad suficiente y de buena calidad. • El bloque de parafina de tejido tumoral: presenta el inconveniente de que hay que eliminar la parafina y presenta como limitación que el ADN suele degradarse en poco tiempo, por lo que los fragmentos de ADN que se obtienen son muy pequeños. • Las laminillas histológicas: requieren desm ontar la laminilla, eliminar los restos de parafina, así como los colorantes que se han aplicado, por lo que generalmente se obtiene poca cantidad de ADN. • Otras muestras: también es viable la extracción de ADN del semen, el pelo, la orina o la saliva (que se emplean especialme nte ante extracciones dificultosas en cierto tipo de pacientes) y de las vellosidades coriónicas o el líquido amniótico; estas últimas se emplean con frecuencia para obtener ADN de cara a un diagnóstico prenatal de una determinada enfermedad o síndrome genético, principalmente el ADN aislado de biopsias de vellosidades coriónicas.

Diga cinco tipos de muestras de los que se pueda extraer elADN.

El fundamento en la extracción de ADN es eliminar las proteínas, ya que el ADN está protegido por proteínas que interfieren en los procesos de amplificación del ADN que tienen lugar en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para mantener la integridad de la estructura del ADN se emplean reactivos que no provoquen roturas y mantengan lo más entero posible el ADN, ya que esas roturas generarían pequeños fragmentos que pueden producir dificultades en la amplificación oportuna del ADN.

Técnicas manuales El ADN se encuentra en las células enredado con las proteínas. En el laboratorio debe liberarse de estas moléculas, para que puedan atacarlo las enzimas que se emplean 327

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Capítulo 26

Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos

en los estudios moleculares. Esto se lleva a cabo mediante pasos secuenciales de lisis celular, digestión proteica con una proteinasa y eliminación de los péptidos del lisado mediante extracción orgánica. Los ácidos nucleicos se recuperan por precipitación con etanol y cloruro sódico. La lisis celular (disociación de las proteínas asociadas al ADN) puede realizarse mediante los tres métodos que se describen en la tabla 23-3 . En ocasiones, para extraer ADN a partir de san gre entera se puede preparar un ficoll, para obtener células mononucleadas. El ficoll es un polisa cárido sintético de alto peso molecular (400 kDa) que presenta un alto contenido en grupos hidroxilo (OH-), por lo que es soluble en medio acuoso, no presenta grupos ioni zables que puedan servir de unión a las muestras, es estable a pH neutro y alcalino y no altera la presión osmótica del medio: por eso se emplea como soluto para la formación 'del gradiente. Se realiza una técnica de ultracentrifugación por gradiente de den sidad para separar los linfocitos y monocitos de otras células de la sangre. Después de la centrifugación se forman varias capas y se recoge la fase intermedia y se lava.

Tras la Lisis celuLar, se procede a la extracción de ADN propiamente dicha, seguida de una precipitación y purificac ión del ADN.

Técnica de extracción salina o salting-out Esta técnica se basa en que las proteínas son menos solubles a altas concentraciones de sal, de modo que precipitan mientras el ADN se mantiene en disolución (sales como los acetatos hacen que precipiten las proteínas, pero no el ADN). Las etapas son cuatro: 1) lavado de las células con suero fisiológico; 2) lisis de los eritrocitos; se emplea un tampón de lisis de eritrocitos como el STMT: sacarosa + tris + MgCl 2 + H 2 0 desionizada, hay que repetir el proceso dos veces, pero la segunda vez incubar sólo 5 minutos en hielo y no 5 minutos como en la primera; 3) lisis de leucocitos; se emplea un tampón de lisis de leucocitos TLL: NaCl + EDTA + tris + H 2 0 desioni zada y digestión de proteínas, con una solución de proteinasa K (enzima proteolítica) + dodecilsulfato sódico (SDS) + EDTA + H 2 0 desionizada; 4) extracción salina, mediante el empleo de NaCl saturado e isopropanol, 5) conservación de la muestra, mediante el uso de EtOH yTE (tris-EDTA) (Figs. 26-7 y 26-8).

Técnica del fenol-cloroformo-alcohol isoamílico Esta técnica consiste en que los ácidos nucleicos, al contrario que las restantes sustancias bioquímicas (proteínas, hidratos de carb ono, lípidos) no se disuelven en fenol. El cloroformo y el fenol «atrapan» los lípidos y pro teínas y dejan el AD N disuelto en agua. La proteinasa K más SDS elimina proteínas; el fenol cloroformo procura la separación de las fases acuo sa y orgánica y el isoamilalcohol (o alcoh ol isoamílico) impide la formación de espuma. Los pasos que se siguen son: • Añadir un volumen igual al de la muestra de la m ezcla fenol -clor oformo-alcohol isoamílico (25:24 :1) y agitar con vórtex .

iTabla 26-3. Tipos de métodos para realizar la lisis celular

Métodos físicos

• • • • •

Métodos químicos

• Emple o de detergentes que so lubilizan las proteínas , componentes de tejidos y membranas , para ello se varían el pH, la concentración salina y la temperatura. Por ejemplo detergentes iónicos: aniónicos dodecilsulfato sódico (SOS)

Métodos enzimáticos

• Enzimas: lisozima (bacte rias) y litiasa (levaduras) • Proteasas (rom pen enlaces en la pared de la membrana plasm át ica e interacciones célula -célula)

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Homogeinizacián mecánica Molienda manuaL en mortero Bolitas de vidrio Sonicacián Temperatura

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328

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Biología molecular y citogenética

Módulo 111

Suero

Lavado de las células: suero fisiológico

fiSiOI\iC~

Sangre

~

~ Figura 26-7. Et apas de lavado de células y lisis de er itrocitos en la t écn ica sal-

ting-out.

Centrifugar

Descartar el sobrenadante

Lisis de eritrocitos:

~ STMT

Agitar

Descarta r el sobrenadan te

Centrifuga r

2a vez: HIELO 5 min

• Centrifugar a temperatura ambiente y transferir la parte acuosa (fase acuosa, fase superior) que contiene el ácido nucleico a otro tubo. • Añadir acetato sódico para facilitar la precipitación con etanol y después añadir etanol al 100 % frío. • Dejar precipitar a - 20 oC durante 30 minutos. • Centrifugar y elim inar el sobr enadante.

Extracción salina

IsoPro~

NaCISat.

Toda ~ lanoche i ~ a 37 -c

l

~

Incubar en agitación

Resuspender

Proteínas Agitar Centrifugar

Recoger el sobrenadante y centrifugar

Precipita el ADN

Conservación de la muestra: uso de reactivos EtOH y TE (tris-EDTA)

Lavar con etanol

Precipitación del ADN (hebras)

Redisolver en tampón acuoso , que contiene el amortiguador, tris-EDTA .

Congelar a - 20 -c

~ Figura 26-8. Et apas de l is is de leucocit os y dig esti ón de pro te ínas y ext racción sal ina en la té cni ca salting-out.

329

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Capítulo 26

Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos

• Lavar con etanol al 700/0 para reprecipitar. • Centrifugar y eliminar el sobrenadante de nuevo. • Resuspender el tampón TE (tris-EDTA). En estos kits se suele utilizar un sistema de columnas para obtener, retener y disolver el ADN.

Kits comerciales con columnas de gel de silice En el mercado existen muchos kits comerciales para llevar a cabo la extracción de ADN de diferentes tipos de muestras, en los que los reactivos están preparados ya para ser utilizados directamente.

Técnicas automatizadas En la mayoría de los laboratorios de genética en el ámbito hospitalario, debido al gran volumen asistencial y al número considerable de muestras que se reciben a diario, se emplean equipos robotizados para la extracción de ADN, en que la extracción se realiza a partir de muestras de sangre total con EDTA y se fundamentan en la cualidad que tiene el ADN de unirse al sílice en presencia de alta concentración de sales caotrópicas (hidrocloruro de guanidinio y tiocianato de guanidinio). El ADN se une a partículas magnéticas recubiertas de sílice y hay una separación magnética. Se consigue obtener un ADN puro de alta calidad, siendo el cociente de absorbancia 260/280 = 1,8.

TÉCNICAS DE EXTRACCiÓN DE ARN

¿Qué ARN es el más abundante?

Entre los objetivos de las técnicas de obtención de ARN se encuentran: a) la eliminación de ARNr y ARNt, que no son de utilidad para el análisis de expresión y cuantificación de un gen; b) mantener la integridad de la estructura, para lo que se deben emplear reactivos que no provoquen roturas del ARNm, pues los segmentos muy pequeños son muy difíciles de amplificar, e) obtener ARN en cantidad suficiente y de buena calidad. El ARNr es el más abundante (75%) y forma parte de los ribosomas; el ARNt es el segundo más abundante (15 %) y se encarga del transporte y la transferencia de los aminoácidos y el ARNm (10%) transporta y transfiere la información del ADN (genes). Las fases para la obtención de ARNm consisten en: • Lisis eficaz de las células y desnaturalización de los complejos de nucleoproteínas que se encuentran en los extractos celulares. • Inactivación de la actividad de las ribonucleasas dentro de la célula. • Eliminación de las proteínas (cuando quiere aislarse ARN deben eliminarse las ribonucleasas) . • Eliminación del ADN contaminante de las células. • Elución del ARNm. Durante la extracción del ARNm se deben tomar una serie de precauciones: las superficies de trabajo deben tratarse con inhibidores de ribonucleasas (EtOH 70% + RNA se Zap), evitar la contaminación corporal por parte del técnico, mediante el empleo de guantes estériles y cambiarlos con frecuencia, emplear material fungible y reactivos certificados libres de nucleasas y no realizar la limpieza en autoclave. A con tinuación se detallan las diferentes técnicas para la obtención de ARN.

Técnica del tiocianato de guanidino/fenol/cloroformo La extracción mediante la técnica del tiocianato de guanidino (inhibidor de las ribonucleasas)/fenol/cloroformo es cada vez menos frecuente. El primer paso consiste en centrifugar el contenedor de sangre periférica con EDTA para obtener el «Buffi coat», el cual se transfiere a un nuevo tubo que contiene una solución D (tiocianato de

330

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Módulo 111

Biología molecular y citogenética

guanidino + citrato de sodio + sarcosil + beta mercaptoetanol), y se homogeneiza la muestra y se conserva a -20 oC. Las etapas detall adas son:

1. Añadir al tubo que contiene la fase de leucocitos: acetato de sodio + cloroformo + alcohol isoamílico. 2. Agitar, incubar en hielo durante 15 minutos y centrifugar. 3. Transferir la fase superior, fase acuosa donde se encuentra el ARN, a un nuevo tubo; en la interfase se quedan las proteínas y el cloroformo se queda en la fase inferior. 4. Añadir isopropanol, incubar durante 1 hora a -20 oC y centrifugar. 5. Desechar el sobrenadante. 6. Añadir EtOH frío y resuspender el pellet (dar un vortex). 7. Repetir de nuevo los pasos 5 y 6. 8. Centrifugar y descartar el sobrenadante. 9. Dejar secar el pelle: (no dejar secarlo mucho tiem po). 10. Añadir agua estéril, vortear e incubar durante 10 minutos a 65 oC. 11. Guardar a -20 oC. Existe también una variación de esta técnica que consiste en el empleo de trizol en lugar 'de citrato de sodio y fenol, se conoce como técnica de trizo].

Kits comerciales Se aconseja el empleo de kits comerciales, deb ido a que el ARN se degrada con gran rapidez, con el fin de agilizar el proceso. La me todología de estos kits comerciales es muy similar a la de los que se emplean para la extracción de ADN y se basa en columnas de sílica gel. Se emplean partículas magnéticas que, a pH bajo, están cargadas positivamente, lo que hace que atraigan a los ácidos nucleicos y con la ayuda de unos soportes magnéticos con gradillas para colocar los tubos, se someten al magnetismo. Las fases de la extracción de ARNm mediante los kits comerciales son:

¿Puede decir una ventaja del uso de los kits comerciales?

1. Col ocar la muestra del paciente en un tubo Eppendorf y añadir unas bolitas magnéticas (y un reactivo con un pH 6). 2. Mezclar e incubar. 3. Colocarlas en el soporte, dejar actuar bajo el imán y, una vez que se obtiene el pellet, descartar el sobrenadante. 4. Tratar con ADNasas para purificar el ARN, degradando el ADN. 5. Quitar el soporte y añadir el reactivo de lavado. 6. Volver a colocar en el soporte, dejar actuar el imán y eliminar el sobrenadante. 7. Repetir el lavado. 8. Quitar el soporte y añadir el reactivo de elución. 9. Colocar en el soporte, dejar actuar al imán y guardar el sobrenadante a - 80 oC.

No debo olvidar que... •

El técnico especialista de laboratorio tie ne una labor importante en lá fas de extracción de ADN en los diferentes tipos de muestras de pacientes que se reciben en los laboratorios de genética molecular.

•

La combinación de una base y un azúcar se denomina nucleósido.

•

La adición de un grupo fosfato al carbono 5' de la pentosa da lugar a un nucleótido.

{Continúa en la página siguiente}

331

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Capítulo 26

Aplicación de técnicas de

extracción de ácidos nucleicos

•

Los nucleótidos se unen entre sí mediante enlaces fosfodiéster entre el grupo fosfato de un nucleótido y el carbono 3' de la pentosa del siguiente nucleót ido.

•

Un polímero de nucleótidos (una hebra de ADN] tiene siempre Un extremo 5' -fosfato y un extremo 3' -hidroxilo.

•

En el ADN bicatenario las proporciones A:T y G:C son siempre igual a 1. La suma de purinas (A + G] es igual a la suma de pirimidinas (C + T).

•

El ADN es bicatenario y el ARN es monocatenario.

•

Las principales técnicas para la extracción de ADN que se emplean actualmente en los laboratorios de genética en el ámbito hospitalario son los sistem as automat izados [robotizadosl.

•

La muestra de elección para la obtención de ADN en la mayoría de los est udios genéticos moleculares es la sangre periférica con EDTA.

Caso práctico

Preguntas de repaso 1. Respecto a La extracción de ADN de diferentes mu estras, señaLar La afirmación faLsa: a. En los robots y equipos automatizad os de extracción de ADN que se usan en los lab oratorios de genética molecular, para la extracció n de ADN de sangre periférica con EDTA se emplean reactivos que no provocan roturas del ADN . b. La primera etapa en la obtención de ADN es la lisis celular, la cual se puede llevar a cabo por métodos físicos, químicos y enzimáticos . c. La lisis celular en el proceso de obtención de ADN sólo se realiza mediante métodos enzimáticos. d. En cierto tipo de muestras, como en los bloques de parafina, es muy difícil conseguir fragmentos grandes de ADN.

El TEL en el laboratorio de genética molecular recibe un tubo de Eppendorf que contiene una alícuota de sangre periférica etiquetada con un número de identificación, que corresponde a un hombre de 42 años que acude a urgencias y se somete a un examen neurológico debido a una corea progresiva que cursa con cierta rigidez y un episodio de convulsiones. En el formulario de petición sólo se indica que ruegan efectuar el estudio genético de la mutación familiar. El TEL tiene dudas y no sabe qué hacer con la muestra recibida. ¿Cómo debe proceder con la muestra? ¿Podrá obtener ADN de ella?

2. De Las siguientes afirmaciones, indicar cuáL no es cierta: a. La metodología para la obtención del ARN es muy parecida a la que usan los kits comerciales de extracción de ADN [columnas de sílica gel). b. En la extracción de ARN hay que tomar menos precauciones que en la extracción de ADN. c. En la extracción de ARN, por su rápi da degradación, se aconseja utilizar kits comercializados preparados , para agilizar la técnica. d. Hay que tene r especial cuidado durante la extracción de ARN de evitar la contaminació n propia, del técnico, mediante el uso obligatorio de guantes estériles y que éstos se renueven a menudo duran te el proceso.

332

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Módulo 111

Biología molecular y citogenética

e

BIBLIOGRAFíA

Bej AK, Mahbubani MH, Atlas RM. Amplificarion of nucleic acids by polimerase chain reaction (PCR) and other merhods and rheir applicarions. Clin Rev Biochem Molec BioI. 1991 ;26:30 1-34. Guillén E, Glover G. Técnicas diagnósricas medianre ADN. An Pediatr Conrin. 2004;2(6): 360-4. Lodish H, et al. Biología celular y molecular. 5 a ed. Madrid: Editorial Panamericana, 2006.

333

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,

ndice de contenidos •

Introducción

•

Técnicas de PCR y variantes

•

Técnicas de electroforesis en gel

•

Técnicas de visualización de fragmentos e interpretación de resultados

•

Aplicaciones diagnósticas

y forenses de las técnicas de PCR

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Aplicación de técnicas de e yelectroforesis al estudio de los ácidos nucleicos

INTRODUCCiÓN Para detectar los productos finales que se obtienen después de varios de los procedimientos realizados en el laboratorio de genética molecular por el técnico especialista de laboratorio (TEL), como la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) , los cortes con enzimas de restricción y la amplificación de ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se emplea la electroforesis como metodología analítica, porque permite visualizar dichos productos. En este capítulo de detallan aspectos básicos del fundamento de la PCR y sus principales aplicaciones en el diagnóstico clínico y forense, así como el adecuado uso de la electroforesis en gel de agarosa como método de separación y análisis de los ácidos nucleicos.

• • • •

Conceptos de PCR Fases de PCR Tipos de PCR Utilidad de la PCR

TÉCNICAS DE PCR y VARIANTES Fundamento d la P R La PCR (las siglas en inglés de polimerase chain reaction) es la técnica que se fundamenta en sintetizar muchas veces un fragmento de ADN mediante el empleo de una polimerasa que puede crecer a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus, que vive a altas temperaturas (79-85 oC), de ahí su nombre comercial más conocido: Taq polimerasa. Es una técnica básica en biología molecular que proporciona una cantidad de ADN suficiente para poder realizar otras técnicas posteriormente, a pesar de que la muestra inicial sea muy escasa y que reproduce in vitro la replicación del ADN; es decir, cuando se realiza una técnica de PCR, se simula lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN yen el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para estimular la producción de este proceso. Esta técnica fue ideada por K. Mullis a mediados de la década de 1980, a quien posteriormente se otorgó, en 1993, el Premio Nobel de Química. Se caracteriza porque recurre a una polimerasa termorresistente que permite desnaturalizar el ADN a 94 oC sin degradar la enzima y se amplifica un pedazo específico de ADN, que requiere conocer la secuencia que haya ambos lados de la región que se va a amplificar. Es una técnica muy sensible, permite obtener millones de copias partiendo de una sola cadena de ADN y también es muy específica, ya que sólo amplifica la secuencia que se quiere sintetizar.

Com

La electroforesis en gel de agarosa es el método que se emplea para valorar la calidad del ADN.

n ntes ara la ealización de a PCR

Los componentes para la PCR (Fig. 27-1 ) son:

La PCR es una técnica muy sensible y específica.

• Muestra de ADN: molde de ADN (DNA template). • Taq polimerasa (ADN polimerasa), Thermus aquaticus, que se aisló de bacterias que vivían en aguas termales, resistentes a altas temperaturas> 100 -C, que en presencia de iones magnesio crece a 75-80 oC. 335

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.. Figura 27-1. Reactivos necesarios en la PRC y las etapas de la PCR que ocurren en el inte rior del termociclador.

ADN molde I

I

I

©© © Taq polimerasa

I

+

+

dNTP (dATP, dCTP, dGT P, dTTP)

+

Mg 2+

Oligonucleóti dos

Paso previo: desnatural ización del ADN (5-15') Paso 1: desna turalización (1') Paso 2: hibridación (unos 30')

} Pasos 1-3 30 ciclos

Paso 3: elongació n (de 30 min a 1 h) Extensión fina l: 72 oC 10' (opcional)

Termocicladores

• Oligonucleótidos de cadena sencilla, complementarios a las secuencias conocidas del ADN diana, primers, o cebadores u oligos (forward [F] y reverse [R]). • Desoxinucleótidos trifosfatos (carecen de 2' -O H Y 3'-OH), dNTP (dATl?, dCTl?, dGTl?, dTTP). Se recomienda una concentración similar en cada uno de ellos (de 20 a 200 um) y relacionada con la concentración de Mg+2 , puesto que el magnesio actúa como agente quelante sobre los dNTl? • Cloruro de magnesio (MgCl z) : factor que estabiliza el ADN de una sola cadena y su concentración resulta fundamental para la optimización de la reacción, ya que a mayor concentración disminuye la especificidad. Se recom ienda que el TEL prepar e tod os los react ivos en alícuotas congela das (-20 OC) Yque ut ili ce congelado res si n la f unción defr ost (que deshidrata las mu estras).

Normalmente, las casas comerciales ofertan la «master mix», que contiene todos los reactivos y componentes necesarios para llevar a cabo la PCR. La polimerasa comercial siempre viene acompañada de un buffer o amortiguador con las sales que se requieren y el cloruro de magnesio, puede venir incluido o se puede adquirir aparte. El agua que se utiliza en la reacción de la PCR debe tener muy pocas sales, para ello se puede utilizar el agua que suministran las empresas comerciales embotellada y libre de nucleasas. En todo el material que se emplee en el transcurso de la realización de la PCR debe verificarse el certificado de que está libre de ARNasas y ADNasas.

Etapas de a PCR La PCR consta de tres fases fundamentales: desnaturalización, hibridación y

elongación (Fig. 27-2). • Fase de desnaturalización (denature): es la separación de los dos filamentos del ADN y se consigue calentando el ADN hasta 95 oC durante 1-5 minutos, según la calidad y el peso molecular del ADN. • Fase de hibridación (annealing)/alineamiento: fase en la que tiene lugar la unión de los primers o cebadores a sus secuencias complementarias de la muestra de ADN. La temperatura ideal que permite la unión del primer con la cadena deADN se conoce como temperatura annealing y depende del número y tipos de nucleótidos que constituyen el primer. Los cebadores son secuencias de una sola cadena de lOa 30 nucleótidos que se unen a zonas específicas (complementarias) de cada una de las cadenas desnaturalizadas del ADN, por eso confieren especificidad a la PCR. El ftrward (F), o primer upstream, es el que se une al extremo 5' del ADN; el que

336

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·.. . ... Figura 27-2. Fases de la peR o

Paso 1 5'

i

I I

1

3'

I I

1

I I

I

1

1 1

1

i

I I I I I I

i

3'

i

5'

1

Desnaturalización a 95 oC: la doble hebra se separa

c:=::=::J

© © ©

~

Paso 2 1

I

I I I I

j

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1

1

1

I I

o=n

i

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i

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i

3'

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Paso 3

I

1

Hibridación a 60 "C (temperatura según la temperatura media de fusión de los oligonucleótidos)

1 V--

Elongación (72 ·C)

J

--V ~~~~::::;:::::l I I 3'

========::::::==:: : :':=: : : :J15'

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3,:1

1: 5'

5'

3' 1: 5'

3,:1

Por cada molécula de ADN de molde inicial se generan dos moleculas de ADN de molde en el primer ciclo

se une al extremo 3' del ADN es el reverse (R) o primer downstream. La temperatura de hibridación o annealingse fija de tal manera para que el primer se adhiera adecuadamente a su secuencia complementaria, pero que no se una de forma inespecífica a otras secuencias del ADN. Se debe procurar que los dos primers tengan la misma temperatura annealing, que normalmente oscila entre 50-70 oC y que depende de las bases nitrogenadas: guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T ), es decir, de la secuencia de los primers. A la hora de elegir y diseñar los primers, se debe contar con aproximadamente la misma cantidad de AT y de CG. Además hay que evitar la complementariedad en cada uno de los primers, evitar G y C en el extremo 3' (dímeros de primers en el extremo 3'). El tamaño que se recomienda es de 20 a 30 pares de bases (pb) y la concentración del primer de 0,1 a 0,5 micromoles. A mayor temperatura de hibridación, mayor especificidad se consigue, disminuyen las uniones incorrectas de los primers, así como la extensión incorrecta de nucleótidos en el extremo 3' del primer. Si al visualizar un gel de agarosa no se visualiza ninguna banda, se podría modificar la temperatura de hibridación, por ejemplo, bajándola un par de grados. • Fase de extensión o elongación: la Taq polimerasa incorpora los nucleótidos para replicar el fragmento de ADN, es decir, para la elongación del primer por acción de la ADN polimerasa (72 vC), Por cada molécula molde de ADN inicial se generan dos moléculas molde de ADN en el primer ciclo. Todo el proceso se repite entre 35 y 40 veces y hay un incremento exponencial de la cantidad de copias. Se llega a un punto en el que los componentes de la reacción se agotan y aunque se añadieran más ciclos no se obtendría mayor rendimiento. La cantidad relativa de ADN se calcula como 2 0 - 1, siendo n el número de ciclos. Todas las fases de la PCR tienen lugar en el termociclador, sistema automático programable para realizar la PCR, que calienta y enfría la reacción en períodos cortos de tiempo, es decir, «cicliíica»las temperaturas necesarias para que se lleve a cabo la replicación del ADN (Fig. 27-1 ). Existen varios tipos de termocicladores en el mercado para múltiples necesidades: que tengan capacidad para muchos tubos, que efectúen gradientes de temperatura, o que sean muy rápi dos y exactos para alcanzar las tempe-

Ellímite máximo del tamaño del fragmento que puede amplificar la PCR es de, aproximadamente , 1.000 pb, aunque las amplificaciones de fragmentos> 500 pb son bastante raras.

337

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¡ •

•

•

raturas programadas. La Tm (melting temperature) es la temperatura a la que se hibridan o se pegan los oligonucleótidos en los sitios que son complementarios y se puede calcular mediante el empleo de la fórmula ~11 = 4(G + C) + 2(A + T).

Problemas que se pueden presentar en la PCR La PCR es muy sensible a los cambios de iones, las variaciones en las temperaturas, los contaminantes que pueden estar en el ADN o en el agua, las variaciones de un termociclador a otro, etc. Entre las dificultades que el TEL, a la hora de realizar una PCR, se puede encontrar destacan las siguientes: Recuerde una causa por la que no sea posible la amplificación.

• No hay amplificación: se puede tratar de bajar la temperatura de hibridación o aumentar la cantidad de M g2+. Si esto no funciona, se ha de comprobar que los primers no se han degradado. Suele conservarse una solución madre congelada muy diluida y una de trabajo a 4 oC más diluida aún. Al añadir más polimerasa, más ADN o aumentar el número de ciclos, no suele funcionar. • Amplificación inespecífica: se aumenta la temperatura de hibridación o se puede bajar la cantidad de M g2+. Aumentar la concentración de primers y dNTP puede producir un aumento de las amplificaciones inespecíficas. • Contaminación: si en alguno de los componentes de la mezcla de reacción hay ADN, obviamente, se amplifica el ADN extraño además del ADN del paciente. El ADN es muy estable y puede permanecer en la mesa de trabajo, en las pipetas, etc. du rante mucho tiempo sin degradarse. Puede ser que el ADN no tenga una pureza adecuada; para ello se debe verificar la concentración de ADN y la relación A2GOI A280 en las muestras de los pacientes (Fig. 27-3). Siempre hay que trabajar con un control negativo , es decir, amplificar un blanco (todos los componentes de la mezcla de reacción , todos los reactivos utilizados en la PCR, excepto ADN), de forma que si en esta muestra hay amplificación significa que en algún reactivo hay restos de ADN, o de producto de PCR, que está contaminando; si esto sucede, lo más fácil es deshacerse de todas las alícuotas sospechosas (por ello es importante preparar alícuotas de todos los reactivos) y tomar alícuotas nuevas. Se debe trabajar en dos zonas diferentes, una habitación limpia/zona de preparación, que es el lugar en el que se prepara la mezcla de reacción. Aquí nunca se manipu lan productos finales de PCR (comprobación en agarosa) ni soluciones de ADN. Se debe descontaminar con frecuencia (el uso de luz ultravioleta forma dímeros de pirimidina entre las dobles cadenas de ADN, por lo que se hace imposible amplificar estas moléculas y se debe lavar con alcohol); y una habitación sucia, donde se añade el ADN a la mezcla de reacción y se manipulan los productos finales de PCR. Aquí nunca se manipulan los componentes de la mezcla de reacción . No se intercambian productos (pipetas, tubos, agua, etc.) entre las dos zonas. Además

• Es importante comprobar que no haya contaminación con proteínas que luego puedan interferir en la PCR • Se mide A260/A280. Para ADN debe estar entre 1,8 y 2

ro

.(3

e ro

.o

O

- - - _ 1 Proteínas

C/)

.o

« Figura 27-3. Verificación de la pureza del ADN de las muestras.

260 nm

338

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280 nm

·...

..

del control negativo que permite apreciar posibles casos de contaminación, una vez aju stado el protocolo de la PCR siempre es recomendable incluir un control po sitivo . Éste es un tubo que contiene ADN de una muestra que se haya amplificado ade cuadamente y cuyo patrón de ba ndas sea conocido. De esta manera, puede esperarse que si la reacción se llevó a cabo correctamente, esta muestra siempre salga bien. En caso contrario, si la PCR no generó bandas el?- ninguna de las muestras, ni siquiera en el control po sitivo, puede suponerse que el error radica en que no se añadió algún componente (reactivo) o que los ciclos de temperatura no se realizaron adecuadamente, puede que por problemas del termociclador o bien por error al elegir el programa de amplificación. • Dímeros de primers: se forman si los primersse pegan entre ellos. Hay que evitar que ten gan secuen cias com plem en tarias. Aun qu e la Taq polimerasa funciona mejor a 72 oC, a temperatura ambiente también es capaz de amplificar. Una vez preparada la mezcla de reacción se debe añadir el ADN lo más rápidamente posible para evitar amplificaciones in específicas de dímeros de primers.

La habitación limpia o zona de preparación es d o nd e se pre pa ra la mezcla d e r e a cc ió n . La

habitación sucia es d ond e se añade el A D N a l a m e z c la d e reacción

y se ma ni p u lan l os peRo

p ro d uctos fi nales d e

Cuando el TEL observa que la PCR empieza a fallar, debe valorar una serie de aspectos para averiguar la causa y realizar acciones correctivas para lograr que la PCR funcione correctamente. En la tabla 27 -1 se detallan algunas de las posibles cau sas y las medidas que se han de tomar para solucion ar el problema.

Variantes de la PCR En los laboratorios de biología molecular se puede trabajar, según la utilidad, con diferentes variantes de la técnica de PCR: • PCR anidada (nested PCR): se realiza una doble PCR, una primera PCR convencional y la segunda sobre el producto de la primera con unos nuevos primers internos. Además de aumentar el rendimiento (» 1.000 veces), mejora la especificidad.

Accio es a realizar

Factores a revisar

No hay buena calidad de ADN • Eliminar estos componentes del proceso de extracción de AON [p. ej. , neutralizar los restos de SOS usando 0,5% de Tween 20 o 40

AON contaminado con proteínas o alguna susta ncia que inhibe la reacción de la PCR, que procede del proceso de extracción de AON: restos de SOS. cloroformo, fenol yetanol

• Evitar la degradación del AON

----

Inadecuada cantidad de cloruro de magnesio

• Realizar curvas de cloruro de magnesio: proba r a aj ustar la concentración adecuada de cloruro de magnesio ; en general , la concentración de 1,5 mM de Mg 2+ es la más común, pero se puede variar de 1 a 4 mM

La polimerasa necesita iones de magnesio para fu ncionar adecuadamente, pero mucho Mg 2+ inhibe la po limerasa y poco M g 2+ puede generar productos inespecíficos

Inadecuada concentración de los dNTP

I •

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~-~

Los dinucleótidos unen iones de magnesio; peq ueños incrementos en la concentración de dNTP pueden inhibir la reacción porque atraparán el magnesio necesario para que la polimerasa trabaje

Buffers mal preparados Trabajar con concentraciones de magnesio en exceso

Revisar la concentración y el manejo de los dNTP : para 1,5mM de Mg~ la PCR que tendría una concentración ideal de dNTP sería la de 200 ~M . Tener en cuenta que existe relación entre las cantidades de magnesio y las de dinucleótidos en la reacción

• Preparar alícuotas de dNTP. ya que son muy inestables , para evitar descongelaciones sucesivas • Valorar si el buffer comercial ya lleva incorporado magnesio; si es así y se añade magnesio extra , se trabajaría con exceso de magnesio , por lo que es necesario usar un buffer sin magnesio

AON: ácido desoxirribonucleico; dNTP: desoxinucleótido tr ifosfato; SOS: dodecilsulfato de sodio.

339

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La RT-PCR trata de solventar algunos problemas asociados a la PCR tradicional.

• PCR multiplex: en la misma reacción de PCR se amplifican varios fragmentos simultáneamente. Es una PCR normal en la que se añaden varias parejas de primers. Cabe mencionar que es difícil conseguir que todos los fragmentos se amplifiquen con la misma eficacia. • PCR asimétrica: uno de los dos primers está en gran exceso respecto al otro, en pro po rción 50/1 o 100/1. Durante los primeros ciclos se amplifican las dos cadenas hasta que se agota el primer minoritario y desde entonces sólo se amplifica una cadena. • PCR touchdown: se basa en la utilización de una temperatura de hibridación decreciente en 1 oC en cada ciclo. • PCR cuantitativa (quantitative polymerase chain reaction, qPCR): PCR a tiempo real (realtime PCR, RT-PCR), PCR inmediata, simultánea. Es una variante de la PCR que se utiliza para amplificar y, simultáneamente, cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional: un molde de ADN, al menos un par de cebado res específicos, dNTB un tampón de reacción adecuado y ADN polimerasa termoestable. El producto de la PCR se marca con fluorocromo de tal manera que la cantidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de producto. Se cuantifica la cantidad de fluorescencia en cada ciclo y se representa en una gráfica denominada «ciclo PCR». El análisis de los datos y la cuantificación de pro ducto se realiza al inicio de la reacción, en la fase exponencial de la PCR. Los datos se van recogiendo a lo largo de todo el proceso y no sólo al final de la reacción (PCR normal). Existen dos tipos de cuantificación: absoluta (resultado final con unidades: copias de un gen) y relativa (resultado sin unidades, proporciona un porcentaje de incremento o disminución). Las etapas son: Excitación de las 96 muestras de la placa mediante una lámpara halógena de tungsteno. La fluorescencia que emite es captada por varios filtros ópticos y cada uno de ellos capta determinados colorantes fluorescentes. La emisión de fluorescencia se mide de forma continua en cada momento. La RT-PCR presenta una serie de ventajas:

Indique dos ventajas de la RTPCR.

• • • • •

e

Permite tomar datos mientras se realiza. Presenta una alta precisión y exactitud en la cuantificación. Alta sensibilidad (10- 12 mg). Cuantificación más exacta sin necesidad de emplear métodos laboriosos. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado.

TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros, como la poliacrilamida o la agarosa, que se diferencian en el tamaño del poro y se comportan como un tamiz molecular que permite separar las moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Los geles de poliacrilamida, con el tamaño de poro menor que los geles de agarosa, son más efectivos para separar fragmentos pequeños de ADN (5-500 pb); su poder de resolución es extremadamente grande, pues puede separar fragmentos que difieren apenas en 1 pb. La electroforesis es vertical y permite separar mol éculas pequeñas (6-2.000 pb). La agarosa es un polisacárido (polímero lineal) formado por galactosas alfa y beta (que se extraen de algas), soluble en agua a temperaturas superiores a 65 oC, de matriz inerte, no tóxica y con un tamaño de poro de 100 -300 mrn '. Se funde a 80-90 oC (aunque la hay con bajo punto de fusión) y forma gel a unos 30 oC. Según

340

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Biología moLecular y citogenética

Módulo 111

el tamaño de las partículas que se desea separar, se elige la concentración del gel de agaro sa. La agarosa funciona com o un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño migran má s rápidamente hacia el ánodo que los de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agaro sa se dificulta el movimiento de los fragmento s a lo largo del gel, lo que permite obtener una mayor resolución en los fragm entos de menor lon gitud. El porcentaje de concentración oscila en tre el 0,3 % (mo léculas de 5 a 60 kb) y el 30/0 (ácidos nu cleico s de 0,1 a 0,2 kb ). Los geles de agarosa con una concentración del 2,50/0 permiten separar fragm entos de tamaño entre 50 y 1.000 pb. Los geles de agaro sa al 2-3 % permiten separar fragmentos de ADN que varían de 100 a 500 pb. Según el tamaño de los fragmentos que se espera separar, se usará una con centración de agaro sa mayor o menor para obtener poros más o menos grandes y una mejor resolución de las bandas. Si no se conoce el tamaño, se puede empezar con agaro sa al 1 % pero, si se conoce, se pueden utilizar otras fórmulas, como indica la información de la tabla 27-2 . Los geles de agarosa po seen un poder resolutivo menor respecto de los de poliacrilamida, pero tienen una amplitud mayor de tamaño en la separación.

La electroforesis en geles de agarosa presenta como principales aplicaciones separar, identificar y purificar fragmentos de ADN o AR N y determinar el ta maño de un fragmento de ADN.

Electroforesis en gel de agarosa La electroforesis en gel de agarosa se puede emplear en el laboratorio de diagnóstico molecular para ver la calidad del ADN y comprobar si existe degradación (Fig. 27 -4). Se recomienda correr una pequeña muestra de ADN en el gel y visualizar si la cantidad de ADN que se usa es la adecuada. La muestra de ADN se coloca en el gel de agarosa que, sometido a un campo eléctrico en una cubeta de electroforesis (Fig. 27-5 ), las moléculas de ADN se desplaza n del polo negativo (cátodo) al polo positivo (ánodo). El gel se sumerge en un tampón (am ortiguador) de pH 8 (p. ej., trisacetato) para garantizar que los ácidos ' nucleicos están cargados negativamente (el grupo fosfato tiene una fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro) y se desplazan hacia el polo positivo. Cuanto más grande es el fragmento de ADN, más se retiene en la matriz porosa y menos avanza. Las etapas de la electroforesis en gel de agarosa son las siguientes:

• Preparación del gel (gelificación): los geles se preparan fundiendo la agaro sa en el buffer (tampón) elegido hasta que se con sigue una solución transparente y lim pia. El método de disolución má s cómodo y rápido para la preparación de un gel de agarosa es la disolu ción en el mi croondas. Para con centraciones altas, la disolución se hace más difícil debido a la viscosidad y la formación de espuma; para evitar esta última se recomienda hidratar el polvo de agarosa en el buffer durante un tiempo, unos 10-15 minutos, antes del calentam ien to para la disolu ción. Posteriormente, la solución se coloca en un mo lde-cámara de electroforesis horizontal (con bandeja sellada por los bordes por presión o con cinta adhesiva, según el

.

.

Porcentaje (%) de agarosa

Intervalo de tamaños de ADN Ipbl que permite separar

0,75

10.000-15.000

1,0

500-100.000

1,25

300-50.000

1,5

200-4.000

2,0

100-2.500

2,5

50-1.000

ADN: ácido desoxirribonucleico.

341

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.:

~ Figura 27-4. Visualización de la calidad del ADN mediante electroforesis en gel agarosa.

Ánodo

Los fragmentos de ADN van hacia el polo positivo, ya que la carga de la molécula de ADN es negativa por la presencia de grupos fosfato. Los fragmentos más pequeños pasan primero a través de la red de poros del gel, mientras que los más grandes se van retrasando. Si hay muchos fragmentos de un mismo tamaño se agruparán todos juntos, por lo que podremos verlos formando una banda en el gel.

Cátodo

e Tubo e-control Marcador de ADN ADN de distintos PM (pes os moleculares) conocidos

Fotografía del gel de agarosa tras la electroforesis, visualización con luz ultravioleta

Tubo 1 ADN de alta calidad

O

Polo C

1

c::==J

c::==J

Pocillos

slots

...-

c::==J c::==J c::==J

c::==J

Fragmento de mayor PM

c::==J c::==J

Tubo 2 ADN muy fragmentado Apoptótico

Fragmento de mayor PM Polo +

modelo de cámara utilizado, se colocan los peines) y se deja solidificar. Una vez que esto sucede, la agarosa forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de la agarosa. Se pueden emplear dos tipos de tampones: trisacetato (TAE) o tris-borato (TBE), que tienen diferentes propiedades en la prepar ación de los geles y en la electroforesis posterior. El TAE tiene baja fuerza iónica y baja capacidad tamponante, lo que hace necesaria la recirculación del buffer cuando los tiempos de electroforesis son largos, es decir, en electroforesis pro longadas tiende a agotarse, pero permite obtener mejor separación de bandas, sob re todo si son de gran tamaño (2= 1 kb), especialmente las que son> 10 kb. El TBE tiene elevada fuerza iónica y alta capacidad tamponante, lo que permite tra-

Colorante de corrida: azul de bromofenol Indica el frente de corrida de la electroforesis

o

Cable rojo: polo positivo

Cable negro: polo negativo

Figura 27-5. Visualización del frente

de corrida de la electroforesis en gel de agarosa, usando azul de bromofenol.

e

Gel sumergido en el amortiguador

342

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Fuente de poder: voltaje aplicado

Cámara de electroforesis

... . bajar sin recirculación en electroforesis largas; puesto que es muy estable, se puede reutilizar varias veces y da mejor resolución para fragmentos < 1 kb. La receta para la preparación de estos buffers se refleja en la tabla 27-3 . Para obtener una buena resolución se debe preparar el gel con un adecuado grosor, entre 3-4 mm. El peine se emplea para formar los pocillos do nde se cargarán las muestras. El grosor del peine también es importante y afecta enormemente a la resolución. Con un peine fino (1mm) se obtienen bandas m uy bien definidas, mientras que con un peine grueso se obtienen bandas grue sas con menor resolución. Antes de apli car la muestra se debe constatar que no hayan quedado burbujas, tanto en el cuerpo del gel como entre los dientes del peine, ya que pueden hacer que la electroforesis no migre de forma homogénea. C onviene dejar enfriar la solución de agarosa más el buffer hasta los 60 oC antes de volcarlo en el molde, el cual debe tener perfectamente obstruidos sus bordes . Nunca debe volcarse el gel muy caliente, ni por debajo de 60 oC, pues aparecerán ondulaciones por el enfriamiento desigual del gel, que luego provocarán distorsiones en la corrida. Una vez el gel se ha solidificado, debe sumergirse en la cubeta de electroforesis y debe que dar cubierto por el buffer de corrida (1mm, aproxim adam en te). Posteriormente, se retira el peine, pero nunca hay que hace rlo antes de tiempo, pues se pueden producir roturas en los pocillos generados por el peine (se rompe el fondo), con la consecuente pérdida de la muestra cuando se siembra en esos recipientes. Algu nas veces las bandas aparecen onduladas en algunas líneas en el gel yeso suele ser a causa de que hay restos de gel secos pegados en los dientes del peine. Para evitarlo, hay que limpiar bien el peine y eliminar los po sibles residuos de gel seco y tener cuidado al retirar el peine del gel y evitar que arrastre parte de éste. Se recomienda mantener el gel a 4 oC durante 30 mi nutos o sumergirlo en el buffir antes de retirar el peine. • Aplicación de la muestra (siembra) en el gel/carga del gel: la cantidad mínima de ADN que puede ser detectada mediante tinción es de lOng y la cantidad máxima de ADN que puede haber en una banda definida es de 100 ng, aproximadamente. Conviene dejar que el gel se estabilice con el buffer antes de realizar la siembra. Utili zando una mi cropipeta se mezcla la mues tra con un buffer de carga y,

La eLectroforesis en geL de agarosa se em plea en e lla borator io de d ia gnóst ico m ol e cul a r para ve r la calida d del ADN y s u de grad a ción.

.... Reactivo

Instrucciones par preparación

SoLución EDTA O, 5M pH 8/100 mL

Pesar 18,61 g de EDTA y disolver en 70 mL agua . Sólo se disolverá hasta que la solución alcalina alcance un pH 8. Ajustar primero con lunetas de sosa (unas I 10), dejar que se disuelvan e ir agregando poco a poco más lunetas hasta llegar a pH 6 o 7 y aquí ajustar hasta 8 con gotitas de sosa 5 o 10M, después aforar a 100 mL

TBE 1X (0,089M tris, 0,089M ácido bórico, 0,002M EDTA)

Se prepara una solución 5X y, luego, para hacer el gel se usa a 1Xo 0,5 X. Para preparar solución 5X, pesar 54g de tris base y 27,5g de ácido bórico, I dis olver en 800 mL de agua y añadir 20 mL de EDTA 0.5M , pH 8. Aforar a 1 L. I Una solución de TBE bien preparada deberá tener un pH cercano a 8,3 sin I neces idad de ajustarla

I

I

I

Receta al50X para la corrida se diluye a 1X. Para una solución 50X: pesar 242 g de tris base y disolverlo en 500 mL de agua estéril, agregar 57,1 mL de ácido acético glacial y 100 mL de EDTA 0,5M pH 8. Afora r a 1 L

TAE 1X (0,04M tris-acetato, 0,002M EDTA)

Xilenocianol al 0,02% en glicerol al 50% Azul de bromofenol al 0.02 % en glicerol al 50%

CoLorante de corrida (marcador) BrEt I

I I

I I

Se preparan 10 mg/mL guardado a 4 oC protegido de la luz, en recipiente oscuro .. envuelto en papel de aluminio

BrEt: tinción con bromuro de etidio; EOTA: anticoagulan te ácido et ilendiaminotet raacético ; TAE : trisacetato ; TBE: tr is - borat o.

343

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..

¿Cuál es el motivo que hace que la movilidad de las bandas se reduzca en la electroforesis?

••

A

lentamente, se introduce la muestra en la muesca (slot) del gel sumergido. El volumen máximo de la solución que puede ubicarse en el slot está determinado por las dimensiones de éste, como consecuencia directa del tipo de peine que se ha utilizado en la preparación del gel (por el número de dientes y la separación entre ellos). Con una pipeta, cada muestra se vierte en un pocillo, mezclada previamente con 1 o 211Lde colorante de corrida. Generalmente los colorantes de corrida llevan una sustancia espesa, como glicerol o sacarosa, que permite que la muestra se deposite hacia el fondo del pocillo. No es necesario utilizar toda la muestra de PCR en una corrida, puede utilizarse del 10 al 20% de la cantidad total de la PCR (p. ej., si son 5011L, se cargarían 511L de muestra). En un parafilm se pueden depositar unas gotitas de colorante (las necesarias según el número de muestras que se van a cargar) y después se agrega la gotita de la muestra a cargar sobre la gota del colorante. Con cuidado de no generar burbujas, se mezcla bien, subiendo y bajando con la pipeta. La punta de la pipeta se mete un poco en el pocillo (sin romperlo) y lentamente se vacía la pipeta para cargar el gel. Para evitar que las muestras se derramen y para que no se mezclen unas con otras, no hay que llenar el pocillo hasta arriba. Es necesario utilizar marcadores de ADN de tamaño conocido (adquiridos, por lo general, de proveedores comerciales), que deben incluirse en la siembra a ambos lados del gel (derecho e izquierdo). Por lo menos un carril del gel siempre debe tener un mar cador de peso molecular como estrategia de control, para saber el tamaño de las bandas. No se debe olvidar cargar en el gel los controles negativo y positivo. La PCR sobrante se guarda congelada a -20 oC. • Desarrollo de la electroforesis: una vez efectuada la siembra de todas las muestras, se procede a tapar la cubeta de electroforesis y enchufar los cables correspondientes para aplicar el voltaje deseado; así, el ADN migrará hacia el ánodo (rojo). Si los electrodos se colocan correctamente (con el cable rojo conectado al polo positivo y el cable negro al negativo) , se formarán burbujas en el ánodo y el cátodo (debido a la electroforesis) yen pocos minutos elloading buffer (tampón de carga) comenzará a migrar desde el slot hacia el cuerpo del gel. El voltaje al que se recomienda correr un gel de agarosa es 4-10V/cm (de distancia entre ánodo y cátodo, no de la longitud del gel) en electroforesis horizontal. El intervalo efectivo de separación en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se incrementa, es decir, cuando el voltaje es demasiado bajo, la movilidad de las bandas se reduce y las bandas se ensanchan debido a la difusión. Cuando el voltaje es demasiado alto, disminuye la resolución, a causa principalmente del sobrecalentamiento del gel. Para obtener una resolución máxima de fragmentos de ADN mayores de 2 kb, los geles se deben correr a no más de 5 V/cm. El incremento de voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel. • Tinción del gel/detección por tinción con bromuro de etidio (BrEt): en los geles de agarosa se añade BrEt, sustancia que se intercala entre las bases nitrogenadas del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con la luz ultravioleta y así se puede observar las bandas de ADN en el gel. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz ultravioleta y se verán las bandas correspondientes a las muestras de ADN aplicado y los marcadores de peso molecular.

TÉCNICAS DE VISUALIZACiÓN DE FRAGMENTOS E INTERPRETACiÓN DE RESULTADOS Los ácidos nucleicos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo que permite evaluar su integridad y estimar su concentración, mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre los pares de bases que conforman el ácido nucleico. El BrEt se utiliza ampliamente para la visualización de ADN y ARN, pero reduce la movilidad electroforética de ADN lineal en un 15 %. La presencia del BrEt permite que el gel pueda ser examinado bajo luz ultravioleta en cualquier momento durante la corrida. Sin embrago, éste es un reactivo alta344

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mente tóxico, con propiedades mutagénicas. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos (p. ej., SYBR Green) desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis. Los colorantes de corrida, como el xi lenocianol o azul de bromofenol (v, Tabla 27 -3 ), dan una idea de cómo van mi grando los fragmentos de ADN; así, en gel de agarosa al 1 % el azul de bromofenol migra junto con los fragmentos de 300 pb Y el xilenocianol migra igual que los fragmentos de 4 kb. El colorante azul de bromofenol es el trazador que más se emplea; se puede unir débilmente a las proteínas, dotándolas de color azul. Se usa frecue ntemente como marcador de avance en electroforesis (Fig. 27-5 ) porque es viable a pH neutro y alcalino, es una molécula pequeña, ionizable y posee carga negativa a pH superior a 4,6, de modo que migra al ánodo. Las proteínas y los ácidos nucleicos son mayoritariamente incoloros y cuando están sometidos a electroforesis es importante detener el avance antes de que sobrepasen el extremo del gel. Cuando el T EL observa que el colorante alcanza el extremo anódico del gel, debe desconectar la corriente y dar por terminada la separación.

El bromuro de etidio [BrEt) es un fuerte agente mutagénico. posiblemente también cancerígeno y teratogénico, que debe ser manipulado con sumo cuidado empleando guantes.

Tinción de geles de agarosa La forma más conveniente para visualizar el ADN en geles de agarosa es teñirlo con el colorante fluorescente BrEt. Hay dos m aneras de teñir el gel: cuando la agarosa está a unos 60 oC, antes de vertirla, se añade BrEt directamente para que quede a una concentración de 0,5 }lg/mL en el gel y de esta forma cuando termina la corrida puede visualizarse el gel. La desventaja es que el bromuro retarda la migración de las moléculas de ADN, y además la cámara de electroforesis queda contaminada con el bromuro. Si la tinción se realiza después de la corrida, el gel se sumerge en una solución de 0,5 }lg/mL de BrEt. El ADN teñido con BrEt se detecta con radiación ultravioleta a 245 nm. El ADN absorbe la radiación ultravioleta a 254 nm y la transmite al colorante. A 302 y 366 nm la luz ult ravioleta es absorbida directamente por el colorante. En ambos casos la energía es reem itida a 590 nm, en la región rojo naranja del espectro visible. El BrEt usualmente se prepara como una solución almacenada de 10 mgl mL en agua y se mantiene a oscuras, a temperatura ambiente (v. Tabla 27-3 ).

Fotografiado de geles de agarosa Será necesario disponer en el laboratorio de un transiluminador de luz ultravioleta y equipo de fotografía (existen cámaras especiales y de cómputo específico para guardar la imagen del gel). El fotografiado de geles puede efectuarse utilizando luz ultravioleta incidente o transmitida. Muchas de las fuentes de luz ultravioleta disponibles comercialmente emiten a 302 nm. La fluorescencia emitida por el complejo ADN:BrEt es considerablemente más alta a esa longitud de onda que a 366 nm y ligeramente menor a 254 nm. El film más sensible y el más utilizado es el Polaroid tipo 57 o 667, una exposición de apenas unos pocos segundos es suficiente para obtener imágenes de bandas que puede contener hasta 10 ng de ADN. Una vez desconectada la corriente, retirados los cables y la tapa de la cubeta, se introduce el gel en un transiluminador ultravioleta y se fotografía (Fig. 27-6 ). Cuando el gel no tiene incluido el BrEt, es decir, cuando no se incluyó durante el proceso de gelificación, se debe teñir durante 20 minutos, aproximadamente. Una vez fotografiado el gel de agarosa tras la electroforesis, el BrEt debe desecharse en el recipiente especial previsto para él y para residuos sólidos. Asimismo, deben desecharse las puntas y guantes contaminados. Si se derrama una pequeña cantidad, hay que absorber con toallas de papel y después limpiar con alcohol y desecharlas en el lugar oportuno. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta (con transiluminador de radiación ultra-

Tra nsiIuminadar para luz ultravioleta y equipo para fotografiado de geles Equipo computarizado para guardar la imagen del gel fotografiado/ analizador de imágenes

Figura 27-6. Equipo-transiluminador ultravioleta para fotografiado de geles de agarosa tras la electroforesis.

345

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Capítulo 27

La radiaciónultravioleta es peligrosa , particularmente para los ojos , por lo que se debe evitar u na exposición prolo ngada a ella .

Aplicación de técnicas de PCR

y electroforesis al estudio de los ácidos nucleicos

violeta, a 312 nrn) si se cuen ta con un analizador de im ágene s. Los resultados se pueden registrar, tomando una fotografía al gel, con una cámara instantánea o mediante un sistema computarizado de análisis de imágenes. La distancia que recorre por cada fragmento de ADN es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Se puede deducir el pe so molecular mediante el cálculo de una regresión de logaritmo 10 de un marcador conocido respecto a la distancia de migración de cada uno de los fragmentos. Por comparación y extrapolación, se puede averiguar el peso molecular del fragmento de ADN.

APLICACIONES DIAGNÓSTICAS Y FORENSES DE LAS TÉCNICAS DE PCR La técnica de PCR tiene una gran variedad de aplicaciones en diferentes ámbitos

(Fig. 27-7), entre losque destaca su uso en el diagnóstico clínico de diferentes síndromes y patologías hereditarios. Entre las aplicaciones de análisis de la PCR se encuentra el apoyo a la policía en la identificación de sospechosos en el análisis forense. Se comparan los microsatélites del sospechoso con los de las muestras biológicas encontradas en el lugar de un crimen. Otra aplicación muy importante de la PCR en oncología es detectar la inestabilidad de los microsatélites, pues en ciertos tum ores hay defectos en la reparación de ADN que hacen que aparezcan nuevos alelos en las célu las del tumor. ¿Qué apl icaciones pu ed e tene r la téc nica de PCR?

Aplicaciones diagnósticas En los laboratorios de genética se utilizan kits comerciales que permiten detectar algunas de las mutaciones más frecuentes asociadas con determinadas enfermedades genéticas. Muchos de estos kits emplean tiras (membranas) que tienen inc orporadas sondas específicas y se basan en la hibridación inversa. El procedimiento consta de amplificación mediante PCR e hibridación/revelado. Las membranas del test (tira) llevan unidas de forma covalente sondas de ADN que reconocen específicamente fragmentos de las secu encias amplificadas d urante la PCR de cada un o de los genes. Por cad a m utación que se va a analizar hay d os sondas: una para la secuencia n ormal y otra para la secuencia mutada. Se in cluye además una sonda de control de revelado

[

! Detectar mutacion es genéticas que originen enfermedades hereditarias

Aplicaciones de la PCR

I

I

1 Controlar oncogen es Controlar a enfermos que sufren un tipo de cáncer después de haber sido sometidos a un tratamiento con quimioterapia o inmunoquímico

1

1

Cuestiones de paternidad; identificación de culpables en asuntos criminales

Arqu eolog ía Identificación de especies desaparecidas

Tarjeta de identificación genética ---7 secuencias repetitivas (minisatélites, con distintas longitudes para cada individuo)

Figura 27-7. Resumen de las diferen-

Hay que saber la secuencia característica del gen mutado

Detección de patógenos : Escherichia coli y otros. Seguridad alimentaria en detección de alimen tos transgénicos

t es apl ica ciones de la técnica de PCR en diferentes campos/áreas .

346

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Resultado del test: compatible/incompatible

·.. . y una s líneas de colores para el control de la posición de la tira y para ayudar a la interpretación de los resultados. Durante la hib ridación las sondas se unen de forma específica con los fragmentos de ADN amplificados durante la PCR. Una vez hibridados los productos de la PCR con las sondas de la tira y tras una serie de lavados para eliminar cualquier pegado inespecífico, se procede a la detección de la hibridación (revelado). Otra de las utilidades de la PCR es el uso de la triplet repeat primed (TP -PCR), una variante de la PCR empleada para el diagnóstico de enfermedades por expansiones inestables de trinucleótidos o tetranucleótidos, como el síndrome del cromosoma X frágil (expansión del triplete CGG), la distrofia miotónica de Steinert (expansión del triplete CTG) o la corea de Huntington (expansión del triplete CAG ). En la figura 27-8 se presenta la imagen (electroferogram a) qu e debe interpretar el TEL tras el análisis de una muestra de ADN mediante TP-PCR en un secuenciador. Además, se representa el patrón de una mujer premutada para el síndrome del cromosoma X frágil. En la figura 27-9 se resumen algunos de los principales usos de las variantes de la PCR en el diagnóstico clínico de las diferentes enfermedades o síndromes genéticos.

Aplicación de las técnicas de PCR en la genética forense La genética forense es una especialidad que incluye el conjunto de conocimientos de genética necesarios para resolver ciertos problemas jurídicos. El tipo de pericia más solicitado al laboratorio de genética forense por los tribunales son casos de investigación biológica de la paternidad, así como pruebas periciales de criminalística bioló gica y de identificación de víctimas y sospechosos. El ADN repetitivo en tándem está formado por bloques de ADN que se repiten consecutivamente y se clasifican en ADN satélite, ADN minisatélite y ADN microsatélite. Los ADN minisatélite y microsatélite, altamente polimórficos y con herencia mendeliana simple, son los que más se utilizan con fines forenses. Consisten en repeticiones de fragmentos de ADN

180

180

180

180

180

180

180

5.000 4.000 3.000

180

180

180

180

180

70 repeticiones CGG

-:

7.000 6.000

180

2 interrupciones AGG

70 = (CGG)9AGG(C~G)9AGG(CGG)50

70 repeticiones CGG y 2 interrupciones AGG, riesgo de expansión: 60 %

j

29 repeticiones CGG

2.000 1.000

Si hay> 35 repeticiones CGG consecutivas sin interrupciones AGG, hay mayo r riesgo de expansión del alelo de cara a la futura descendencia Total: dos interrupciones AGG

Figura 27-8. Electroferograma obte nido por TP-PCR en el diagn óstico del s índrome del cromosoma Xfrágil de una mujer premutada . 347

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Capítulo 27

... Figura 27-9. Diferentes aplicaciones de la PCR en sus variantes para el diagnóstico de algunas enfermedades o síndromes en el laboratorio de genética molecular.

Aplicación de técnicas de PCR y electroforesis al estudio de los ácidos nucleicos

Síndrome del cromosoma X frágil: PCR + Southern blot/ TP-PCR

STEINERT/DM1 : PCR + Southern blot análisis de fragmentos

Corea de Huntington: PCR convencional análisis de fragmentos

\

? Hemocromatosis hered itaria: PCR + hibridación reversa (tiras reactivas)

Cáncer de mama/ovario: PCR + DHPLC, MLPA/ secuenciación

Trombofiliahereditaria: PCR + hibridación reversa (tiras reactivas) o análisis defragmentos

HLA·DQ2 HLA·DQ8 Celiaquía: PCR + tiras reactivas

Fibrosis quística: Secuenciación/ tiras reactivas, etcétera

Los polimorfismos puntuaLes de secuencia [single nucleotide polymorphisms, SNPL sean de cromosomas autosámicos, cromosoma Y o ADN mitocondrial, tienen una enorme importancia en la práctica forense.

[ Etcétera

Deleciones cromosoma Y/SRY: PCR convencional o PCR + (tiras reactivas)

en número variable denominados VNTR (variable number o/ tandem repeats). Las repeticiones en el ADN microsatélite son de tamaño pequeño (de 2 a 6 pb) por lo que se denominan STR (short tandem repeats). En el campo forense se usan básicamente STR de 4 y 5 pb en la unidad de repetición. Además de los STR en cromosomas autosómicos, son de gran importancia los STR de cromosoma Y, en particular para los delitos de agresión sexual. El ADN mitocondrial es eficaz en muestras degradadas y es el único polimorfismo que se puede analizar en cabellos sin bulbo, que se encuentran con frecuencia en la escena de un delito. Los polimorfismos que se pueden valorar por PCR, antes de ser aceptados para la práctica forense, deben cumplir una serie de requisitos y pasar sucesivos controles de validación. Se suelen analizar hasta 15 STR a partir de la misma muestra biológica utilizando secuenciadores automáticos y PCR multiplexo En el análisis criminológico se suelen usar STR de pequeño tamaño « 200 pb) Ylos STR de 5 repeticiones cuando se trata de analizar muestras mezcladas de diferentes individuos, pues tienen menos artefactos que otros STR. El genoma mitocondrial contiene información de gran utilidad y, en ocasiones, decisiva judicialmente para el establecimiento de la identidad o la fuente de un determinado espécimen biológico, y desemspeña un papel crucial en la identificación criminal. Por su mejor comportamiento en muestras degradadas, el ADN mitocondrial es esencial en muchos casos de identificación a partir de restos óseos. A pesar de que representa sólo el 2 % del componente cromosómico humano, el cromosoma y posee unas características que lo diferencian del resto de los cromosomas y le confieren gran utilidad desde el punto de vista forense y antropológico. Es de pequeño tamaño (,..- 60 millones de pb), acrocéntrico y se hereda en bloque de padres a hijos, lo que constituye un grupo de ligamiento. Los STR de cromosoma Y mínimos que se emplean en los laboratorios forenses son: DYS 19, DYS3891, DYS38911, DYS390, DYS391, DYS392 y DYS393. Los polimorfismos del cromosoma Y se usan en los casos en que no se tiene la muestra del presunto padre y los supuestos hijos son varones. Así, si se cuenta con otro familiar masculino de la línea paterna, su cromosoma Y será idéntico al del padre no disponible y al de su supuesto hijo varón. Pero en estos casos, hay que tener en consideración que el resultado,

348

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·...

..

basado exclusivamente en microsatélites de Y, no excluye como padre a ningún otro varón de esa línea paterna. Por lo tanto, el estudio debe complementarse con marcadores autosómicos cuando sea necesario eliminar esa posibilidad. Además, los polimorfismos de cromosoma Y son importantes en el análisis de delitos sexuales en los que el esperma u otras células del agresor están mezclados con las células femeninas de la víctima. Las características de los SNl?, puesto que poseen una tasa de mutación muy baja, los hacen idóneos para las pruebas de paternidad. Tradicionalmente, las pruebas de paternidad se han venido realizando principalmente a través de la tipificación sanguínea, incluyendo tanto pruebas serológicas como grupos sanguíneos (hemotipificados), así como análisis electroforéticos del polimorfismo de proteínas y enzimas sanguíneas (alozimas). Actualmente, esas pruebas han sido sustituidas por el uso de microsatélites. Se comparan los alelas que presenta el hi jo para una serie de microsatélites (hasta 15) con los de los supuestos padres y se comprueba si son compatibles. De acuerdo con el principio mendeliano, uno de los alelas que presenta un individuo proviene del padre y el otro de la madre. Se suelen emplear los SNP para la resolución de casos complejos de parentesco o identificación y también para la determinación del origen geográfico de una muestra biológica o para determinar características físicas como el color del pelo (p. ej., pelirrojo) o el de los ojos. Para que un microsatélite se considere útil como marcador molecular, toda la variación de la secuencia o polimorfismo debe hallarse dentro del motivo repetitivo y, por el contrario, las regiones flanqueantes deben estar altamente conservadas hasta el punto de que no presenten ninguna variación en la secuencia. Partiendo de esta hipótesis se diseñan primers, es decir, fragmentos de ADN que tienen la misma secuencia que los extremos de las regiones flanquentes para poder amplificar (producir un alto número de copias) un microsatélite mediante la PCR. Los fragmentos así producidos son separados de acuerdo con su longitud en pares de base a través de una electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, los seres humanos son diploides, es decir, poseen dos juegos completos de cromosomas y, por lo tanto, para un locus microsatélite pueden presentar un alelo (si ambos progenitores transmitieron alelas de la misma secuencia y tamaño) o dos alelas (si cada progenitor transmitió un alelo de tamaño diferente). Para seleccionar los marcadores que se van a utilizar, éstos deben tener: alta variabilidad; herencia estable (baja tasa de mutación); elevada reproductividad y precisión; ausencia de alelas nulos; ser un procedimiento fácil, rápido, económico y potencialmente automatizable; que la información del genotipo pueda ser transferida rápidamente; que la fuente de ADN no esté limitada únicamente a muestras sanguíneas frescas ni a grandes cantidades de ADN y, por último, que presente una segregación independiente con otros marcadores al ser combinados en la prueba. La PCR se realiza con uno de los primers marcados con una molécula fluorescente, por lo que el producto de PCR fluorescente se procesa igual que las muestras de secuenciación y se realiza la electroforesis capilar. En este caso, además de poder diseñar el experimento de tal manera que los tamaños de los fragmentos sean diferentes para analizar varios de manera simultánea, se puede marcar con diferentes moléculas fluorescentes, lo que permite analizar más fragmentos a la vez, es decir, fragmentos con el mismo tamaño pero marcados con diferente molécula fluorescente. La prueba de ADN aplicada en criminalística tiene cuatro etapas:

1. Análisis en el laboratorio del mayor número de polimorfismos para obtener un perfil genético de la muestra. 2. Comparación de los resultados obtenidos con el inculpado o la víctima. 3. Si los patrones son diferentes en un grupo o más de uno, el vestigio biológico no se corresponde con el individuo con el que se compara. 4. Emisión del correspondiente informe médico-legal y, en el caso de que sea solicitado, la comunicación de resultados en el juicio oral.

¿Cuántos alelas es necesario analizar para obtener una prueba de paternidad?

Generalmente los microsatélites se analizan en un secuenciador automático.

349

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·.. No debo olvidar que... •

La electroforesis en gel de agarosa es una de las técnicas más utii s para analizar y caracterizar ácidos nucleicos y permite visualizar la calidad del ácido desoxirribonucleico (ADN) y observar si existe degradación.

•

Las moléculas de ADN migran hacia el ánodo [polo positivo, rojo) al estar cargadas negativamente debido a los grupos fosfato que contienen.

•

El bromuro de etidio es una sustancia mutagénica y carcinógena potente y moderadamente tóxica que el técnico especialista de laboratorio debe manipular con cuidado.

•

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real es una técnica cuantitativa.

•

En la PCR se simula lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN.

•

La reacción de la PCR es muy sensible a cambios de iones, contaminantes que pueden estar en el ADN, el agua, etcétera.

•

La técnica de PCR y sus diferentes variantes tienen múltiples aplicaciones en diferentes áreas y disciplinas, entre las que destacan el diagnóstico clínico y la ciencia forense.

': Cas~::,~~á~ti'c O :', ;', ...

1. Entre Las siguientes afirmaciones, señaLar La faLsa: a. La primera etapa de la PCR consiste en la separación de los dos filamentos de ADN. b. La temperatura ideal que permite la unión del primer con la cadena de ADN depende del número de nucleótidos que lo constituye, pero no de los tipos de nucleótidos. c. Los primers confieren especificidad a la PCR. Sólo amplifican la secuencia que se quiere. d. Las temperaturas de annealing oscilan entre 50

y 70 -c. 2. In dicar La r espu est a inco r re cta ent re Las siguie ntes: a. Durante la fase de hibridación en la PCR, los primers que están en la master mix se unen a sus secuencias complementarias. b. En la fase de elongación de la PCR, la Taq poli merasa incorpora los nucleótidos para replicar el fragmento de ADN. C. La PCR tiene un límite de tamaño del fragmento que puede amplificar, pero los fragmentos de más de 500 pb son frecuentes. d. Los cebadores o primers son secuencias de una sola cadena de 10 a 30 nucleótidos, que se unen en unas zonas específicas de cada una de las cadenas desnaturalizadas del ADN .

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~ .. .--;::; .....~;: V ~~~~ Apoptosis (muerte celular)

.. Figura 34-1. División celular normal.

definición ha ido restringiéndose a la masa o bulto que se debe a un aumento en el número de células que lo componen, por lo que en la actualidad se asocia con proce sos relacionados con cáncer. No obstante, en esta definición se diferencian dos tipos de tumores: benignos y malignos. Las diferencias entre ambos se reflejan en la tabla 34-1. Los tumores benignos son de crecimiento lento, no se propagan a otros tejidos adyacentes, no hacen metástasis y rara vez recidivan tras ser extirpados. Las células de los tumores benignos permanecen juntas y a menudo se rodean por una membrana de contención o cápsula; además, estos tumores generalmente no constituyen una amenaza para la vida, se pueden extirpar y, en la mayoría de los casos, no reaparecen. Los tumores malignos son de crecimiento rápido, descontrolado e independiente del tejido donde comenzó el crecimiento. Se propagan a otros tejidos, dando lugar a metástasis diseminadas por el organismo y recidivan con frecuencia tras ser extirpados, lo que provoca la muerte del individuo en un período de tiempo variable si no se somete a tratamiento. El término neoplasia significa tejido de nueva formación. Se utiliza para designar una masa anormal de tejido causada por la multiplicación a un ritmo superior al normal de las células que lo constituyen, con un sobrecrecimiento que está descoordinado con el de los tejidos normales y que persiste en su anormalidad después de que haya cesado el estímulo que provocó el cambio. Normalmente se aplica de forma genérica a los tumores malignos) por lo que se utiliza habitualmente como sinónimo de cáncer.

e

.. Figura 34-2. Divis ión de célu las tu -

morales.

Identificación del proceso de desarrollo tumoral

CLASIFICACiÓN Y EPIDEMIOLOGíA DE LAS NEOPLASIAS

En la actualidad, se conocen más de 200 tipos diferentes de cáncer, que pueden afectar a personas de todas las edades, incluso a fetos, y que igualmente pueden dañar una gran diversidad de tejidos del organismo. El diagnóstico de estos procesos está, en gran medida, influido por el tipo de tumor y la extensión de la enfermedad, aunque con frecuencia, en los estadios iniciales, pue den interpretarse los síntomas como causados por otras patologías. Si bien las primeras manifestaciones provienen de la suma de síntomas, análisis de laboratorio yexploraciones radiológicas, el diagnóstico definitivo requiere un examen histológico adecuado de una biop sia del tejido tumoral.

Clasificación Se diferencian dos ti pos de tumores: benigno s y maligno s.

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El cáncer se clasifica según el tejido a partir del cual se originan las células tumorales. Todos los tumores, benignos y malignos (cuyas características principales se recogen en la tabla 34-1) tienen dos componentes básicos en su estructura: por un lado las células proliferativas que forman el propio tumor y constituyen su parénquima, por otro su estroma de sostén, integrado por tejido conectivo y vasos sanguíneos, formados por tejidos no tumorales cuya formación ha sido inducida por el propio tumor.

...

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_ ~~ b la 34~1. Características de los tumores benignos

y malignos

Benigno

Característica

Maligno

Diferenciación

Las células tumo rales se asemejan a las células maduras originales

Las células tumorales pueden no asemejarse a las células maduras del tejido original

Tasa de crecimiento

Lenta, puede interrumpirse o retroceder

Rápida, autónoma ; generalmente no se interrumpe ni retrocede

Tipo de crecimiento

Se expande y se des plaza

Invade, destruye y reemplaza

Metástasis

No

Sí

Efecto en la salud

Generalmente no ocasiona la muerte

Puede ocasionar la muerte si no se diagnostica y se trata

432

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.

,

MóduLo IV

Fisiopatología general

11'

•

La nomenclatura oncológica se basa en el componente parenquimatoso y se usan dos criterio s de clasificación: el tejido del que der ivan y su carácter benigno o maligno. En la tabla 34-2 se recogen algunos de los tumores más habituales: • Tumores benignos. El nombre que se les aplica acaba en el sufijo -om a . En algunos casos derivados de tejido epitelial se utiliz a el sufijo -aden om a, porque el tejido de origen forma glándulas. • Tumores malignos. Su nombre suele terminar con el sufijo -sar com a o -carcinoma. Algunos de los más frecuentes son:

El cáncer se clas ifica según e l tejido a pa rt ir del cua l s e originan las células tumorales . Es el problema sociosanitario más importante en la actualidad .

Carcinomas. Tienen su origen en el tejido epitelial, como el carcinoma de colon, el adenocarcinoma, el carcinoma de mama, etcétera. Sarcomas. Se originan en el tejido mesenquimatoso, como el osteosarcoma o el liposarcoma. Gliomas. Derivan de las células gliales que sirven de apoyo al tejido nervioso. Leucemias y linfomas. Son cánceres hematológicos.

Epidemiología En términos absolutos, el cáncer es el problema sociosanitario más importante en la actualidad en España: se estima que hay má s de 1.500.000 de afectados y unos 200.000 casos nuevo s al año. Asimismo, el cáncer es la segunda causa de muerte en España, después de las enfermedades cardiovasculares, y alcanza un valor cercano al 270/0 de las muertes que se atribuyen a procesos relacionados con el cáncer. Estratificando estos datos por sexos, el cánc er es la primera causa de muerte en hombres (31 %) Y la segunda en mujeres (200/0), tras las enfermedades cardiovasculares, que son la primera causa de muerte. En las tablas 34-3 y 34-4 se recogen algunos datos de la incidencia y mortalidad de los pr incipales tipos de cáncer en hombres y mUJeres. :

Tabla 34-2. Denominación de los tumores más frecuentes Tejido

Benigno

Maligno

Piel

Papiloma

Carcinoma espinocelula r Carcinoma basocelular

Tejido glandular

Adenoma Cistoadenoma

Adenocarcinoma

Melanocitos

Nevo

Melanoma

Tejido fibroso

Fibroma

Fibrosarcoma

Tejido adiposo

Lipoma

Liposarcoma

Cartílago

Condroma

Condrosarcoma

Hueso

Osteoma

Osteosarcoma

Músculo liso

Leiomioma

Leiomiosarcoma

Músculo estriado

Rabdomioma

Rabdomiosarcoma

Endotelio de los vasos sanguíneos

Hemangioma

Hemangiosarcoma

Endotelio de los vasos linfáticos

Linfangioma

Linfangiosarcoma

Células precursoras de la sangre yafines

Cistoadenocarcinorna

Leucemia Linfoma Mieloma múltiple

433

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c A,

_7¿;}';

Tumor

Incidencia

Mortalidad

Cáncer de ma ma

28,5%

15,6%

Cáncer colorrectal

15,4%

15,6%

Cáncer de úte ro

5,7%

3,0%

Cáncer de ovario

4,1%

4,8%

Cáncer de pulmón

4,0%

7,1 %

Fuente: Sociedad Española de Oncología Médica [2013].

¿Qué factores predisponen al cáncer?

En los últimos años se ha demostrado un aumento en la prevalencia del cáncer en la población general, fundamentalmente debido a factores como el mayor envejecimiento de la población, el aumento en la incidencia de muchos tumores malignos y el incremento de la supervivencia de la población afectada, por la mejora indudable de los tratamientos disponibles. Desde el punto de vista epidemiológico, existen una serie de factores que intervienen de forma apreciable en la predisposición de la población a desarrollar una enfer medad neoplásica. Entre ellos se encuentran la edad, los factores geográficos o arnbientales, hereditarios o condiciones relacionadas con patologías preneoplásicas. No obstante, no se debe pensar en el cáncer como una enfermedad de causa única, sino como el resultado final de la intervención y confluencia de múltiples factores, que se clasifican según los grupos mencionados.

Edad En líneas generales, la probabilidad de desarrollar un cáncer aumenta con la edad, lo cual puede explicarse por la acumulación de mutaciones somáticas asociadas a la aparición de tumores malignos, y también puede influir el deterioro de la inmunocompetencia que acompaña a la edad. Antes de los 15 años de edad el cáncer es raro, pero representa la segunda causa de muerte para el grupo de los niños y los más frecuentes son tumores congénitos, blastomas, leucemias y tumores cerebrales. A partir de los 25 año s, la incidencia de cáncer se duplica cada 5 año s y la mayor mortalidad se localiza entre los 55 y 75 años. Por ejemplo, en hombres, la posibilidad de desarrollar un carcinoma de pró stata aumenta con la edad a partir de los 50 años y se acerca a cifras del 1500/0 a los 90 años.

Sexo El sexo es un factor condicionante importante que se debe con siderar en la apari ción de cáncer. En general, el cáncer es má s frecuente en hombres que en muj eres y presenta una mayor mortalidad. Las neoplasias más frecuentes son, en muj eres, cán-

Tumor

Incidencia

Cáncer de próstata Cáncer de pulmón Cáncer colorrectal Cáncer de vejiga Cáncer de estómago Fuente : Sociedad Española de Oncología Médica [2013].

434

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Mortalidad

cer de mama, tumor colorrectal, cáncer de útero y de ovario; y en hombres, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de próstata y de vejiga. En la actualidad, el cáncer de mama ha aumentado notablemente su incidencia, aunque ha disminuido su mortalidad, mientras que el cáncer de pulmón ha aumentado su incidencia y ha mantenido su mortalidad.

Factores ambientales Las sociedades industrializadas exponen a su población a numerosos agentes tóxi cos ambientales, tanto en el aire como en el agua o los alimentos, que actúan como agentes carcinógenos y se asocian con el incremento de la incidencia y la morbilidad de algunos de estos procesos, como el cáncer de pulmón (por contaminación ambiental) o el cáncer de vejiga (por sistemas químicos de cloración de aguas).

Dieta En la alimentación que se ingiere habitualmente se encuentran, por un lado, elementos que pueden disminuir el riesgo de cáncer, como las dietas ricas en fibra (para el cáncer de colon) o las frutas, verduras, cereales integrales, vitaminas, etc., para otros tipos de tumores. Pero en la dieta también se ingieren sustancias que pueden favorecer la aparición de tumores, como conservantes artificiales, técnicas de preparación de alimentos, contaminaciones con metales pesados y otros agentes químicos carcinogénicos, etc., que pueden favorecer la aparición de tumores como el de estómago, de colon, de riñón o de esófago.

¿Con qué tipo de tumores se asocia el consumo de alcohol?

Tabaco y alcohol A pesar de ser hábitos socialmente aceptados y muy extendidos en la sociedad, ambos elementos se asocian de manera muy clara con algunos procesos tumorales. En el tabaco está plenamente demostrada su asociación con cáncer de pulmón, de boca y faringe, de esófago, etc., por su actuación como carcinógeno, tanto en fumadores activos como pasivos (se considera que el tabaco es el causante del 770/0 de los tumores de pulmón en hombres y del 430/0 en mujeres). De igual manera, el consumo de alcohol se asocia de forma clara con el aumento del riesgo a padecer tumores de hígado, páncreas, laringe y esófago, ya que actúa como un potente carcinógeno.

Radiaciones ionizantes Las radiaciones ionizantes se consideran agentes carcinógenos humanos probados y pueden actuar en todas las etapas de la carcinogénesis, por su capacidad de provocar mutaciones espontáneas tras su exposición. La mayor fuente de exposición para la población se encuentra en los métodos diag nósticos y terapéuticos utilizados en sanidad.

Yatrogenia Algunos tratamientos médicos empleados actualmente y algunos procedimientos diagnósticos utilizados en la práctica habitual pueden aumentar el riesgo de padecer algún tumor, fenómeno conocido como yatrogenia. Es el caso de las radiaciones ioni zantes, mencionadas con anterioridad. Los fármacos quimioterápicos y muchos otros medicamentos, como los que con tienen arsénico, cloranfenicol, anticonceptivos o griseofulvina, se asocian con posibles acciones carcinogénicas. Este tipo de efectos secundarios se deben manejar en términos de riesgo/beneficio y han de administrarse a dosis tan bajas como sea posible para compatibilizar sus riesgos con los objetivos beneficios terapéuticos. 435

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- 11 I.~ ~.,

.

Capítulo34

Los principales factores que int erv ienen en la pred isposició n de l a pob l ac i ó n a desarrollar cá ncer son la edad y los factores geográficos, ambientales o hereditarios.

Identificación del proceso de desarrollo tumoral .

Factores hereditarios En ocasiones, los tumores se desarrollan como consecuencia de actuaciones de factores personales o heredados, modulados por factores carcinogénicos ambientales. Esta herencia se manifiesta en situaciones de síndromes neoplásicos congénitos, asociados a m utaciones conocidas de algún gen que se transmite por herencia genética autosómic a dominante (como la adenomatosis múltiple endocrina); a cánceres familiares, que se asocian con la herencia de genes mutados y aumentan la incidencia en miembros de una misma familia (como el cáncer de mama asociado a los genes BRCA] y BRCA2) o a síndromes que producen cáncer por mecanismos indirectos, que se relacionan con la herencia autosómica recesiva o ligada al sexo y con defectos en la reparación del ácido desoxirribonucleico (ADN) (como la ataxia -telangiectasia).

e

BASES MOLECULARES DEL CÁNCER

La génesis y el desarrollo tumoral son el resultado de numerosas alteraciones mole culare s que se producen en el ADN y donde están implicados los oncogenes y los genes supresores de tumores.

Protooncogenes y oncogenes. Mecanismos de activación de los protooncogenes

Los protooncogenes son genes de cé lulas no tumorales que codifican proteínas que participan en la división y el crecimiento celular en respuesta a un estí mulo. Los oncogenes son genes que han sufrido variaciones en su secuencia de nucleótidos por mutación, amplificación o reordenamiento cromosómico, que les pe rmiten adquirir capacida des para generar cáncer.

Los protoonco gen es son genes de células no tumorales que codifican proteínas que participan en la división y el crecimiento celular en respuesta a un estímulo; cuando no hay estímulo, estas proteínas no actúan. La mayoría de protooncogenes son genes que codifican pa ra los factores de crecimiento, los componentes de las vías de señalización y los factores de transcripción que estimulan el crecimiento celular. Los oncogenes son genes que han sufrido variaciones en su secuencia de nucleótidos por mutación, amplificación o reordenamiento cromosómico, que les permiten adq uirir capacidades para generar cáncer. Proceden de los protooncogenes, con lo que actúan directamente sobre los procesos de regulación del crecimiento y la diferenciación celular, y siguen un patrón autosómico dominante, por lo que la transformación de uno de los dos alelos de la célula provoca una transformación neoplásica. Cuando las mutaciones que afectan a los protooncogenes dan lugar a su transformación en oncogenes, la expresión de estos oncogenes produce una proteína anormal, parecida a la original, pero con algunas características alteradas. Son oncoproteínas, que también responden a los estímulos que promueven la división celular. La diferencia entre la proteína alterada y la normal radica en la respuesta a los estímulos, ya que la pr oteína normal no actúa cuando no hay estímulo, mientras que la proteína alterada continúa estimulando la división celular aún en ausencia del estímulo de los factores de crecimiento, de modo que las células tumorales no necesitan dichos factores de crecimie nto para empezar a dividirse. La producción y actuación excesivas de estas pro teínas son uno de los mecanismos demostrados que inducen la aparición de cáncer. Los oncogenes se dividen en grupos en función de las propiedades que presentan sus productos proteicos de expresión, estos pueden ser: • Factores de crecimiento. Son polipéptidos secretados por las células, cuya función es unirse a un receptor específico y estimular el crecimiento celular. El oncogén sis y el encogen Int-2 son ejemplos de este tipo. • Receptores de factores de crecimiento. Son proteínas de membrana que transmiten la información unidireccionalmente desde la superficie de membrana hasta la zona citoplasmática y el núcleo celular y estimulan la síntesis de material genético. • Transductores de señales. Inician una cascada de reacciones bioquímicas que empieza en el interior de la membrana citoplasmática y termina en el núcleo, con la estimulación de la síntesis de ADN. Los oncogenes de la familia Ras pertenecen a este grupo.

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• Activadores de la transcripción. Codifican proteínas que se unen al ADN y activan la transcripción de otros genes, que a su vez estimulan la replicación de ADN. • Relacionados con la regulación del ciclo celular. En el ciclo celular intervienen las enzimas denominadas cinasas dependientes de ciclinas. • Reguladores de la apoptosis. La apoptosis es la ejecución de una muerte programada, que se asocia con una serie de características morfológicas y cambios bioquímicos de las células maduras. Mediante los mecanismos de activación de los protooncogenes, un protooncogén de una célula normal se transforma en un oncogén de una célula tumoral a causa de cambios genéticos en la secuencia de nucleótidos de los genes que regulan el crecimiento y la diferenciación celulares. Estos cambios o mutaciones suponen un cambio hereditario en la secuencia de nucleótidos de un organismo y pueden tener consecuencias o no en el fenotipo (manifestación externa y apreciable de las características morfológicas de un organismo). Los principales y más frecuentes mecanismos en el material genético son: • Mutaciones puntuales: suponen el cambio de una base nitrogenada por otra y pueden ser: Transiciones: cuando el cambio es entre bases púricas o entre bases pirimidínicas. Transversiones: cuando se cambia una base púrica por una pirimidínica o VIceversa.

Las mu ta cion es puntu al es pu eden ser de dos tipos: tran si ciones y transversiones.

• Inserciones o deleciones: corresponden con la inclusión o pérdida de una base, con consecuencia de pérdida de lectura del código genético correcto. • Amplificación génica: es el incremento del núm ero de copias de un gen dentro del genoma, que conduce a un incremento en la expresión del gen y de la proliferación celular. • Translocaciones: implican roturas cromosómicas y su posterior unión en cromosomas distintos. Este mecanismo produce proteínas que estimulan la síntesis de productos anormales. • Sobreexpresión: existe un aumento de la transcripción de un gen y de la producción de proteínas.

Genes supresores de tumores Los genes supresores de tumores tienen la misión de detener la división celular y de provocar la apoptosis. Su función es prevenir o suprimir la aparición de tumores, con la detención de la proliferación celular si se produce una mutación, ayudando a la reparación del ADN o conduciendo a la célula a la muerte celular programada. Para ello, los genes codifican proteínas que bloquean la progresión a través del ciclo celular o contrarrestan el efecto activador de los factores de crecimiento y actúan como freno de dicha proliferación. Cuando mutan, estos genes se convierten en oncogenes y la célula se divide sin control, pero estas mutaciones son recesivas y deben alterarse los dos alelos para que se expresen. Un ejemplo que se ha podido comprobar de este tipo se produce en el gen RE del cromosoma 13, que al convertirse en encogen e inactivarse da lugar a la aparición de retinoblastoma.

Los genes supreso res de t um ores pr evienen o suprime n la apar ición de t umo res .

Genes de reparación de ADN Cuando el sistema de reparación de ADN de las células es defectuoso como resultado de una mutación adquirida o heredada, la tasa de acumulación de mutaciones en el genoma aumenta progresivamente a medida que el material genético se divide sucesivamente en la multiplicación celular. 437

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-11 A medida que este hecho afecta a oncogenes y genes supresores tumorales, puesto que no puede corregir esos errores, aumenta la probabilidad de que se desencadene un proceso neoplásico.

e La tran sf orma ción qu e s ufre n alguna s células normales del organismo y la capac idad que adquieren de multiplicarse descontroladament e e invadir los tejidos y otros órganos, se deno mina carcinogénesis.

BIOLOGíA DEL CRECIMIENTO TUMORAL

La división celular es un proceso fisiológico que ocurre en casi todos los tejidos y bajo diversas circunstancias. En condiciones normales, el balance entre la proliferación y la muerte celular programada, usualmente mediante el mecanismo de apoptosis, se mantiene estrechamente regulado y se asegura de esta forma la integridad de los órganos y los tejidos. El cáncer tiene su origen en la transformación que sufren algunas células normales del organismo cuando, por alteraciones en su material genético, adquieren la capacidad de multiplicarse descontroladamente e invadir los tejidos y otros órganos. Este proceso se denomina carcinogénesis. Estas alteraciones en el ADN celular pueden ser provocadas por diverso s agentes carcinógenos, como las radiaciones ionizantes, la radiación ultravioleta, los productos químicos procedentes de la industria, el humo del tabaco, la contaminación o tam bién por agentes infecciosos como el virus del papiloma humano (VPH) o el virus de la hepatitis B. Incluso algunas anormalidades genéticas cancerígenas pueden tener su origen durante el proceso de replicación normal del ADN, si no se corrigen los errores que se pueden producir en esta fase, o bien pueden heredarse de los progenitores y estarán presentes en todas las células desde el nacimiento.

Carcinogénesis

La condi ci ón ind is pe nsa ble como re sultad o de la fas e de mutación es que la cé lula alterada sea ca paz de dividirs e.

La carcinogénesis es el proceso por el cual una célula normal se convierte en una célula cancerosa. Se caracteriza por la progresión de varios cambios celulares en el material genético que, finalmente, desembocan en la reprogramación de la célula, provocando que se reproduzca de manera descontrolada, lo cual altera el balance normal entre proliferación y muerte celular y da lugar a la aparición de una masa tumoral. Es un proceso que puede llegar a durar años y pasa por diferentes etapas. La iniciación del proceso comienza cuando agentes carcinó genos actúan sobre una célula de un epitelio y alteran su material genético (es decir, provocan una mutación). Una única mutación no es suficiente para transformar una célula sana en cancerosa, pero es el momento inicial del proceso; cuando se producen múltiples mutaciones en una m isma célula, por la acción de los diferentes agente s carcinógenos o por los erro res en la replicación y la corrección del ADN, ocurre esta tran sformación. Además, estas mutaciones deberían provocar alteraciones en la secuencia de protooncogenes y genes supresores de tumores, que son los encargados de regular el ciclo celular y la muerte celular programada (apoptosis) (Fig. 34 -3). A partir de aquí, las células dañadas (células precursoras) comienzan a multiplicarse a una velocidad ligeramente superior a la normal y transmiten a sus descendientes las mutaciones que registran. La fase de iniciación tumoral implica a las células deno minadas células iniciadas. La alteración que se produce en este punto es irreversible, pero aún es insuficiente para desarrollar plenamente el cáncer. Si agentes carcinógenos y otros agente s promotores actúan de nuevo y de forma repetida sobre las células iniciadas, la multiplicación celular comienza a ser más rápida y la probabilidad de que se produzcan nuevas mutaciones aumenta en lo que se denomina fase de promoción, y las células promocionadas en esta fase. Se con ocen muchos factores que la favorecen activamente, como el tabaco, el alcoholo la alimentación inadecuada. Por último, las células iniciadas y promocionadas sufren nuevas mutaciones, con lo que cada vez se altera más su comportamiento y su crecimiento sin necesidad de factores de crecimiento, formando una masa; a partir de este momento, adquieren la

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Fisiopatología general

MóduloIV

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... Figura 34-3. Sucesión de mutaciones du rante la carcinogénesis . AON: ácido desoxirri bonucleico.

Agente carcinógeno

Mutación que inactiva genes reparadores de ADN Mutación que inactiva genes supresores de tumores Proliferación celular Mutación de protooncogenes que originan un oncogén Cáncer

Mutación que inactiva más genes supresores de tumores

capacidad de invadir tejidos, localmente infiltrando los adyacentes, a distancia, siendo transportadas por el sistema linfático y el sistema circulatorio, que originan las metástasis, en lo que se conoce como fase de progresión. Como resultado, las células cancerosas están aumentadas en número, presentan alteraciones de forma, tamaño y función, y poseen la capacidad de invadir otras partes del organismo. Estas células tienen un gran aumento de la inestabilidad genética y presentan muchas lesiones en el ADN y los cromosomas. Cuando se activan genes que les proporcionan las capacidades invasivas y metastásicas, se alcanza la última etapa del proceso carcinogénico.

Para qu e se origine un cáncer es nece sario que, de forma acumulat iva y con tin uada, se produzcan altera ci ones ce l u l a res duran t e un largo período de tiempo, generalm ente años.

Morfología y crecimiento tumoral Las células tumorales tienen una morfología alterada que depende de la diferenciación y de la anaplasia. La diferenciación celular de un tumor es el grado en que las células cancerosas se asemejan a las células no cancerosas de las que proceden, tanto morfológica como funcionalmente. Las células sanas que constituyen el organismo están muy diferenciadas, lo que les permite llevar a cabo funciones específicas. La anaplasia es la ausencia de diferenciación celular en un tumor, lo que conlleva una falta de especialización o de función celular. Cuanto más indiferenciado sea un cáncer, mayor es su malignidad y más alta su velocidad de crecimiento. Las características del crecimiento de células normales y tumorales difieren notablemente. Cuando se extraen células de un tejido , se pueden disociar y colocar en una placa con un medio de cultivo, de tal manera que, al facilitar las condiciones de tem peratura y aportar los nutrientes adecuados, pueden empezar a dividirse y a proliferar de una manera determinada. En células normales se observan las siguientes características: • Las células se adhieren al fondo de la placa porque necesitan un anclaje a un soporte sólido para crecer, ya que no pueden hacerlo en el medio líquido. Así, sobre una superficie, se fijan, proliferan y forman una monocapa de células, porque su crecimiento no se realiza en grueso vertical, sino que lo hacen únicamente de forma lateral, sobre la pared del recipiente. • Están sujetas a inhibición por contacto, de manera que no crecen de manera inde finida. • Para proliferar, necesitan el aporte de un factor de crecimiento. • Se pueden dividir durante un número determinado de veces y a continuación suelen entrar en senescencia, porque tienen un tiempo de vida definido. Se cree que la circunstancia principal de este proceso es el acortamiento de los telómeros.

Gen eralm ent e, lo s tumores benignos están b ie n diferenci a dos, m ient r as que l os tum or es m align os varían amp l iam en t e: lo s h ay qu e pres en t an t ejido s muy diferenc iad os y ot ros est án indi feren ciad os. Un grado de di ferenciació n baj o in dica qu e las célu l as t u morales so n mu y dif er en t e s a lo qu e d eb en se r para desarro llar s us funcion es habitu al es co r re cta me nte en el organismo .

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Capítulo 34

Las células precursoras d el cáncer se multiplican y tran smiten las mutaciones genéticas que han sufrido a sus descendientes , y en el curso de su evolución se pueden producir nuevas mutaciones adicionales, que les confieren mayor capacidad proliferativa. De esta manera, conforme más avanzado está el cáncer, más mutacion es contiene.

Identificación del proceso de desarrollo tumoral

Las células tumorales tienen un comportamiento totalmente distinto, que se distingue porque: • Han perdido la inhibición por contacto y crecen de manera desorganizada, de manera apilada, formando agrupaciones o cúmulos de células tumorales, que además se disponen en varias capas. • Proliferan sin factores de crecimiento añadidos, ya que las propias células producen por sí mismas estos factores que las estimulan (Fig. 34-4). • Tienen una morfología alterada. • Pueden crecer en la parte líquida del medio de cultivo y formar masas sin necesi dad de estar fijadas a ningún soporte. • Se pueden dividir de forma indefinida, condición que adquieren porque pierden la senescencia (literalmente, han conseguido la inmortalidad), en tanto que expre san la enzima telomerasa, que evita el acortamiento de los telómeros. En trabajos de laboratorio, si estas células que se obtienen de cultivos se inyectan a un an imal de experimentación sometido a inmunodepresión, cuando se le introducen células normales no se produce ningún tumor, pero al inyectarle células tumorales sí se forma un tumor en el lugar en el que se han inoculado estas células. Los tumores in situ (benignos) pueden crecer y adquirir nuevas capacidades, como la producción de enzimas (proteasas), que comienzan a degradar el medio extracelular. Si bien inicialmente la primera masa tumoral no está vascularizada y presenta un aporte de nutrientes limitado, estas células pueden adquirir la capacidad de generar factores que atraen a las células de los endotelios vasculares y hacen que se emitan pro longaciones de esos capilares, que invaden el tumor; esta vascularización del tumor se desencadena en un proceso denominado angiogénesis tumoral. A partir de aquí, algunas células pueden atravesar esos vasos y pasar a la circulación sanguínea o linfática; si alguna de las mutaciones afecta a los genes que participan en los procesos de adhesión celular (genes de cadherinas e integrinas), se producen los cambios necesarios para que esas células entren en contacto con otras células del organismo mediante proteínas de adhesión y viajen a través de estos fluidos.

Protooncogén

Oncogén Mutación

~ Exp resión

~ del gen

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/ Función celular normal

.. Figura 34-4. Mecan ismos de actuación de los oncogenes.

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Actividad excesiva y no regulada Aparece cáncer

aAlgunas de estas células, mediante fenómenos de extravasación, pueden atravesar las paredes de los vasos e interactuar con la matriz extracelular del tejido al que han llegado, de manera que se insertan y empiezan a multiplicarse en ese nuevo tejido, formando una metástasis.

" AGENTES CARCINÓGENOS Su importancia radica en el hecho de que se calcula que el 900/0 de los cánceres humanos están relacionados con factores ambientales o nutricionales que inducen el proceso, entre los que se encuentran el tabaco, los hábitos dietéticos o la exposición a la luz solar, a productos químicos y a fármacos; el 10% restante de cánceres se asocia a factores genéticos hereditarios, a radiaciones ionizantes y a agentes víricos. Desde hace ya muchos años, los estudios de toxicidad de cualquier sustancia química incluyen la evaluación del riesgo de carcinogenicidad; la necesidad de este tipo de pruebas descansa en razones científicas, legales y reglamentarias. En la actualidad, la lista de sustancias que, por exposición accidental, médica, ocupacional o industrial suponen un riesgo de carcinogénesis, es muy numerosa. En relación a esta toxicidad, el Instituto de Seguridad e Higiene en el Trabajo dispone en su página web del listado de sustancias con acción carcinogénica. Es una clasificación de estos agentes agrupados según su origen en carcinógenos químicos, radiaciones carcinogénicas y organismos oncogénicos. Los carcinógenos químicos son sustancias químicas que pueden causar estas mutaciones en el ADN del organismo y lo pueden hacer de dos formas:

Los carcinógenos son agentes físicos, químicos o biológicos, capaces de causar mutaciones en el ADN del organismo y, por ello, son potencialmente capaces de inducir la aparición de cáncer.

• Con acción directa: son sustancias que, una vez dentro del organismo, son capaces de producir un cambio por sí solas. Un ejemplo de estas sustancias son los agentes alquilantes. • Con acción indirecta o iniciadores: son capaces de producir mutaciones mediante la asociación con promotores, pero por sí solos no producen cáncer: el iniciador debe continuar con el promotor para que se desarrolle el tumor. Un ejemplo de esta acción es la que provoca la aflatoxina B. Las sustancias químicas con acción carcinogénica, directa o indirecta, incluyen: • Agentes alquilantes, como ciclofosfamida o busulfán, que son antineoplásicos y que, a dosis muy elevadas, pueden causar cánceres secundarios. • Hidrocarburos aromáticos policíclicos, provenientes del tabaco. • Colorantes y aminas aromáticas, como las anilinas. • Carcinógenos naturales, como las aflatoxinas. • Nitrosaminas, que se utilizan como conservantes. • Amianto, un material de construcción que se utilizó durante décadas, que puede producir mesotelioma tras largas exposiciones.

¿Cómo se pueden clasificar los antígenos tumorales?

La carcinogénesis por radiaciones se presenta en exposiciones a radiaciones ultravioletas, que se asocian a cáncer de piel o radiaciones ionizantes provenientes de materiales radiactivos o de tratamientos con radioterapia, que se asocian a carcinomas tiroideos y linfomas. Los organismos oncogénicos agrupan una serie de microorganismos patógenos que se relacionan con determinados tipos de tumores. Entre estos agentes se encuentran:

• VPH. Actúa sobre genes supresores tumorales (P53 y RB 1), induciendo la proliferación tumoral. Se asocia a cáncer de cérvix uterino y a otros procesos tumorales de la zona anogenital, así como de las vías aéreas superiores. • Virus de Epstein-Barr (VEB). Pertenece al grupo herpes virus y causa la mononucleosis infecciosa. Induce la proliferación clonal de linfocitos B y puede dar lugar a 441

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Entre los agentes patóg enos que se relacionan con la aparición de determinados t ipos de tumores se encuentran el VPH, el VEB, el virus de la hepatitis B y e y la bacteria Helicobacter pyiori.

carcinomas hematológicos, como ellinfoma de Burkitt africano o la enfermedad de Hodgkin. • Virus de la hepatitis B y C. Producen una respuesta inflamatoria crónica en el hígado, que acaba por destruir los hepatocitos, que finalmente pueden evolucionar hasta un hepatocarcinoma. • Helicobacter pylori. Bacteria que se asocia con el carcinoma gástrico. Se encuentra en el estómago e induce la proliferación de células epiteliales; inicia el proceso con una gastritis crónica, que puede evolucionar a un carcinoma o un linfoma gástrico.

DEFENSA FRENTE A TUMORES La inm unidad tumoral constituye el conjunto de mecanismos de defensa inmunológica con los que cuenta un organismo, que se activan ante la intromisión de un agente agresor externo de carácter cancerígeno. El inicio de un cáncer tiene su origen en alteraciones genéticas, algunas de las cuales pueden producir, en estas células cancerígenas, la expresión de oncoproteínas, los antígenos de superficie que el sistema inm un itario no reconoce y considera extraños, los denominados antígenos tumorales. Estos antígenos suscitan y desencadenan la respuesta inmunitaria del organIsmo.

Antígenos tumorales Los antígenos tumorales pueden ser específicos del tumor, si sólo se encuentran en las células tumorales, o bien pueden estar asociados al tumor, pues aparecen en las células tumorales, pero también pueden aparecer, aunque en cantidad menor, en las células normales. Asimismo, provienen de distintos orígenes: • Productos de oncogenes mutados y genes supresores tumorales. Son específicos del tumor que los origina y proceden de oncoproteínas mutadas y de proteínas supresoras del tumor. • Productos de otros genes mutados. También son específicos del tumor y muy diversos. Son péptidos derivados de proteínas propias o mutadas, capaces de estimular las células natural killer. • Proteínas hiperexpresadas o aberrantes. Son proteínas celulares normales que se expresan de forma inadecuada en las células tumorales y generan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la tirosinasa se expresa solamente en los melanocitos normales y en una cantidad tan pequeña que no la reconoce el sistema inmunitario, por lo que no induce tolerancia; en los melanomas se expresa en cantidades mucho más elevadas, por lo que se puede asociar a la presencia de este tumor. • Producidos por virus oncogénicos. Son proteínas producidas por virus de ADN latentes, como el VPH y el VEB. • Antígenos oncofetales. Son proteínas que se expresan de forma habitual durante la embriogénesis, pero no en los tejidos adultos normales. La reactivación de los genes que codifican estas proteínas en un proceso tumoral provoca su reexpresión. Es el caso del antígeno carcinoembrionario (CEA) en el cáncer de colon o de la alfafetoproteína en el cáncer de hígado. • Glucoproteínas y glucolípidos de la superficie celular. Son gangliósidos y mucinas de la membrana celular que se alteran durante el proceso tumoral; los antígenos Ca-125 y Ca -19.9, que pueden aparecer en los carcinomas de ovario y de páncreas, son ejemplos de esta alteración.

Mecanismos de actuación El principal mecanismo de actuación de defensa está mediado por la inmunidad celular. Los linfocitos T citotóxicos suelen ser los primeros en activarse y los que más 442

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11frecuentemente impulsan la inmunidad celular frente a antígenos tumorales. Protegen al organismo principalmente ante las neoplasias asociadas a virus, como ellinfoma de Burkitt inducido por el VEB. También participan en la propagación de las células natural killer, que son capaces de destruir células tumorales sin sensibilización previa, ya que identifican a antígenos producidos por el estrés en estas células tumorales y también en otras que han sufrido daño en su ADN y que pueden desarrollar transformaciones neoplásicas. Los macrófagos destruyen tumores por mecanismos similares a los que se activan frente a otros agentes externos (bacterias) o por secreción de factores de necrosis tumoral. Además de estos mecanismos, también puede intervenir la inmunidad humoral mediante procesos de activación del complemento, que destruirán las células cancerígenas, o por inducción por las células natural killer de la cito toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Entre los mecanismos de actuación de defensa de los antígenos tumorales están la inmunidad celular, los macrófagos y las células natural killer.

Mecanismos de evasión tumoral En ocasiones, los mecanismos de inmunidad no funcionan adecuadamente porque las células que forman parte de un tumor son capaces de defenderse frente a la respuesta del organismo mediante diversos mecanismos de evasión: • Sobrecrecimiento selectivo de variantes antigénicas negativas, que seleccionan clones celulares capaces de crecer sin la expresión de los antígenos tumorales. • Expresión ausente o reducida de antígenos de histocompatibilidad. • Inmunodepresión. Hay neoplasias que secretan sustancias que inducen la inmunodepresión del individuo, provocando que los linfocitos T disminuyan o no sean capaces de actuar.

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MANIFESTACIONES LOCALES Y GENERALES DE LOS TUMORES

Una neoplasia que se desarrolla en un organismo, al final, actúa sobre él y desencadena una serie de disfunciones clínicas, que pueden manifestarse de forma local o generalizada. Las manifestaciones locales se producen en el lugar donde se desarrolla el tumor y pueden presentar diversos síntomas:

¿Cómo se pueden los tumores?

• Aumento de volumen e invasión y destrucción de tejidos normales. Este hecho condiciona que se produzca la insuficiencia funcional de los órganos afectados y que se genere dolor a causa de la irritación de las terminaciones nerviosas. • Estenosis y obstrucción de órganos huecos. Si la masa tumoral se asienta sobre las paredes de órganos huecos o las comprime desde fuera, se puede impedir el tránsito de aire (en los bronquios), heces (en el intestino) , bilis (en la vía biliar) u orina (en las vías urinarias). • Ulceración del tumor. En ocasiones se producen hemorragias en el propio tumor, provocadas por la necrosis de parte del tejido tumoral, por el aporte insuficiente de riego sanguíneo o por la obstrucción de un vaso sanguíneo próximo. Las manifestaciones generales son comunes a todos los procesos tumorales y bastante inespecíficas. Son el resultado del gasto qu e provoca el tumor, que crece a expensas del organismo huésped y de la liberación de sustancias que pasan a la sangre yoriginan reacciones semejantes a las que se producen en los focos de inflamación. Entre estas manifestaciones se encuentran algunos síntomas comunes a todos los pacientes con tumores, como astenia, anorexia, pérdida de peso (como consecuencia no sólo de la disminución de la ingesta, sino de las demandas energéticas del tumor en crecimiento y sus secreciones), náuseas y fiebre.

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Identificación del proceso de desarrollo tumoral

Capítulo 34

Los síndromes paraneoplásicos consisten en manifestaciones generales y a distancia del foco tumoral primario y de las posibles metástasis asociadas, que aparentemente no guardan ninguna relación con ellos. Se atribuyen a la secreción ectópica (es decir, fuera del órgano o el tejido habitual) de hormonas, factores de crecimiento y otros productos de actividad biológica. Algunos síndromes paraneoplásicos se clasifican como: • Endocrinos. Son los más frecuentes y se producen por la liberación por parte de algunos tumores de hormonas, que originan cuadros clínicos como el síndrome de Cushing (asociado a cáncer del tracto gastrointestinal), la secreción inadecuada de hormona antidiurética (con cáncer de pulmón) o la hipersecreción de hormonas sexuales. • Metabólicos. Están representados por la hipoglucemia (es raro), la hipecalcemia (en el cáncer de mama y el de pulmón de células pequeñas) o la hipocalcemia. • Hematológicos. Incluye anemia, policitemia, leucocitosis o coagulación intravascular diseminada. • Neuromusculares. Se manifiestan como miastenia (tumores del timo) o neuropatía periférica. • Cutáneos. Son característicos de la dermatomiositis (en tumores de mama, pul mó n u ovario) o la acantosis nigricans (se asocia al cáncer gástrico). El dolor es un síntoma frecuente en los pacientes con cáncer, y es común en neoplasias de origen óseo, gástrico, genitourinario y de cabeza y cuello. En estos pacientes la intensidad del dolor es, como poco, moderada y suelen experimentar más de un tipo de dolor, que puede ser somático, visceral o neuropático (por afectación del sistema nervioso). Entre las causas que pueden desencadenar dolor se incluyen: • Do lor por invasión directa del tumor. • Do lor relacionado con el tratamiento recibido: cirugía, radioterapia, quimioterapia, etcétera. • Do lor por otras causas, como, por ejemplo, espasmos musculares o debilidad.

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GRADACiÓN Y ESTADIFICACIÓN DEL TUMOR

La gradación yestadificación (o estadiaje) de los tumores se utiliza para conocer el pronóstico y supervivencia, así como el grado de agresividad de un tumor. La gradación se basa en la intensidad de diferenciación de las células tumorales respecto a las células normales y en el número de mitosis de dichas células, que se observan al microscopio. El grado histológico o diferenciación se refiere a la semejanza que muestran las células tumorales en relación con las células normales del mismo tejido. Según este criterio, la gradación recibe el nombre según la escala siguiente: • • • • •

Grado Grado Grado Grado Grado

GX: no es posible asignar un grado (indeterminado). G 1: células bien diferenciadas (grado bajo). G2: moderadamente diferenciado (grado intermedio). G 3: mal diferenciado (grado alto). G4: indiferenciado (grado alto).

Las células de grado G 1 se parecen a las células normales, se multiplican lentamente y el cáncer es menos agresivo. Por el contrario, las células de un tumor de grado G4 no están diferenciadas, tienden a multiplicarse y extenderse con más rapidez y el cáncer es más agresivo. La estadificación se emplea para conocer el pronóstico y la supervivencia del tumor. Se basa en tres criterios: 444

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Fisiopatología general

MóduLo IV

• El tamaño de la lesión (T): desde TX (no puede ser evaluado); TO (no hay evidencia de tumor primario; Tis (carcinoma in situ); TI, T2, T3 yT4, según el tamaño y la extensión del tumor primario. • La diseminación a los ganglios linfáticos regionales (N): se mide con los valores NX (no se puede evaluar); NO (no existe complicación de ganglios linfáticos regionales); NI, N2 y N3, según la complicación de los ganglios regionales en número y extensión. • La diseminación a distancia (M): evalúa la presencia de metástasis, según los valores MX (no es posible evaluar); MO (no existe metástasis distante) y MI (existe metástasis distante).

La gradación se basa en la intensidad de diferenciación de las células tumorales respecto a las células normales y en el número de mitosis de dichas células. La estadificación se emplea para conocer el pronóstico y la supervivencia del tumor.

La estadificación es muy importante para decidir el tratamiento, dictaminar un pronóstico y predecir la supervivencia media. Tiene un mayor valor clínico que la gradación. Se puede utilizar la valoración del sistema de la American Joint Committee on Cancer (AJce) , que cataloga a todos los cánceres en distintos estadios, de Oa IV, y los clasifica según el tamaño de la lesión primaria, la presencia de extensión ganglionar y de metástasis a distancia.

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PREVENCiÓN, DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO

Según la Organización Mundial de la Salud, al menos una tercera parte de todos los casos de cáncer se podrían prevenir, lo que certifica que esta prevención constituye la estrategia a largo plazo más eficaz y de menor coste para el control del cáncer. Entre las estrategias para prevenir el cáncer, las más eficaces se relacionan con los hábitos de vida, la alimentación y otros factores, que permitirían disminuir la probabilidad de aparición de estos procesos malignos. Estas estrategias tienen como objetivo el control y la disminución de la exposición a factores de riesgo conocidos, por lo que se orientan hacia los que pueden evitarse, con medidas de protección y promoción de la salud y la difusión de programas de educación sanitaria. Parece demostrado que el origen de muchos tumores malignos se relaciona con ciertos factores de riesgo ligados a los hábitos de vida, por lo que la adopción de un estilo de vida saludable es un punto clave en la prevención. Para ello, se recomienda: • No fumar o dejar de fumar. • Evitar el sobrepeso y la obesidad, adoptar una dieta saludable, variada, con suficientes nutrientes y rica en fibra, fruta fresca, verduras y productos elaborados con harina integral. . • Moderar el consumo de alcohol. • Realizar alguna actividad física enérgica cada día. • Cuidar la exposición al solo a otras fuentes de radiación ultravioleta. • Cumplir estrictamente las regulaciones encaminadas a prevenir exposiciones ocupacionales y ambientales a sustancias cancerígenas, incluidas las radiaciones ionizantes. La detección precoz del cáncer aumenta enormemente las posibilidades de aplicar un tratamiento que resulte eficaz. Si se reconocen las señales de alerta del cáncer y se toman medidas con rapidez, se puede conseguir un diagnóstico precoz, que es especialmente valioso en el cáncer de mama, de cuello uterino, de boca, de laringe, de colon y recto y de piel. También se ha demostrado beneficiosa la práctica de actividades de prevención con programas de salud que pueden evitar el desarrollo de muchos cánceres o que aumentan la probabilidad de curación. Son programas de screening o cribado de la población, cuya finalidad es detectar los posibles tumores en una fase temprana de invasividad o incluso antes de hacerse invasivos. Así, algunos cánceres pueden tratarse de manera más eficaz y se puede conseguir aumentar la esperanza de vida de los pacientes afectados.

Entre las estrategias para prevenir el cáncer, una de las más importantes se relaciona con los hábitos de vida, la alimentación y otros factores, que permitirían disminuir la probabilidad de aparición de estos procesos malignos.

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El cribado supone realizar pruebas a personas sanas para detectar la presencia de enfermedades que aún no provocan síntomas; un indicador clave de la eficacia de estos programas es el descenso de la mortalidad específica de la enfermedad o la disminución de su incidencia en estados avanzados. En la actualidad se utilizan de forma sistemática programas de cribado de citología cervicovaginal para las anomalías del cuello del útero, de mamografías para el cáncer de mama y de sangre oculta en heces para el cáncer colorrectal.

Diagnóstico del cáncer Para llegar al diagnóstico de certeza de cáncer suele ser necesario tomar una biopsia del tumor y realizar un estudio histológico del tejido extraído.

Para el diagnóstico del cáncer se utilizan diversos métodos, aunque para obtener un diagnóstico de certeza suele ser necesario tomar una muestra del tumor (biopsia) y realizar un estudio histológico del tejido extraído. Posteriormente, para determinar la extensión del tumor es necesario realizar una serie de pruebas, pero la estadificación acostumbra a ser difícil y costosa. El primer paso es realizar una historia clínica lo más completa posible, para detectar indicios o síntomas que sugieren la presencia de estos procesos. A continuación se efectúan exploraciones complementarias, que confirmen o desmientan las sospechas, como exploraciones complementarias radiológicas, de laboratorio o histológicas. Entre los métodos histológicos están las biopsias, los extendidos citológicos, las técnicas de punción-aspiración con aguja fina (PAAF) Y las técnicas inmunohistoquímicas, que permiten teñir los distintos antígenos expresados por los tumores e identificar proteínas específicas de estos tejidos. Las técnicas de diagnóstico molecular permiten descubrir enfermedades a escala molecular, mediante la determinación de monoclonalidad en proteínas, en estudios de translocaciones y amplificaciones de genes, así como identificar predisposiciones hereditarias por la presencia de algunos oncogenes concretos, como BRCA] y BRCA2 en el cáncer de mama. No obstante, en el laboratorio clínico los elementos que más se utilizan son los marcadores tumorales, sustancias producidas por células neoplásicas o inducidas por el organismo del huésped ante la presencia de un tumor maligno. La medida de su concentración en muestras biológicas o su detección en tejidos reflejan el crecimiento o la actividad del tumor y resultan de utilidad para establecer el pronóstico, realizar el seguimiento o comprobar la eficacia de la terapia que se aplica. En la tabla 34-5 se recogen algunos de los marcadores tumorales más habituales.

Marcadores tumorales producidos por la célula tumoral

Marcadores tumoraLes inducidos por el huésped

Antígenos oncofetaLes: antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP)

Citocinas

Antígenos oncopLacentarios: SP-1, subunidad ~ de la hormona gonadotropina

~-2-microglobulina

coriánica (~-HCG), SP-3

Antígenos tisuLares: antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC),

Ferritina

antígeno prostático específico (PSA), fosfatasa ácida prostática (PAP), calcitonina, tiroglobulina, enolasa neuronal específica (NSE)

Antígenos mucínicos: Ca-125, Ca-19.9, Ca-549, antígeno mucínico asociado a cáncer de mama (MCA)

Citoqueratinas: polipéptido tisular específico (TPS), Cyfra 21.1 Hormonasectópicas: hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona paratiroidea (PTH), hormona antidiurética (ADH)

Oncoproteínas: P53, c-erbB-2, bcl2 Enzimas: lactato-deshidrogenasa (LDH), sialiltransferasas

446

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Proteínas reactantes de fase aguda

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Fisiopatología general

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Mód~lo ív

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La mayoría de estas sustancias tiene una sensibilidad y especificidad insuficiente para la detección precoz de un tumor maligno, si bien algunas de ellas pueden usarse de forma eficaz en el diagnóstico precoz en grupos de alto riesgo (subunidad ~ de la hormona gonadotropina coriónica [~-HCG], calcitonina, alfa-fetoproteína) o como método de confirmación de la sospecha diagnóstica obtenida por otros procedimientos (antígeno prostático específico). En la tabla 34 -6 se detalla la utilidad clínica de algunos de los marcadores tumorales que se emplean con más frecuencia. En general, se puede afirmar que la aplicación de marcadores tumorales facilita el establecimiento del pronóstico, contribuye a un correcto seguimiento clínico de la enfermedad, sirve para comprobar la eficacia del tratamiento aplicado y aumenta la probabilidad de detectar precozmente la presencia de recidivas de la enfermedad.

Tratamiento deL cáncer Los principales objetivos de un programa de diagnóstico y tratamiento del cáncer son curar o prolongar considerablemente la vida de los pacientes y garantizar la mejor calidad de vida posible a quienes sobreviven a la enfermedad. Los programas de tratamiento más eficaces son los que funcionan de forma continua y equitativa, están vinculados a sistemas de detección precoz, respetan las normas de atención basadas en datos probatorios y aplican un enfoque multidisciplinario. El tratamiento del cáncer se fundamenta en tres pilares: cirugía, quimioterapia y radioterapia; otras posibilidades de tratamiento incluyen la terapia hormonal, la inmunoterapia, nuevas dianas terapéuticas no cito tóxicas y el trasplante de médula ósea. Por ello, hay que seleccionar cuidadosamente una o varias modalidades de tratamiento, elección que debe basarse en pruebas científicas sobre el mejor tratamiento existente, teniendo en cuenta todos los recursos disponibles. Normalmente, se requiere la estrecha colaboración de todo el equipo de atención oncológica para el establecimiento del mejor y más adecuado tratamiento. La respuesta al tratamiento puede ser completa, si se ha logrado la desaparición de todos los signos y síntomas de la enfermedad, o parcial, si existe una disminución significativa de las lesiones detectadas. La cirugía consiste en la extirpación del tumor en el quirófano y continúa siendo la base fundamental del tratamiento contra el cáncer. Puede ser curativa (si la extirpación es completa) O' paliativa.

Tabla 34-6. Utilidad de aLgunos de los marcadores tumorales más utilizados

Alfafetoprote ína

Hepatocarcinoma, tumores testiculares y del seno endodérmico

p-HCG

Tumores trofoblásticos y testiculares

Ca-19.9

Neoplasias digestivas, cáncer de páncreas, carcinomas mucinosos e indiferenciados de ovario

Ca-125

Tumores ováricos, pulmonares y de endometrio

Antígeno carcinoembrionario (CEA)

Neoplasias epiteliales, cáncer de colon

Enolasa neuronal específica (NSE)

Carcinoma microcítico de pulmón, neuroblastomas, tumor de Wilms

Antígeno prostático específico (PSA)

Cáncer de próstata

Tiroglobulina

Neoplasias foliculares y papilares de tiroides

Carcinoma de células escamosas (SCC)

Carcinomas epidermoides

CYFRA 21-1

Neoplasias epiteliales

Ca-15.3

Tumores de mama y ovario

Calcitonina

Cáncer medular de tiroides, cáncer de pulmón

c-erb 8-2

Tumores de mama, ovario y adenocarcinomas de pulmón y próstata

447

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.. 140 mg /dL tras 1 hora desde el momento de la administración, se considera el test positivo y será necesario realizar la prueba completa con la administración, en esta ocasión, de 100 g de glucosa bebible. A continuación se realizan las determinaciones de glucosa durante las 3 horas siguientes para llegar al diagnóstico definitivo. Otros aspectos que se deben tener en cuenta en el paciente diabético son los siguientes: • Monitorización de la glucosa. Las personas con diabetes deben determinarse ellas mismas los niveles de glucosa en sangre, a veces varias veces al día, para conocer la medida en que éstos se encuentran dentro de la normalidad. En función de los resultados que obtienen y cumpliendo las instrucciones de su médico, adecuar las modificaciones necesarias en su medicación. Actualmente, se coloca una gota de sangre (obtenida por punción de la piel con una lanceta) sobre un soporte o una tira para glucosa y se introduce en un glucómetro portátil (dispositivo que permite medir los niveles de glucosa en sangre). • Otros estudios de interés en el manejo del paciente diabético. El paciente diabético suele asociar otras alteraciones metabólicas y está expuesto a sufrir una serie de complicaciones a lo largo de su enfermedad; por ello es importante realizar otros estudios en el laboratorio para controlarlas:

Monitorización de la función renal: microalbúmina (albúmina en orina), aclaramiento de creatinina, creatinina y urea. Monitorización del metabolismo lipídico: colesterol, colesterol HDL (high densitylipoprotein), colesterol LDL (low density lipoprotein) y triglicéridos. En el lado opuesto de las alteraciones del metabolismo hidrocarbonato se encuentra la hipoglucemia. El síndrome de hipoglucemia se produce cuando los niveles plasmáticos de glucosa en ayunas son < 45 mg/dL (2,5 mmol/L). La hipoglucemia se manifiesta con letargia, confusión y pérdida del conocimiento. Si el descenso de glucosa se produce bruscamente, provoca la estimulación de la secreción de adrenalina, lo que origina otros síntomas, como sudoración y taquicardia. El origen de una concentración de glucosa baja puede ser debido a diferentes motivos:

Los sí ntomas de la hipoglucemia son s ecundario s a la disminución o la fa lta de a porte de glucos a al cerebr o.

• • • •

Ayuno prolongado. Hiperproducción de insulina (p. ej., neoplasia: insulinoma). Déficit en el mecanismo de producción: déficit de glucocorticoides. También son causa frecuente la ingesta de algunos fármacos, alcohol, la administración de insulina o de otros compuestos que estimulan su producción.

Es importante hacer referencia a otros errores innatos del metabolismo de los hidratos de carbono. Existen errores en el metabolismo de los hidratos de carbono que, aunque menos frecuentes, en algunos casos pueden conducir a enfermedades y situa ciones clínicas graves. Son los errores en el metabolismo de la fructosa y la galactosa. 554

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Análisis bioquímico

MóduloV

Habitualmente, son alteraciones de difícil diagnóstico, que afectan a las enzimas que intervienen o bien al proceso de degradación oxidativa o almacenamiento. Estos déficits pueden originar cuadros asintomáticos o bien cuadros más graves que comprenden el retraso en el crecimiento o retraso mental. En algunas situaciones, principalmente en las etapas iniciales de la vida, pueden poner en peligro la salud y la vida del enfermo.

Metodología para la determinación de la glucosa Ciertas consideraciones son importantes par a realizar una correcta determinación de la glucosa: • La sangre venosa, una vez centrifugada y separado el suero o plasma, es la muestra de elección para su cuantificación. • A temperatura ambiente, la velocidad de metabolización in vitro es de 7 mg/dL/h y refrigerada a 4 oC es de 2 mg/dL/h. Por lo tanto, en una muestra en la que se desea determinar la glucosa se debe proceder a la separación del componente celular en un plazo no superior a 30 minutos, ya que, de no ser así, se consumirá y se estará infravalorando la concentración real de gluco sa. Existen aditivos, como el fluoruro sódico, que evitan la glucólisis y la infravaloración de la glucosa. • En suero o plasma refrigerado, la glucosa permanece estable durante 48 horas. • A partir de las 48 horas, aunque las muestras se congelen a -20 oC, los valores de glucosa decrecen progresivamente.

¿Cómo influyela temperatura en el metabolismo de la glucosa?

La determinación de glucosa se realiza por métodos enzimáticos totalmente automatizados. Se dispone esencialmente de tres métodos distintos: glucosa deshidrogenada, glucosa-oxidasa y hexocinasa. El método de la hexocinasa es el aceptado como el de referencia. La concentración final de glucosa es proporcional al índice de producción de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en su forma oxidada NAD(P)H. Para su cuantificación se emplea tecnología espectrofotométrica.

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ALTERACIONES DEL METABOLISMO DE LíPIDOS y LIPOPROTEíNAS

Los lípidos constituyen un grupo heterogéneo de moléculas, con diferentes funciones biológicas y con la característica común de ser insolubles en soluciones acuosas; por lo tanto, su circulación en plasma, influida por su baja solubilidad, implica, con alguna excepción, que circulen asociados a proteínas formando lipoproteínas. De esta manera se genera una estructura micelar con un interior hidrófobo y una cubierta exterior más hidrófila. Las proteínas que forman parte de estas lipoproteínas son las apolipoproteínas. Las características fisicoquímicas de las lipoproteínas están determinadas por su composición y la proporción de lípidos y proteínas. Cuanto mayor es su proporción de lípidos, mayor es el tamaño y menor su densidad. Debido a esta composición, se clasifican en:

La función principal de las Lipoproteínas es el transporte del colesterol y de los triglicéridos, desde el lugar de origen en el intestino y el hígado hasta los lugares de almacenamiento y utilización de energía.

• Quilomicrones, partículas muy grandes, producidas por el intestino con un componente en triglicéridos muy alto de origen exógeno y con un componente proteínico muy bajo, por lo que tienen muy baja densidad. • VLDL (very low·density lipoprotein), lipoproteínas de muy baja densidad, menores que los quilomicrones y algo mayor de densi dad. También son ricas en triglicéridos de origen endógeno, aunque en menor grad o. • LDL, lipoproteínas de baja densidad, representan el 50% de la masa total de lipoproteínas y son mucho más pequeñas. El colesterol representa el 50% de la masa de las LDL y aproximadamente el 250/0 son proteínas. • HDL, lipoproteínas de alta densidad, las más pequeñas de todas ellas, están constituidas al 50 % por proteínas.

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~apítulo 41

Análisis demagnitudes bioquímicas relacionadas con el metabolismo deprincipios inmediatos: hidratos decarbono y lípidos

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Los componentes lipídicos de las lipoproteínas se pueden desagregar en: • Ácidos grasos: compuestos orgánicos saturados o insaturados. Se presentan esterificados. • Glicéridos: lípidos apolares, los más frecuentes son los triglicéridos y su finalidad es el transporte de ácidos grasos con fines energéticos y catabólicos. • Fosfolípidos: lípidos polares, con funciones estructurales. • Colesterol: tiene función estructural en las membranas celulares y es precursor de otras moléculas, como algunas hormonas. Es ellípido con mayor capacidad de formación de placas aterogénicas. Los componentes proteicos de las lipoproteínas, también llamadas apolipoproteínas, como se ha mencionado, son las proteínas que participan en la estructura de las lipoproteínas. Además de facilitar su solubilidad, son indispensables en su metabolismo, puesto que proporcionan selectividad en el reconocimiento por los receptores celulares y en su actuación como cofactores de enzimas que intervienen en las lipoproteínas. Existen varios subtipos: • • • •

ApoA, principal componente de la HDL. ApoB, principal componente de la LDL yen un 400/0 de la VLDL. Apof,', principal componente de la VLDL. Otras apolipoproteínas son ApoD y ApoE.

Patrones de alteraciones en lípidos y lipoproteínas de interés clínico. Consecuencias

La expresión clínica de la ateroesclerosis es un conjunto de enfermedades diferentes entre las que destacan la cardiopatía isquémica y el accidente cerebrovascular.

El interés por el estudio de las lipoproteínas plasmáticas se centra, fundamentalmente, en su relación con la ateroesclerosis. La placa de ateroma en la íntima vascular consiste en un acúmulo de lípidos rodeados de tejido fibroso. Esta placa, en su progresión, engrosa la íntima vascular y determina unas condiciones hemodinámicas que favorecen las complicaciones, como la rotura de la envoltura fibrosa, lo que facilita la formación de un trombo que puede ocluir el vaso. La participación de las lipoproteínas en la aterogénesis es evidente, pero se debe insistir en que es el resultado de un proceso multifactorial, en el que intervienen otros factores de riesgo: hipertensión, antecedentes familiares, tabaquismo, sexo masculino, edad avanzada, trastornos en el metabolismo de los glúcidos, obesidad, sedentarismo y estrés. Entre todos estos factores, los trastornos en el metabolismo de los lípidos y la hipertensión son los de mayor peso clínico. Existe una relación directa entre colesterol y ateroesclerosis, que propicia una mayor incidencia y mortalidad por enfermedades derivadas de la ateroesclerosis. Esta relación es creciente, de forma que, cuanto mayor es la concentración de colesterol, mayor es el riesgo de padecer ateroesclerosis. El estudio de la concentración de LDL es también importante, ya que son las lipoproteínas con mayor proporción de colesterol, que se consideran igualmente un facto r de riesgo en la cardiopatía isquémica. Existe una relación directa entre la concentración de colesterol transportado en LDL con la ApoB y la incidencia de estas enfermedades. Por el contrario, la función de las HDL es la eliminación y el transporte de colesterol al hígado para su posterior eliminación, fundamentalmente por vía biliar. Se ha establecido una relación inversa entre la incidencia y la mortalidad de la cardiopatía isquémica y esta lipoproteína, así como con la ApoA. La determinación de triglicéridos forma parte del perfillipídico que se utiliza para identificar el riesgo de desarrollar una enfermedad cardíaca. En los pacientes diabéticos es especialmente importante realizar la determinación de triglicéridos como parte de cualquier perfillipídico, ya que la concentración de triglicéridos aumenta significativamente cuando el azúcar en sangre no está bien controlado.

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Módulo V

Análisis bioquímico

Patrón

Tipo

Triglicéridos extremadamente elevados secundarios a la presencia de quilomicrones lIa

LD L elevadas

IIb

LDL YVLDL elevadas

111

Colesterol, triglicéridos elevados, proporción VLDL/triglicéridos > 0,3

-IV

V

VLDL elevadas VLDL elevadas y presencia de quilomicrones

LDL: low density lipoproteins; VLDL: very low density lipoproteins.

La clasificación de las alteraciones en la distribución de las lipoproteínas se refleja en los patrones de hiperlipoproteinemia (Tabla 41-3 ). Para establecer la necesidad o no de tratamiento y el más indicado en cada situación, el médico considera cada uno de los resultados del perfil lipídico, así como posibles factores de riesgo asociados. El National Cholesterol Education Program proporciona una serie de pautas que se detallan en la tabla 41-4 .

Metodología para la determinación del perfillipídico habitual La concentración de lipoproteínas se puede expresar de varias maneras. Si se realiza en términos de masa de partícula, se indica la proporción de cada uno de los componentes de la partícula. Las concentraciones de masa son generalmente determinadas por ultracentrífuga analítica o por mediciones químicas del componente proteínico y de cada una de las clases de lípidos. En la práctica habitual ninguno de estos métodos, técnicamente complicados, se aplican para exploraciones masivas o de cribado con la finalidad clínica habitual. Se debe tener en consideración para la determinación de las lipoproteínas que es importante que el paciente permanezca en ayunas 12 horas antes de realizar la extracción. Se puede realizar la determinación en suero o plasma (preferentemente plasma, con ácido etilendiaminotetraacético [EDTAJ) para la determinación de triglicéridos, colesterol y HDL colesterol. El LDL colesterol se calcula a partir de los anteriores: • Colesterol: los métodos de elección son enzimáticos, a través de los cuales y a partir de unas series de reacciones se hidrolizan los ésteres de colesterol hasta la obtención de agua oxigenada. • Triglicéridos: existen diferentes métodos, los más habituales se basan en la determinación del glicerol liberado tras la hidrólisis de los triglicéridos de forma también enzimática. • Colesterol HDL: también se emplean métodos enzimáticos, previa separación de -las fracciones de otras lipoproteínas.

¿Qué precaución debemos adoptar en un paciente al que queramos determinar los niveles de lípidos?

Colesterol total

Colesterol LDL

ColesterolHDL

Óptimo

Inferior a 200 mg/dL

Inferior a 100 mg/dL

Superior a 60 mg/dL

Límite alto

200-239 mg/dL

130-159 mg/dL

200-249 mg/dL

Límite muyalto

Superior a 240 mg/dL

Superior 190 mg/dL

Superior a 500 mg/dL

Triglicéridos

Inferior a 150 mg/dL

* En el caso del colesterol HDL, hay que recordar que tiene una función protectora, por lo que son los límites bajos los que perjudican la salud, de manera que con cifras inferiores a 40 mg/dL se pierde esa capacidad pr otectora, HDL: high density lipoprotein; LDL: low density lipoprotein.

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• Co lesterol LDL: cálculo de forma indirecta mediante la fórmula de Friedewald: LDL-colesterol = colesterol total- HDL colesterol- (triglicéridos/S) (para concentraciones expresadas en mg/dL). Esta ecuación no es apropiada para muestras que excedan los 400 mg/dL de triglicéridos, en cuyo caso se debe recurrir a la cuantificación directa.

No debo olvidar que... mellitus es el tipo 11.

•

El tipo más frecuente de diabetes

•

Esta enfermedad está asociada a otros factores de riesgo, como obesidad, sedentarismo, historia familiar de diabetes, edad avanzada, hipertensión y alteraciones en el metabolismo de los lípidos.

•

No siempre es necesaria la administración exógena de insulina.

•

El interés por el estudio de las lipoproteínas plasmáticas deriva de su relación con la ateroesclerosis.

•

La expresión clínica de la ateroesclerosis es un conjunto de enfermedades entre las que destacan la cardiopatía isquémica y el accidente cerebrovascular.

•

Existe una relación directa entre colesterol y ateroesclerosis, que propicia una mayor incidencia y mortalidad por enfermedades derivadas de la ateroesclerosis.

•

El estudio de la concentración de low density lipoprotein es importante. Son las lipoproteínas con mayor proporción de colesterol y se considera un factor de riesgo en la cardiopatía isquémica.

•

La función de las high density lipoprotein es la eliminación y el transporte de colesterol al hígado para su posterior eliminación, fundamentalmente por vía biliar. Se ha establecido una relación inversa entre la incidencia y la mortalidad por cardiopatía isquémica.

Caso práctico

Preguntas de repaso 1. Si en un paciente, tras el estudio de la concentración de gLucosa se obtiene una cifra de 140 mg/dL:

El señor Dulce acude a su centro de salud para hacerse la analítica que se realiza anualmente.

a. No hay que preocuparse, no padece diabetes. b. Conviene repetirlo inmediatamente sin esperar las horas de ayuno. c. Sería conveniente esperar unos meses y repetirla. d. Habría que averiguar si estaba en ayunas.

Pasados 10 días, acude a la consulta de su médico y éste le informa de que ya tiene muy bien controlada su diabetes mellitus, ya que su concentración de glucosa en sangre es de 95 mg/dL, aunque la hemoglobina glucosilada es del 11 %. Realmente, ¿cuadran estos resultados?

2. En un hombre, que tras guardar 8 horas de ayuno, de La concentración de gLucosa en sangre se obtiene una cifra de 120 mg/dL: a. No hay que preocuparse, no padece diabetes. b. Habría que realizarle una prueba de sobrecarga oral de glucosa. c. Sería conveniente esperar unos meses y repetirla. d. Es diabético con toda seguridad.

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Módulo V

Análisis bioquímico

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BIBLIOGRAFíA

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Material complementario

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Indice de contenidos • Introducción • Proteínas plasm át icas esp ecíficas • Patrones de altera ción proteica • Métodos generales de dete rminación de proteínas plasmáticas

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INTRODUCCiÓN Las proteínas son macromoléculas compuestas por carbono, nitrógeno, oxígeno y, en ocasiones, azufre, fósforo y yodo. Están constituidas por aminoácidos, unidad básica estructural, unidos entre sí mediante enlaces peptídicos que forman secuencias lineales que, a su vez, se pliegan entre sí hasta estabilizarse formando las proteínas finales. La síntesis de proteínas se produce principalmente en el hígado. Los linfocitos B son responsables de la síntesis de inmunoglobulinas (Ig). Su catabolismo se produce en el hígado o en el tejido muscular, aunque también existen pérdidas renales o a través de la pared intestinal. Existen errores metabólicos congénitos que reciben el nombre de aminoacidopatías, cuya causa principal son los déficits enzimáticos como, por ejemplo, la fenilcetonuria, un déficit de fenilalanina hidroxilasa que causa la acumulación de fenilalanina y de sus derivados (que son tóxicos para el cerebro) en sangre y orina, trastornos en el ciclo de la urea que ocasionan hiperamoniemia o albinismo, que se manifiesta por falta de pigmentación de la piel. También existen fallos en el transporte de aminoácidos, en el riñón (falla la reabsorción tubular) o en el intestino (falla la absorción) como, por ejemplo, en la cisteinuria, donde pasan a la orina algunos aminoácidos que precipitan formando cálculos renales. Según su función biológica, las proteínas plasm áticas pueden ser estructurales (p. ej., colágeno), transportadoras de moléculas o de iones en el organismo (albúmina y hemoglobina), catalizadores biológicos (enzimas), mensajeros químicos (hormonas) o de defensa (anticuerpos).

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• Errores congénitos del metabolismo • Proteínas • Reactantes de fase aguda • Proteinograma • Patrones electroforéticos

La síntesis de proteínas se produce principalmente en el hígado. Existen errores metabó licos congénitos que reciben el nombre de aminoacidopatías.

PROTEíNAS PLASMÁTICAS ESPECíFICAS

Se pueden diferenciar dos tipos, esto es, si su detección se realiza por medios electroforéticos o inmunoquímicos.

Proteínas plasmáticas de detección electroforética Las principales proteínas séricas que se separan rápidamente se detectan en geles de electroforesis teñidos por técnicas convencionales de laboratorio gracias a su abundancia en la sangre. Las principales se describen a continuación:

• Prealbúmina. Excelente marcador del estado nutricional. Su concentración desciende en casos de desnutrición proteica y en hepatopatías. • Albúmina. Proteína plasmática más abundante (2/3), transportadora de múltiples sustancias, es la principal responsable de la presión osmótica (retiene agua), se une a lípidos y forma lipoproteínas. Aumenta en casos de deshidratación o aplicación prolongada de un torniquete y desciende por dilución en la administración de fluidos, enteropatías, hepatopatías, enfermedades renales,desnutrición proteica o infecciones.

La albúmina es la proteína plasmática más abundante, es transportadora de múltiples sustancias y la principal responsable de la presión osmótica; se une a lípidos y forma lipoproteínas. La ferritina es la principal proteína de almacenamiento de hierro en los tejidos. Es muy importante en el diagnóstico de anemias ferropénicas.

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Capítulo 42

Análisis de magnitudes bioquímicas relacionadas con el metabolismo de principios inmediatos: proteínas

¿ Oe qu é pr ot eína dep end e prin cipalm ent e la pr esión osmótica?

• Alfa-I-antripsina. Fracción mayoritaria de u -1-g10bulinas, que desarrolla su fun ción como inhibidora de la proteasa tripsina. Desciende en casos de enfisema pul monar y cirrosis hepática infantil.* • Alfa-2-macroglobulina. Proteína de gr"an tamaño que actúa como inhibidora de proteasas. Se detectan aumentos de esta proteína en el síndrome nefrótico. • Haptoglobina. Transportadora de hemoglobina para mantener los depó sitos de hierro y de proteínas. Existen casos con un déficit congénito. Di sminuye en hepatopadas y hemólisis.* • Ferritina. Principal proteína de almacenamiento de hierro en los tejidos. Es útil en el diagnóstico de las anemias ferropénicas, aunque también disminuye en el embarazo. Se incrementa en hemocromatosis, anemia megaloblástica y anemia hemolítica, hemosiderosis e intoxicación por hierro. * • Transferrina. Principal ~ -globulina con función transportadora de hierro. Sus niveles están regulados por la concentración de hierro en el organismo. Se incre menta en anemias deficitarias en hierro y existe una ligera elevación en mujeres gestan tes. Existen casos de déficit congénito de transferrina y también desciende en hepatopadas y neoplasias. • Complemento. Son ~-globulinas. Los principales factores de complemento son C3 y C4, que son útiles en la monitorización de la actividad en enfermedad reumática.* • Fibrinógeno. Factor de coagulación más abundante en el organismo. Está ausente en el suero y existen variantes genéticas con función anormal. Aumenta en el embarazo y con la toma de anticonceptivos. Disminuye en coagulopadas por consumo, hepatopadas y afibrinogenemia congénita.* • Inmunoglobulinas (Ig). Anticuerpos: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que aumentan en ciertos procesos inflamatorios crónicos y en enfermedades autoinmunes. Descensos en hipogammaglobulinemia, edad avanzada, leucemia linfática crónica e inmunosupresión.*

Proteínas plasmáticas de detección inmunoquímica

La ceruloplasmina di sminuye en la enf erm edad de Wil son y la PCR es important e porqu e resulta muy sen sible a las infecciones, las inflamacion es y la necrosis.

Las proteínas plasmáticas no se suelen detectar mediante electroforesis, sino por métodos inmunológicos, debido a que se encuentran en bajas concentraciones en suero . Existen varios tipos:

• Ceruloplasmina. Proteína fijadora de cobre, se incrementa en la gestación y con la toma de anticonceptivos. Disminuye en la enfermedad de Wilson. * • Alfa-l-glucoproteína ácida (orosomucoide) . Es sintetizada por hígado en respuesta a inflamación y el daño de tejidos. Aumenta en las enfermedades inflamatorias, reumáticas y en las neoplasias, y disminuye en las enfermedades hepáticas.* • Proteína C reactiva (PCR). Proteína muy sensible en infecciones, inflamaciones y necrosis.* • Inhibidores de proteasas. u -1-antiquimiotripsina, inhibidor rx-tripsina, antitrombina 111, antiplasmina, inhibidor tipo 1 del activador del plasminógeno, inhibidor de C 1-esterasa.

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PATRONES DE ALTERACiÓN PROTEICA

Existen más de 125 proteínas presentes en el plasma sanguíneo, conocidas como proteínas plasmáticas, cuya concentración en condiciones normales oscila entre 75-80giL en adultos y es menor en los recién nacidos, aunque la proporción entre albúmina y globulinas es la misma. Las fluctuaciones en la concentración de proteínas

* Reactantes de fase aguda. Son las proteínas cuya concentración se altera tras un traumatismo (p. ej., cirugía, síndrome coronario agudo ), inflamación tisular (p. ej., lupus, artritis reumatoide): fibrinógeno, proteínas de comp lemento, PCR, a-l -glucoproteína ácida, haptoglobina, ceruloplasmina, a -l -antitripsina, ferrititina, Ig, etcétera. 562

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Análisis bioquímico

MóduLo V

.

se deben a variaciones en el volumen de sangre o a la síntesis anormal de proteínas. En general, concentraciones de proteínas < 60 gIL (hipoproteinem ia) o > 85 gIL (hiperproteinemia) deben complementarse con una electroforesis sérica:

Las fluctuaciones en la concentración de proteínas se deben a variaciones en el volumen de

• Hiperproteinemia. Suele deberse a una dism inución del agua vascular (hemoconcentración) por pérdidas de líquidos (diarrea , vómitos, golpe de calor, erc.). También puede producirse por un incremento de la cantidad total de proteínas (hipergammaglobulinemia monoclonal o policlonal). • Hipoproteinemia. Se caracteriza por un aumento del volumen plasmático (hemodilución) o por un descenso en la cantidad total circulante de proteínas por diversas causas: malnutrición, defectos de absorción, pérdidas de proteínas (por quemaduras intensas, en el riñón o el intestino), disminución de la síntesis por enfermedad hepática o un descenso en la producción (hipogammaglobulinemia).

sangre o a la síntesis anormal de proteínas.

Además , es importante la determinación cualitativa y cuantitativa de todos los tipos de proteínas diferentes circulantes. Las alteraciones más frecuentes son: • Disproteinemias. Se producen por alteraciones en la distribución de las fracciones que se obtienen mediante electroforesis. • Hipoalbuminemia. La causa es una síntesis insuficiente, especialmente en casos de malnutrición o insuficiencia hepática. También puede producirse por eliminación y degradación excesiva, como en el síndrome nefrótico (pérdida de albúmina por orina), las alteraciones gastrointestinales (pérdida por heces) o quemaduras extensas (pérdida por la piel). • Hipogammaglobulinemia. Se origina por deficiencias en el sistema inmunitario. • Hiperglobulinemia. Se trata de un aumento de la secreción de globulinas como consecuencia de inflamaciones agudas, tumores o necrosis de tejidos:

¿Recuerda el concepto de reactante de fase aguda?

- Aumento de a-globulinas y ~-globulinas en el síndrome nefrótico (enfermedad renal). - Aumento de y-globulinas en inflamaciones, hepatopatías y enfermedades del colágeno. • Paraproteinemias. Se caracterizan por la presencia en plasma de alguna Ig anormal y/o de alguno de sus fragmentos. Con frecuencia son gammapatías monoclonales: Ig anormales en elevada cantidad, producidas espontáneamente por un clon de linfocitos B; por ejemplo, en mielomas múltiples, leucemias o linfomas. Además, también pueden ser consecuencia de diátesis hemorrágica, lesiones renales o síndromes de hiperviscosidad. • Crioglobulinemias. Se producen por la circulación en plasma de Ig que precipitan con la disminución de la temperatura. En general, son la causa de alteraciones relacionadas con los trastornos circulatorios en las regiones distales de las extremidades, en especial cuando se exponen al frío o por inflamación de los vasos sanguíneos.

e

MÉTODOS GENERALES DE DETERMINACiÓN DE PROTEíNAS PLASMÁTICAS

Existen distintas técnicas para la separación y la cuantificación de proteínas plasmáticas: electroforesis, inmunoelectroforesis, isoelectroenfoque, turbidimetría, nefelometría, inmunodifusión radial, radioinmunoanálisis o ensayos inmunoenzimáticos, algunos de los cuales se explican en otros capítulos de esta obra. Conviene destacar la electroforesis, que separa y cuantifica las proteínas según su carga y tamaño, en un campo eléctrico, en cinco fracciones elementales (patrones electroforéticos) :

Vídeo 42-1. Interpretación de los resultados de una electroforesis de proteínas.

• Albúmina: constituye el 55,8-66,1 0/0, aprox imadamente, de las proteínas totales.

563

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Capítulo 42

Análisis de magnitudes bioquímicas relacionadas con el metabolismo de principios inmediatos: proteínas

... Figura 42-1 . Patrón electroforético normal. Imagen cedida por: interlab-srl. com, en equipo para electroforesis de seroproteínas ~1-~2 y orinas/líquido cefalorraquídeo concentrados.

I

Alb

Albúmina

Alb

°1-antiprisina 01 Glycoproteína ácida °2-macroglobulina Ceruloplasmina Haptoglobinas o-lipoproteínas

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-

Albúmina

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-

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... Figura 42-2. Gammapatía monoclonal. Imágenes cedidas por: especia listarepremed.blogspot.com. Representaciones médicas .

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Hemopexina Transferrina Plasminógeno (3-lipoproteína

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C3

Fibrinógeno Inmunoglobulinas Proteína e reactiva

• Alfa-l-globulinas (0.-1): incluyen a-1-antripsina, a-1-lipoproteínas, protrombina y transcobalamina (2,9-4,90/0). • Alfa-2-globulinas (0.-2): incluyen ceruloplasmina, haptoglobina, a-2~lipopro­ teína, eritro poyetina y alfafetoproteína (7, 1-11 ,8 %). • Betaglobulinas (~): este grupo comprende transferrina, ~-lipoproteína, C3-C4 y hemopexina (7,9-13,7%). • Gammaglobulinas (1): se integran especialmente por Ig (11,1-18,8%). Existen patrones electroforéticos patológicos característicos frente al patrón electroforético normal (Fig. 42-1 ), como en la gammapatía monoclonal (Fig. 42-2), el síndrome nefrótico o fallo renal (Fig. 42-3), la cirrosis hepática (Fig. 42-4), la hipergammaglobulinemia (Fig. 42-5) y la inflamación aguda (Fig. 42-6). La inmunoelectroforesis combina el poder de separación de la electroforesis con la capacidad resolutiva de la inmunoprecipitación, que se basa en la especificidad inmunológica. Está indicada en pacientes en los que se han detectado anormalidades en los patrones electroforéticos obtenidos previamente. Desde otro punto de vista, para identificar los métodos que se van a utilizar, es necesario establecer de antemano si se quieren determinar las proteínas totales en sangre, las proteínas en orina o la albúmina en sangre, para lo que se distinguen diversas técnicas:

• Proteínas totales en sangre: para su análisis puede utilizarse suero o plasma: N p

y

... Figura 42-3. Síndrome nefrótico.

Imagen cedida por: especialistarepremed. blogspot.com. Representaciones médicas.

- Reacción de Biuret. Es el método colorimétrico de referencia. Entre sus características cuenta con elevada especificidad, gran precisión, gran reproducibilidad, pocas interferencias y permite la automatización. El fundamento de la prueba es que, en presencia de sales de cobre y medio básico, se forma un compuesto coloreado. Métodos refractométricos. Se utilizan ampliamente. Se caracterizan por una gran precisión, elevada exactitud y rapidez, pero están muy condicionados por las interferencias. El fundamento de esta prueba es que, en función de la cantidad total de proteínas, varía el índice de refracción de la luz. - Absorción en el ultravioleta. Resulta un método bastante preciso, bastante sensible y con elevada exactitud. Se fundamenta en que, debido al enlace peptídico de los aminoácidos, absorben en el ultravioleta.

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~

Análisis bioquímico

MóduLo V

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.A. Figura 42-4. Cirrosis hepática. Imagen cedida por: especialistarepremed. blogspo t.com . Rep resentaciones médicas .

4. Figura 42-5. Hipe rga m mag lobu li-

lA Figura 42-6. Inflamación aguda .

ne mia.

Imagen cedida por: especialistarepremed.b logspot.com. Representacio nes médicas.

Determinación de Lowry. Es un método que se utiliza poco, pero en el análisis de orinas tiene como características una gran sen sibilidad, aunque está muy sujeto a interferencias. • Albúmina en sangre: para su determinación se emplean métodos de fijación de colorantes. La fijación es má s o menos específica para ciertos colorantes (p. ej., el verde de bromocresol únicamente para albúmina). Es importante, junto a las proteínas totales, para el estudio del metabolismo proteico. • Proteínas en orina: la proteinuria (cantidad de proteínas en orina) es un indicador del estado del riñón. Se requieren los métodos más sensibles, por su baja concentración respecto a la de la sangre. También se utilizan para la cuantificación de proteínas en líquido cefalorraquídeo (para detectar infecciones en el sistema nervioso central, tumores cerebrales, etc.). Reacción de Biuret. En orina muestra escasa sen sibilidad y está sujeta a interferencia s. Métodos turbidimétricos. El que más se utiliza es el ácido tricloroacético, por su exactitud y pre cisión. D etermina la turbidez por pre sencia de proteínas. Métodos de fijación de colorantes. El que más se em plea es el azul brillante de C oom assie.

No debo olvidar qUB••• •

Las condiciones preanalíticas pueden influi r en las determinaciones. Se deben cumplir para la correcta valorac ión: el ayuno prev io, la elección y la manipu lación adecuada de especímenes y las condiciones de transpo r te , entre otras.

•

El nivel de proteínas en sangre puede informar sobre el metabolismo protéico del pac iente.

•

A través de los patrones elect roforéticos se pueden detectar cua dros patoló gicos.

•

La albúmina es la proteína plasmática más abundante en el organismo .

•

Exist en muchas prot eínas reactantes de fase aguda que aumentan su concent ración cua ndo se su fren inflamac io nes y procesos ag udos .

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Con elevado poder de separación de proteínas . Se fundamenta en el carácter polar de los lípidos. Permite obtener cuatro patrones electroforéticos. En el caso de detectar alteraciones electroforéticas, hay que alarmarse.

2. ¿CuáLes de Las siguientes proteínas son reactantes de fase aguda?

a. b. c. d.

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Caso práctico

d,e repas,o

1. La eLectroforesis es una técnica:

a. b. c. d.

~...

r.

Ferritina. Fibrinógeno. Proteína C reactiva. Todas las anteriores .

Una mujer de 26 años acude a urgencias por un dolor abdominal intermitente y coloración amarilla de la piel. La remite su médico porque ha detectado anemia, elevación de enzimas hepáticas e ictericia. Durante las últimas dos semanas su orina era oscura. En la exploración física no se observan anomalías, pero se solicitan ecografías ginecológica y abdominal [que no muestran alteraciones de interés) y un análisis de sangre complementario: e En el hemograma se detecta anemia macrocítica con hipersegmentación de neutrófilos. Los parámetros hemostáticos se muestran alterados: en fibrinógeno reducidos, y en tiempo de tromboplastina y protrombina, así como en dímero O, elevados. • En la bioquímica se ven alterados los parámetros hepáticos, principalmente: elevación de GOT, GGT, BT, BO, LOH y ferritina; saturación de transferrina y des censo de albúmina, de transferrina y de la capacidad total de fijación de hierro. ¿Qué diagnóstico diferencial se podría plantear y qué otras pruebas se podrían solicitar?

-. BIBLIOGRAFíA Álvarez R, Cruz C, Alonso C. Capítulos 11, 12, 13: Estudio del metabolismo de carbohidratos, las proteínas y de las lipoproteínas. En: Suardíaz], Cruz C, Colina A. Laboratorio clínico. Editorial Ciencias Médicas, 2004; p. 108-41. D'Ocon C, García M] , Vicente ]C. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico. Thomson Editores Spain Parainfo, S.A., 2006. Le Carrer D . Serum protein electrofixation immunofixation. Illustrated interpretation. Laboratoires Sebia, Edición 2005 . Strasinger S, Di Lorenzo M. Examen químico de la orina. En: Análisis de orina y de los líquidos corporales. 5a ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana, 2010; p. 53-80 . Stryer L, Berg ]M, Tymoczko ]L. Bioquímica. 6 a ed. Editorial Reverté, S.A, 2008. Valilla Massegú]. Pruebas analíticas en medicina. Barcelona: Editorial Espaxs, 2007.

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Indice de contenidos •

Introducción

•

Compuestos nitrogenados no proteicos: urea y creatinina

•

Determinación de bilirrubina total, directa e indirecta

•

Ácido láctico y ácido pirúvico

•

Alteraciones del metabolismo de las purinas: determinación de ácido úrico

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INTRODUCCiÓN En este capítulo se habla de los productos finales del metabolismo: los compuestos nitrogenados, la bilirrubina, el ácido láctico y las purinas. Los compuestos más abundantes del nitrógeno no proteico son urea, creatinina, ácido úrico y amonio. La determinación en el laboratorio clínico de estos metabolitos ofrece la información necesaria y proporciona los criterios apropiados que permiten una correcta evaluación de la función renal. La urea es el principal metabolito de las proteínas, junto con el amoniaco, y constituye alrededor del 50% de los solutos que contiene la orina. La concentración de urea en sangre oscila entre 10-40 mg/dL (1,7-6,7 mmollL) y sólo aumenta de modo significativo cuando se ha perdido más del 500/0 de la función renal. La creatina se sintetiza a partir del catabolismo de los aminoácidos, concretamente de la arginina, la glicina y la metionina, síntesis que se produce en el hígado, el páncreas y los riñones. Se transporta a través del sistema circulatorio al tejido muscular, el cerebro y otros órganos, donde se convierte en fosfocreatina. La bilirrubina es un pigmento amarillo ana ranjado, coloración que se debe a un compuesto tetrapirrólico liposoluble procedente del metabolismo del grupo «herno» de varias proteínas. El lactato se produce en los hematíes, en la piel, en el cerebro, en el músculo esquelético y otros lugares, pasa a la circulación y se metaboliza en el riñón y el hígado. Las purinas son compuestos esenciales para la síntesis de los ácidos nucleicos (ácido desoxirribonucleico [ADN] y ácido ribonucleico [ARNJ) y para una adecuada transmisión de la información genética.

e

• • • • •

Urea Creatinina Acidosis táctica Hiperbilirrubinemia Hiperuricemia

COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS: UREA y CREATININA

Dentro del grupo de los compuestos nitrogenados, los más abundantes en el organismo son la urea, la creatinina, el ácido úrico y el amonio. Son sustancias cristaloides de origen exógeno (procedentes de proteínas de la dieta) y endógeno (por catabolismo tisular proteico). Una correcta evaluación de la función renal, con la determinación de estos metabolitos en el laboratorio clínico, aporta la información necesaria para el clínico antes de establecer un diagnóstico. Conocer las determinaciones y el aclaramiento orgánico de la urea y la creatinina ayuda a tomar las decisiones adecuadas para instaurar un tratamiento.

El nitrógeno no proteico o compuestos de nitrógeno, puede ser convertido en proteínas por algunos organismos vivos; entre estas sustancias se encuentran la urea, la creatinina, el ácido úrico y el amonio.

Aclaramiento renal e insuficiencia renal El aclaramiento de cualquier sustancia se define como la relación entre la cantidad de una sustancia que se excreta por la orina por unidad de tiempo y su concentración en plasma, lo que permite conocer el volumen de plasma que se depura en 1 minuto. 569

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~

Capítulo 43

Análisis de mag nitudes bioquímicas relacionadas con los productos finales del metabolismo

El daño renal o el grado de función renal determinan el estadio de clasificación, indepen dientemente de la cau sa.

Por norma general, los valores de aclaramiento se expresan en mililitros por minuto (mL/min). El aclaramiento renal de solutos específicos puede relacionarse de manera práctica con la función renal; es útil también para determinar la frecuencia de la diálisis y la evaluación de la velocidad con que progresa una enfermedad renal. Hay que tener en cuenta que los valores normales de aclaramiento varían según la masa corporal, para lo cual estas cifras deben corregirse en función de la superficie corporal, especialmente en niños. La insuficiencia renal se puede clasificar como insuficiencia renal aguda o crónica. No existe una definición universal de insuficiencia renal aguda. En general, todas las definiciones de insuficiencia renal aguda subrayan el carácter inmediato del deterioro funcional renal. De igual forma, en lo que concuerdan todas las definiciones que se han consultado, es en la importancia del descenso brusco de la filtración glomerular y/o la elevación de los productos nitrogenados en sangre, como marcador universal de la insuficiencia renal aguda, cualquiera que sea su origen. La insuficiencia renal crónica se define como la disminución de la función renal, expresada por una filtración glomerular disminuida o la presencia de daño renal de forma persistente durante, al menos, 3 meses. Se reconocen cinco estadios de insuficiencia renal crónica y se aplica el término cuando la filtración glomerular es < 60 mL/min/l,73 rrr',

Urea

Normalmente la relación urea! creatinina en suero suele encontrarse entre 10:1 y 20:1.

La urea se sintetiza en el hígado a través del ciclo de la urea y una vez formada pasa a la sangre y se excreta por la orina. La urea constituye del 80 al 90% del nitrógeno urinario total. El 900/0 de la urea se elimina por el riñón mediante filtración glomerular, sin someterse a cursos activos de reabsorción ni de secreción tubular, aunque el 40-700/0 se difunde pasivamente desde el túbulo al intersticio para volver al plasma, en un proceso que depende del flujo urinario, que se incrementa cuanto más lento sea este flujo. La concentración de urea en sangre es, sin embargo, una medida bastante imperfecta de la función renal. Depende, entre otros factores, del aporte de proteínas en la dieta, del catabolismo proteico y del volumen de la diuresis. En el caso de pacientes en diálisis, la concentración de urea indica la degradación de las proteínas y sirve también como indicador del estado metabólico. En la insuficiencia renal terminal, los signos urotóxicos, en particular los relacionados con el sistema gastrointestinal, se correlacionan claramente con la concentración de urea.

Alteraciones de la urea Un aumento de urea en sangre (uremia) puede indicar enfermedad renal o un trastorno no renal como consecuencia de otra enfermedad. La uremia es el estado final de todas las insuficiencias renales progresivas. Es un síndrome clínico que resulta de la reducción grave de las funciones excretoras renales. Se caracteriza por grados variables de azoemia (aumento de sustancias nitrogenadas no proteicas en la sangre, no sólo urea), acidosis y desequilibrio hidro electrolítico. En la insuficiencia renal crónica la urea suele ser > 200 mgl dL y cuando hay coma puede llegar a ser > 400 mg l dL; la creatinina no suele pasar de 20 mgl dL y el ácido úrico, si no hay gota, no suele pasar de 10mg/dL. El aumento de urea en sangre puede deberse a varias situaciones, entra las que se encuentran: una reducción del volumen plasmático (shock, deshidratación, insufi ciencia cardíaca, hemorragia masiva, síndrome hepatorrenal), que constituyen una uremia prerrenal, sangrado digestivo por absorción rápida de la urea de la sangre, un incremento importante de aporte proteico, un catabolismo proteico excesivo (diabetes mellitus no controlada, tirotoxicosis, hiperfunción adrenocortical, infecciones y algunas neoplasias), que puede aumentar la urea en sangre, especialmente por reten ción de ésta (por lesión renal o excreción insuficiente por orina). El único método por el que el riñón lesionado puede compensar su disminución en la capacidad de concentración es aumentar la cantidad de orina excretada (que será de baja densidad). En 570

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MóduloV

Análisis bioquímico

ausencia de factores extrarrenales, la urea en .sangre se eleva cuando la lesión renal no permite eliminar la suficiente cantidad de agua para compensar la disminución de su capacidad de concentración (nefropatías, toxicidad por fármacos, etc.). El descenso de urea en sangre se observa especialmente en situaciones de hemodilución, durante el embarazo (en que hay una mayor filtración glomerular, que tiene como consecuencia una disminución de hasta dos terceras partes de los valores de urea), si existe fallo hepático (se sintetiza en el hígado), en estados de inanición, así como en la infancia.

Se obs e rva u n d es ce n s o dela urea en situaciones de hemodilución, embarazo y fallo hepático, entre otras causas.

Aclaramiento de la urea El aclaramiento de la urea fue una de las primeras pruebas de aclaramiento que se utilizó para medir el funcionamiento renal. La urea se filtra por el glomérulo y posteriormente experimenta una reabsorción parc ial en los túbulos, al mismo tiempo en que también es secretada, aunque en menor grado. El resultado normal es de 75 mL/min/1 ,73 rrr', lo que sugiere una insuficie ncia renal cuando se obtienen valores por debajo de 50 mLImini 1,73 rrr', Ahora bien, si se tiene en cuenta el valor normal y la filtración glomerular que se obtiene es de 120 mLImini 1,73 rrr', se deduce que hay una participación importante del túbulo (en que se produce tanto la reabsorción como la excreción). En cualquier caso, la reabsorción tubular de la urea filtrada está muy influida por la diuresis, la cual depende, a su vez, del grado de hidratación. Por esta y otras razones, la prueba de aclaramiento de la urea prácticamente se ha abandonado.

Determinación analítica de la urea Se han empleado muchos métodos analíticos para determinar la urea. El que se usa en la actualidad es la reacción enzimática con ur eas a, una enzima muy estable y con gran especificidad. Esta enzima convierte la urea en presencia de agua, por hidrólisis, en dióxido de carbono y amoniaco. Interviene el nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida NADH) que pasa a nicotinamida adenina dinucleótido (forma oxidada NAD+). En una segunda reacción, el 2-oxoglutarato reacciona con el amoniaco en presencia de glutamato deshidrogenasa (GLDH) y de coenzima NADH, para producir L-glutamato y NAD+. En esta reacción, por cada mol de urea hidrolizada se oxidan dos moles de NADH a NAD+. La velocidad con que la concentración de NADH disminuye es directamente proporcional a la concentración de urea en la muestra. Se determina midiendo la absorbancia a 340 nm (Fig. 43-1). En la actualidad, muchos laboratorios expresan la concentración de urea en términos de nitrógeno ureico en sangre (blood urea nitrogen, BUN). La conversión de BUN en urea o viceversa se realiza teniendo en cuenta que la urea tiene un peso molecular de 60 y los dos átomos de nitrógeno de la urea de 28 (la relación es 60128 = 2,14 Y 28/60 = 0,47).

Creatinina Cuando la creatinina llega al tejido muscular, al cerebro y a otros órganos, transportada por el sistema circulatorio, se transforma en fosfocreatina. Se dispone así de grandes concentraciones de fosfocreatina en el músculo, donde es una forma importante de depósito de fosfato de alta energía (trifosíato de adenosina, ATP). La creatinina es el anhídrido de la creatina, producto de excreción sin ningún papel fisiológico. Diariamente del 1-2% de la creatina muscular pasa a creatinina, la cual se libera a la sangre y se filtra por el glomérulo. Se excreta de manera constante por la orina. A diferencia de la urea, no se altera por la ingesta. Tanto los niveles plasmáticos como la depuración renal de creatinina dependen de la masa muscular y su producción varía con la edad, el sexo y las enfermedades musculares, como necrosis muscular y atrofia muscular. Las cifras normales son inferiores a 1,3mg/dL (105 mmol/L) para el hombre y 0,9 mg/dL (79 mmol/L) para la mujer.

- - - - -..... 2NH4++C032NH4++ 2-oxoglutarato + NADH -

2NH4++ C032-

A Figura 43-1. Reacción de la urea.

571

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- Ii

Capítulo 43

Análisis de magnitudes bioquímicas relacionadas con los productos finales del metabolismo

aclaramiento de la creatinina es una prueba básica del El

funcionamiento renal.

Alteraciones de la creatinina Para evaluar la función renal se prefiere la creatinina a la urea, debido a que es independiente del metabolismo proteico y de la hidratación. Tiene aumentos y descensos más lentos en presencia de lesión renal; de ahí que sea menos útil que la urea para valorar la efectividad de la hemodiálisis en el tratamiento de la insuficiencia renal. En general, los cambios fisiopatológicos de la creatinina son los mismos que los de la urea.

Aclaramiento de creatinina Debido a la facilidad de determinación de la creatinina y a su concentración constante en sangre, se usa el aclaramiento como prueba muy útil en la valoración de la filtración glomerular. El cálculo del aclaramiento de creatinina (CCr) se realiza mediante la fórmula general de aclaramiento de una sustancia:

CCr = Crurinaria (mg/mL)

X volumen

de orina(mL/min)/Cr plasmática (mglmL)

Los valores de referencia del CCr en el hombre se consideran de 80 a 125 mL/ min y en la mujer de 75 a 115 mL/min. Sin embargo, este parámetro tiene una serie de limitaciones importantes: • La sobrestimación, en individuos con función renal normal, de la filtración glomerular entre un 10-200/0 respecto a la que se obtiene mediante el aclaramiento de inulina. • Los inconvenientes que suponen para el paciente la recogida de orina de 24 horas. • Los errores cometidos durante el proceso de recogida de la orina de 24 horas, que afectan sobre todo a niños y ancianos. • La importante carga laboral que representa para el laboratorio trabajar con orinas de 24 horas (elaboración y explicación de las normas de recogida, interrogatorio personalizado a cada paciente para valorar la idoneidad de la recogida, la homogeneización, medición de volumen y obtención de alícuotas para análisis posterior) .

Existen numerosas ecuaciones para el estudio de la filtración

glomerular.

Distintas guías de práctica clínica y sociedades científicas recomiendan la utilización de ecuaciones de estimación de la filtración glomerular para evaluar la función renal. Estas ecuaciones incluyen la medida de la concentración sérica de creatinina junto a otras variables como el sexo, la edad, la talla y la etnia. Entre más de 40 ecuaciones de estimación de la filtración glomerular publicadas hasta la fecha, las más conocidas y validadas en distintos grupos de población son la ecuación de Cockcroft-Gault y la ecuación del estudio «Modification ofDiet in RenalDisease» (MDRD). Recientemente, el grupo Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI) ha publicado una nueva ecuación que lleva su nombre y que probablemente sustituirá a las anteriores. En niños, la ecuación que más se aplica es la de Schwartz, en su versión clásica (para métodos de Jaffé sin trazabilidad a espectrometría de masas por dilución isotópica [isotope dilution mass spectrometry, IDMSJ) o modificada (para métodos enzimáticos con trazabilidad a ID MS). Sin embargo, la estimación de la filtración glomerular mediante ecuaciones presenta una serie de limitaciones, como consecuencia de las características de la población de origen de las estimaciones, así como de los procedimientos de medida de creatinina, que condicionan la veracidad y la incertidumbre de los resultados de estimación de la filtración glomerular obtenidos en los distintos laboratorios clínicos.

Determinación analítica de la creatinina Los métodos clásicos que se utilizan para la determinación de creatinina se fundamentan en la reacción de esta sustancia con picrato en medio alcalino, lo que da lugar a la formación de un compuesto rojo anaranjado (reacción de Jaffé). Es una técnica simple y de bajo coste, aunque su principal inconveniente es la falta de especificidad, con interferencias tanto positivas como negativas, que condic ionan un error de

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,

Módul9 V

Análisis bioquímico

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Creatinina + H20

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Creatinina

.... Figura 43-2. Reacción enzi mátic a de la creat inina.

Sarcosina + urea Glicina + fo rmaldeh ído + H202 Cromógeno de quinonaimina

o H202 + 4-aminoantipirina + HMMPS ----~-_.

Pigmento azul

medición proporcionalmente mayor para concentraciones de creatinina < 177 umol/L (2,0 mg/ dL). Así, sustancias como las proteínas, la glucosa, el ácido ascórbico , los cetoácidos, el piruvato y el ácido úrico reaccionan con picrato, lo que produce una sobrestimación de la concentración de creatinina; por otro lado, concentraciones elevadas de bilirrubina y de hemoglobina, como las que se encuentran en las muestras hemolizadas, enmascaran el color y ocasionan una infraestimación de su concentración. Para contrarrestar la falta de especificidad de la reacción de Jaffé se han introducido múltiples modificaciones, tanto en la composición de los reactivos como en el procedimiento de medida, entre las que destacan las siguientes actuaciones: a) la medida del producto de la reacción, no en el equilibrio, sino durante su formación. En estos métodos, conocidos como cinéticos, las lecturas se realizan cuando algunos interferentes ya han intervenido en la reacción o cuando no lo han hecho todavía; b) la realización de un blanco de muestra o la inclusión de ferro cianuro potásico, bilirrubinaoxidasa o dodecilsulfato, con la finalidad de disminuir la interferencia por bilirrubina; e) la introducción de un factor de corrección negativo (-18 a -26 umol/L, según el fabricante) para minimizar la interferencia positiva que se atribuye a los seudocromógenos. Estos métodos, denominados compensados, asumen que la interferencia es constante y que puede ser excesiva en los pacientes en que la tasa de producción diaria de creatinina es baja y la presencia de seudocromógenos variable, como ocurre en niños, ancianos, mujeres embarazadas y pacientes oncológicos. Todos estos inconvenientes han hecho que los fabricantes hayan introducido en su cartera la determinación enzimática de creatinina. En esta reacción, la creatinina se transforma en formaldehído, glicina y peróxido de hidrógeno, mediante las enzimas creatininasa, creatinasa y sarcosinaperoxidasa. La cantidad de peróxido de hidrógeno es cuantificada por una reacción enzimática, distinta según el fabricante, que genera un cromógeno mediante la enzima peroxidasa (Fig. 43-2). Los métodos enzimáticos consiguen una especificidad analítica mayor a los de la reacción de Jaffé, porque son menos sensibles a las interferencias por seudocromógenos, aunque diferentes estudios muestran que la interferencia por bilirrubina puede ser semejante o superior. Se han descrito también interferencias por ciertos fármacos, aunque en concentraciones elevadas. Estos métodos tienen una menor imprecisión frente al de Jaffé cinético y una mejor correlación con el procedimiento de medida de referencia.

e

Generalm ente, la urea y la cre atinina están elevadas en la en fermedad renal. La urea también puede estar elevada en otras condiciones. Sin embargo, es inusual encontrar la creatinina elevada cuando la urea se mantiene en valores normales.

DETERMINACiÓN DE BILIRRUBINA TOTAL, DIRECTA E INDIRECTA

El 85% de la bilirrubina proviene de la degradación de los hematíes circulantes senescentes; el 15 % restante procede del catabolismo hepático de hemoproteínas tisulares (mioglobina, catalasas y citocromos) y de la destrucción de hematíes inmaduros en la médula ósea (eritropoyesis ineficaz).

Metabolismo de la bilirrubina La bilirrubina es un producto de degradación de la hemoglobina, que se forma en las células del sistema reticuloendotelial. En este proceso, el hierro se libera y se recu-

573

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2,2 mmol/l (Tabla 43-2). N o hay un valor de concentración aceptado de manera universal para el diagnó stico de acidosis láctica, pero niveles de lactato ~ 5 mmollL definen una acidosis láctica con aumen to del aniongap, cuyo pronóstico empeora a medida que aumentan estos niveles.

Acidosis láctica

Ácido láctico Ni ños

< 115-120mmo l/ mol creatinin a

Ad ultos

13-19 mmol/mo l creatinina

Áci do láctico

< 1.8 mmol/L

Ácido pirúvico

225 nM Tampón tris con concentración de alanina >225 mM Métodos sup lementados con piridoxalfosfato Métodos de química seca

20-40 U/L

Reacción cinét ica con: Lactato-desh idrogenasa [LDH)

• Piruvato a lactato, concentración de sustrato> 0,7 mmol/L • Piruvato a lactato, concentración de sustrato ~0 ,7 mmol/L Lactato a piruvato • Métodos de química seca

230-460 U/L

Fosfatasa alcalina (ALP)

Reacción cinét ica con: • Sustrato 4-n itrofenilfosfato con tampón 2-amino-2-metil-1propanol • Sustrato 4-n itrofenilfosfato con tampón dietilamina • Métodos de química seca

Dependientes de edad, sexo, embarazo, varían según el método de determinación y la temperatura

Gammaglutamiltransferasa (GGT)

Reacción cinét ica con: • Sustrato gammaglutamil-3-carboxi-4-nitroanilida con concentración >4 mmol/L • Sustrato gammaglutamil-3-carboxi-4-nitroanilida con concentración

Capítulo46

La diferencia entre osmolaLidad y osmolaridad es que la primera expresa el contenido de solutos osmótica mente activos por peso, y la segunda mide la concentración de solutos en volumen.

_

Re~lización de técnicas de estudio de muestras de orina

ciones en la hidratación y en el diagnóstico diferencial de las oligurias. Frecuentemente se solicita al laboratorio la medida de osmolaridad en muestras de suero y orina del mismo paciente. Aunque existen fórmulas para el cálculo en suero, no son tan fiables en orina, ya que su composición varía, por lo que se suele medir la osmolaridad con un osmómetro. Estos equipos pueden usar metodologías basadas en las propiedades coligativas de la muestra: aumento del punto de ebullición, disminución de la presión de vapor o por descenso del punto crioscópico. Actualmente, la mayoría de los osmómetros que se utilizan en el laboratorio siguen la metodología del descenso del punto crioscópico, que consiste en congelar la muestra de orina que se desea medir y relacionarla con un estándar de concentración conocida.

• EXAMEN BIOQuíMICO DE LA ORINA. ANÁLISIS SISTEMÁTICO CON TIRAS REACTIVAS. QUíMICA SECA

Vídeo 46-1. Análisis de orina, mediante tira multirreactiva.

En los sistemas manuales se compara el color de la tira reactiva de análisis con un patrón que acompaña al envase y en los sistemas automatizados la lectura se realiza por fotome-

tría de refLectancia.

La introducción de la química seca ha supuesto un gran avance técnico y hoy en día el análisis sistemático de la orina se realiza generalmente con tiras reactivas. Consisten en un soporte de plástico donde se incorporan unas almohadillas (área reactiva) que contienen los reactivos y los tampones necesarios para producir una reacción química y una malla que impide que se mezclen los colores entre las almohadillas. Cuando se humedecen con la muestra de orina, se producen reacciones químicas y las áreas reactivas de la tira cambian de color, haciendo posible la medida de cada resultado, según la concentración del analito de la muestra. La lectura de resultados se puede obtener mediante métodos manuales o automatizados. En el procedimiento manual la tira se sumerge hasta la marca, se descarta el exceso de líquido en un papel de filtro y una vez transcurrido el tiempo de reacción (en general, 60 segundos para casi todos los analitos, excepto para leucocitos, que suele ser 120 segundos, según las instrucciones del fabricante) se procede a la lectura de la tira mediante la comparación de color con un patrón que se suministra en el envase de las tiras. Con los sistemas automatizados la lectura se realiza por fotometría de reflectancia. Los datos se pueden obtener con la impresión en papel o se pueden incorporar directamente al sistema informático del laboratorio (SIL), si el equipo está conectado on lineo Las tiras que existen en el mercado analizan distintos parámetros, en número variable, y también puede variar el fundamento de la técnica que emplean, así como el rango de ensayo de medida, por lo que para llevar a cabo correctamente cada técnica deben conocerse las instrucciones del fabricante y los protocolos de laboratorio que se describen en el manual de calidad. En general, se deben tomar las siguientes precauciones: • Tomar muestras de orina nativa (sin centrifugar) para analizar. Desechar las tiras reactivas que han sobrepasado la fecha de caducidad que se indica en la caja. • No dejar las tiras fuera de su envase. Las tiras son higroscópicas, por lo que se ven afectadas por la humedad del ambiente o por salpicaduras. La tira debe sacarse del envase en el momento del análisis y cerrar el recipiente inmediatamente después de extraer la tira. • No hay que dejar la tira dentro del tubo de muestra de orina. La técnica debe hacerse con una inmersión breve de la tira en la muestra, desechando en papel de filtro el exceso de líquido. • Si se hace de forma manual, hay que esperar el tiempo de reacción estipulado antes de la lectura. Si se realiza la lectura automática, se deben seguir previamente las instrucciones del fabricante del equipo respecto a la puesta a punto (controles, calibración, reactivos, etc., según las recomendaciones de cada caso), así como al correcto mantenimiento. Los parámetros que usualmente se miden en la tira reactiva se describen a continuación (Tabla 46-1 ).

614

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~

Análisis bioquímico

Parámetros

,

.

Módulo V

Valores de referencia

Fundamento

pH

Combinación de dos indicadores o más (rojo de metilo, azul de bromotimol, fenolftal eína) que reaccionan con los iones de hidrógeno presentes en la muestra de orina

De 4,8 a 7,4 a lo largo del día y de 5,5 a 6,5 en la primera orina de la mañana

Glucosa

Reacción enzimática catal izada por glucosa-oxidasa , con la formación de ácido glucurónico y peróxido de hidrógeno que oxida el indicador

La glucosa no debe aparecer en la orina (negat iva 5,3 y con riesgo de litiasis úrica si el pH es :s; 5,3. Uratos (pH 5,5-6): se trata de las sales sódicas, potásicas, cálcicas, magnésicas y amónicas del ácido úrico. Los uratos amónicos cristalizan a pH alcalino. Se presentan bajo formas amorfas. Tirosina y leucina: se trata de aminoácidos cristalizables que se acumulan en procesos hepáticos graves o en errores congénitos del metabolismo del hígado. La tirosina se presenta como prismas aciculares en rosetas o estrellas y la leucina en forma poliédrica parecida a la del colesterol o en pequeñas esferas. No forman cálculos . Medicamentos: se suelen presentar bajo formas aciculares o como prismas muy alargados y laminillas agregadas de grandes dimensiones. Antibióticos, sulfamidas, triamterene, aciclovir, indinavir, etc., todos ellos presentan riesgo de litiasis e insuficiencia renal.

Los cristaLes predominantes en orinas ácidas son: oxalato cálcico monohidratado o whewellita, oxalato cálcico dihidratado o weddellita, ácido úrico, uratos , tirosina y leucina y medicamentos.

• Cristales predominantes en orinas alcalinas: Hidroxiapatita y carboxiapatita (pH > 7): toman la forma de precipitados amorfos, de color blanco grisáceo a simple vista. Fosfato ácido de calcio o brushita (pH ~ 6,5): son cristales incoloros, brillantes, se suelen presentar como prismas monoclínicos delgados, a veces en rosetas 623

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Capítulo46

Realización de técnicas de estudio de muestras de orina

y gavilla, otras veces apuntados que toman el aspecto de un lápiz. Se asocia con Los crista les predominantes en orinas alcalinas son: hidroxiapatita y carboxiapatita, fosfato ácido de calcio o brushita y fo sfato amónico-magnésico o es truvita.

alteraciones del calcio y el fosfato y entraña el riesgo de formar cálculos renales. Fosfato amónico-magnésico o estruvita (pH 7-9): antes fosfato triple. La forma cristalina típica es en «tapa de ataúd». Cuando precipita demasiado rápido, da lugar a formas incompletas como trapezoides, prismas, formas en aspa, etc. Su hallazgo siempre indica infección por gérmenes ureolíticos, es decir, bacterias que producen ureasa que desdobla la urea y genera amonio. Las infecciones pueden cronificarse y generar la formación de cálculos coraliformes. • Compuestos anfóteros: se presentan en orinas con un pH entre 6 y 8: - Biurato amónico: se puede presentar bajo tres formas: esferas de color marrón verdoso con estriaciones radiales (pH < 7) asociado a hiperuricosuria, diarreas crónicas y pérdidas de fosfato, con bajo riesgo litogénico; esferas con algunas o muchas prolongaciones espiculadas de color parecido al anterior (pH > 7) y asociado a hiperuricemia e infección por gérmenes ureolíticos y con riesgo litogénico alto; o como bastoncillos de extremos redondeados (aspecto de cacahuete, pH > 8). Cistina (pH 6-7,5): se presenta como prismas hexagonales perfectos y transparentes, a veces con macIas. La cisteinuria es una enfermedad congénita que se caracteriza por una deficiente reabsorción tubular de los aminoácidos dibásicos: arginina, leucina y cistina. Supone un alto riesgo de litiasis. Colesterol: se presenta como placas prismáticas transparentes y birrefringentes con unas irisaciones inconfundibles a la luz polarizada. Su hallazgo suele indicar patología de los conductos linfáticos, que puede deberse a obstrucción (tumores, adenopatías) o a rotura (cirugía, traumatismos).

El enfoque actual del estudio de las cristalurias como indicadoras de alteraciones metabólicas, riesgo de insuficiencia renal aguda por medicamentos y riesgo litogénico, requiere que el informe analítico sea lo más descriptivo posible en cuanto al número, tamaño, espesor y formas en que se presentan los cristales, si están o no agregados, si forman macIas o cualquier otra característica que se aprecie.

Automatización del análisis de orina Aunque el examen microscópico manual del sedimento urinario siga siendo considerado el método de referencia, sobre todo si se realiza mediante un sistema estandarizado, hay que tener en cuenta que los muchos pasos manuales en su preparación (centrifugación, decantado, resuspensión) y la variabilidad interobservador pueden dar lugar a imprecisión e inexactitud en los resultados. La automatización del sedimento ha supuesto un gran avance a favor del tiempo y la estandarización, que reduce en gran medida el número de muestras que requieren ser revisadas al microscopio. Actualmente existen en el mercado tres tecnologías disponibles: • Citometría de flujo. Es la tecnología que utilizan los contadores hematológicos en el análisis de sangre. El fundamento de este método se basa en el recuento y la clasificación de los elementos formes por sus propiedades ópticas de dispersión de la luz y por su capacidad de emitir radiación fluorescente cuando se tiñen con compuestos fluoróforos. De esta forma el equipo clasifica hematíes, leucocitos, células epiteliales, bacterias (que se determinan con un canal propio) y cilindros. Como elementos de presencia concreta clasifica cilindros patológicos, levaduras, espermatozoides, mucus, cristales, otras células y partículas no identificadas. Se tra baja con un tubo primario que requiere 4 mL de muestra en modo automático y es capaz de procesar 100 muestras/hora. • Microscopia automática sobre muestra de orina nativa. El equipo aspira 1 mL de orina hasta una célula de flujo iluminada con una luz estroboscópica (25 flashes/ segundo) para conseguir las imágenes que capta un objetivo microscópico acoplado 624

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Módulo V

Análisis bioquímico

a un ocular y, a su vez, a una cámara de vídeo digital que capta un total de 500 fotogramas por muestra. Cada elemento forme presente en la imagen se aísla y se clasifica con un software especial de reconocimiento de partículas llamado automated particle recognition (APR) según su tamaño, con traste, forma y textura en un total de 12 categorías directas y 23 indirectas y comparadas con una base de datos que contiene 26.000 imágenes instalada en un ordenador. En la pantalla de revisión y validación se visualiza la identificación del pa ciente, los resultados de la tira y cada elemento forme por separado. El equipo utiliza un tubo primario y procesa entre 80 y 101 muestras/hora. Su capacidad analítica se puede ver incrementada con la conexión por puente físico de un analizador de tiras de orina, que dispone también de un software especial para líquidos biológicos. • Microscopia automática sobre orina centrifugada. Se basa en el estudio microscópico automático de una muestra centrifugada de orina. El analizador aspira 2 mL, de los cuales, 0,2 mL se transfieren de forma automática a una cubeta y se centrifugan a 2.000 rpm; una cámara digital acoplada a un microscopio de campo brillante capta hasta 15 imágenes del sedimento y un ordenador que dispone de un software de alta calidad capaz de identificar y clasificar las partículas de la orina: eritrocitos, leucocitos, células epiteliales escamosas, células epiteliales no escamosas, cilindros hialinos, cilindros patológicos, crist ales de oxalato cálcico monohidratado, ).oxalato cálcico dihidratado, fosfato amónico-magnésico, ácido úrico, bacterias, ; levaduras, espermatozoides y filamentos de m oco. Los resultados pueden expresarse por campo y por unidad de volumen. La visualización en la pantalla de validación tiene la identificación del paciente, los resultados de la tira y se ven todos los elementos de forma similar a un campo microscópico de 40x. El equipo utiliza un tubo primario y procesa entre 80 y 100 muestras/hora, según el número de fotografías que muestra. Su utilización, junto con el lector automático de tiras, incrementa la productividad en el análisis de muestras (Figs. 46-2 y 46-3 ). Todos los sistemas requieren algún tipo de reclasificación y están conectados al SIL del laboratorio, por lo que los resultados que ha n sido validados pasan directamente a la analítica del paciente.

A Figura 46-2. Hematuria microscó-

pica.

... Figura 46-3. Cristales de ácido úrico

en or ina.

• CÁLCULO DEL ACLARAMIENTO DE CREATININA y FÓRMULAS DE ESTIMACiÓN DE LA FILTRACiÓN GLOMERULAR La medida del aclaramiento está relacionada con la funcionalidad del riñón y con su capacidad de filtración. Conocer si la función renal es adecuada tiene un amplio uso clínico y especial relevancia en el seguimiento de los tratamientos con fármacos de eliminación renal, así com o para el diagnóstico precoz de la enfermedad renal crónica, el seguimiento de la progresión y la previsión del inicio de tratamiento renal sustitutivo con diálisis. La valoración de la filtración glomerular que se mide a través de la depuración o aclaramiento de una sustancia es el mejor índice para evaluar la función renal. El valor de la filtración glomerular varía en relación a la edad, el sexo y la masa corporal y se sitúa alrededor de los 140 mL /min/ 1,73 men individuos adultos jóvenes sanos. La mejor estimación de la filtración glomerular requiere que la sustancia que se utiliza para llevar a cabo la medición se filtre libremente, no se reabsorba, ni se secrete en el túbulo renal y, además, que no presente eliminación fuera del riñón. Se han utilizado distintas sustancias, exógenas y endógenas, para conocer la filtración glomerular a partir de su aclaramiento renal o plasmático. Entre las exógenas (que se suministran al paciente para realizar la prueba) se encuentran la inulina, así como distintas moléculas que se marcan con isótopos radioactivos y también no isotópicas (iohexol, iotalamato), todas ellas de difícil im plementación en la práctica habitual debido a su laboriosidad en el procedimiento, al elevado coste económico y a la necesidad de metodología de la que no se dispone, habitualm ente, en la mayoría de los laboratorios clínicos.

El aclaramiento renaL se define como el volumen de plasma que queda totalmente libre de una sustancia a su paso por el riñón por unidad de tiempo [mL/minutoJ.

625

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Capítulo 46

La prueba de acLaramiento de creatinina compara la concentración de crea t inina en una muestra de orina de 24 horas con la concent ración de creatinina en la sang re .

Realización de técnicas de estudio de muestras de orina

Entre las endógenas (que produce el propio paciente), se utilizan la creatinina y la urea. También se han estudiado distintas proteínas de bajo peso molecular, como la cistatina C. La creatinina sérica es una sustancia de producción endógena que se deriva del metabolismo de la creatina y la fosfocreatina en el tejido muscular, que filtra libre mente el glomérulo y en un 10-15 % se secreta en los túbulos . Debido a esta secreción tubular, se acepta que suele haber siempre una sobrestimación en la tasa de filtración glome rular calculada a partir de la creatinina en sangre y orina. La medida de creati nina sérica, por sí sola, no se recomienda para el diagnóstico de insuficiencia renal, ya que la relación entre la con centración sérica de creatinina y la filtra ción glomerular no es lineal sino hiperbólica, por lo que se precisan descensos de la filtración glomerular de, al menos, el 50 % para que la concentración sérica de creatinina se incremente por encima del intervalo de referencia. En la prá ctica, para la estimación de la filtración glomerular se utiliza el aclaramiento de creatinina y las fórmulas de estimación de la filtración glom erular. La creatinina se produce a ritmo constante y se filtra libremente por el glomérulo, por lo que si se conoce la con centración de creatinina en suero, en orina y el volumen de diuresis , se puede calcular el aclaramiento de creatinina y así estimar la filtra ción glome rular. Para la realización del cálculo del aclaramiento de creatinina, se precisa una muestra de orina de 24 horas (recogida, conservada, tran sportada y medida siguiendo todas las especificaciones de calidad preanalítica) y una mue stra de suero paralela. Tras la determinación de creatinina en suero y orina y con la medida del volumen de la orina del paciente en 24 hora s, se aplicará la fórmula de la tabla 46-3, para obtener los resultado s.

Acla ramiento de creatinina iCcr] '

Ccr

=[Diuresis (orina/24 hl x Cr orina (mg/dL)] + [1.440 x Cr suero (mg/dL)]

Fórmulas de estimación de la filtración glomerular (FG)

Fórmula de Cockcroft y Gault: Ccr estimado (mL/min) = [(140 - edad

íañosll x peso íkqll + [Cr suero (mg/dL) x 72]

Si el paciente es mujer, se multiplica por 0,85 MDRD-4 FG estimada

= 186 x lcr suero)-l,154 x

[edad) -0.203 x [0}42 si es mujer) x [1,210 si es de raza negra)

MDRD-6 FG estimada = 170 x [cr suero}"?" x [edad) -O,176,x [urea suero x 0,467)-0,1 70 x [albúmina suero)O,31 8x [0 ;762 si es mujer) x [1,180 si es de raza negra)

Ecuación de Schwartz FG [mL/m in/1}3 m 2) = K x talla

lcrnl/Cr suero lrnq/dl.l

El va lor de la constante K varía con la edad del niño', siendo: , -

0,33 pa ra recién nacidos y lactantes prematuros . 0,45 para recién nacidos a término y lactantes durante el primer año de vida 0,55 para niños mayores de un año de edad 0,7 para adolescentes hombres o 0,57 para adoles centes mujeres

Abreviaturas y unidades conven,cionales Ccr lrn l.Zminl = aclaramie nto de creatin ina Diuresis = volumen de orina de'24 horas Cr orina = creatinina medida en orina Cr suero = crea tinina medida en suero 1.440 = t iemp o en minuto s [24 horas )

626

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Módulo V

Análisis bioquímico

Las ecuaciones para la estimación de la filtración glomerular es una medida indirecta del aclaramiento de creatinina y su uso está recomendado en distintas guías de la práctica clínica. Entre más de 40 ecuaciones de estimación de la filtración glomerular publicadas hasta la fecha, las más conocidas y validadas en distintos grupos de población son la ecuación de Cockcroft-Gault y las ecuaciones del estudio MDRD (-.-!iI~"1J"¡~t.;;.,,~~"'"""~-.~~"t~~..:~~-:n;~Jt-

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Estudio de otro~ líquidos y·elementos corporales

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Los valores normales fluctúan de la siguiente manera: Presión de 70 a l S0mm H 2 0 . Apariencia: transparente, sin color. Proteína total en LCR: 15-60 mg/100 mL. Gamma globulina: 3-12 % de la pr oteína total. Gl ucosa en LCR: 50-SOmg/100 mL (o mayor a 2/3 de la concentración de azúcar en la sangre). • Recuento de células del LCR: 0-5 glóbulos blanco s (todos mononucleares) yausencia de glóbulos rojos. • Cloruro: 110-125 mEq/L.

• • • • •

Se consideran resultados anormales cuando el aspecto del LCR es turbio, que podría significar que hay una infección o una acumulación de leucocitos o proteínas. Si el LCR es sanguinolento o rojo, puede ser un signo de sangrado u obstrucción de la médula espinal. Si es marrón, naranja o amarillo, puede ser un signo de aumento de proteínas en el LCR o un sangrado previo (con más de 3 días de anterioridad). Ocasionalmente, puede haber sangre en la muestra proveniente de la punción raquídea en sí, lo cual hace más difícil la interpretación de los resultados del examen.

¿Recu erd a qu é sugi er e un LCR xantocrámi co?

Proteínas en LCR: • El aumento de las proteínas en el LCR puede deberse a sangre en dicho líquido o enfermedades como diabetes, polineuritis, tumores, lesión o cualquier afección inflamatoria o infecciosa. • La disminución de proteínas es un signo de producción rápida de LCR. Glucosa en LCR: • El aumento de la glucosa es un signo de glucemia elevada en la sangre. • La disminución de la glucosa puede deberse a hipoglucemia, infección bacteriana o micótica (como meningitis), tuberculosis o ciertos tipos de meningitis. Células sanguíneas en LCR: • El aumento de los leucocitos en el LCR puede ser un signo de meningitis, infección aguda, inicio de una enfermedad crónica, tumor, absceso, accidente cerebrovascular o enfermedad desmielinizante (como la esclerosis múltiple). • La presencia de hematíes en la mu estra de LCR pu ede ser un signo de sangrado en dicho líquido o la consecuencia de una punción lumbar traumática (Tabla 48-1 ).

Patología

Aspecto

Proteína (mg/dL)

Glucosa (mg/dL)

CéluLas

Meningitis bacteria na

Turbio

80-500



_

'

:.

Estudio de otros líquidos y elementos corporales

Capítulo 48

Es necesario para la observación de cristales el uso de un microscopio de luz pola rizada con un compensador rojo de primer orden. Los tipos de cristales que se pueden encontrar en una muestra de líquido sinovial son: • Cristales de urato monosódico. Suele tener forma de agujas o bastones de 3 a 511mde largo. • Cristales de pirofosfato cálcico. Tienen forma de bastones o pueden ser romboides, polimorfos o incluso visualizarse como cuadrados, pequeñas esferas puntiformes, etcétera. • Cristales de hidroxiapatita y otros cristales de fosfatos básicos y brushita. Adoptan la forma de pequeñas esférulas, pero pueden presentarse como fragmentos irregulares y masas amorfas de gran tamaño. Los cristales de brushita tienen forma de rectángulos o son romboides y tienen birrefrigencia positiva. • Cristales de oxalato cálcico. Pueden tener forma de «sobre de carta». • Cristales de colesterol. Tienen diversas formas: de rectángulos, bastones o agujas rectas o curvas. Los más característicos son los que forman láminas rectangulares o cuadrados con una muesca en uno de sus ángulos, y pueden medir 100 llm. • Cristales de esteroides. Son frecuentes y generalmente secundarios a infiltraciones con esteroides antiinflamatorios. Pueden adoptar diferentes formas y su birrefrigencia es intensa con elongación positiva y negativa; persisten en el líquido sinovial varios meses después de la infiltración.

Lo interesante del estudio bioquímico del líquidosinovial suele ser la concentración de glucosa y para ello se usa el sobrenadante tras la centrifugación.

Generalmente el estudio bioquímico del líquido sinovial suele tener poco interés, con la excepción de la determinación de glucosa. Para el estudio bioquímico se utiliza el sobrenadante, que se obtiene tras la centrifugación del líquido previamente tratado con hialuronidasa. La interpretación adecuada de los valores de glucosa en el líquido sinovia! requiere una comparación con la concentración en suero, que de forma ideal se obtiene tras 8 horas de ayuno, lo que permite el equilibrio de la glucosa a través de la membrana sinovial. La concentración de glucosa en el líquido sinovial es similar a la glucemia en los procesos no inflamatorios y está disminuida en los inflamatorios infecciosos. Si los valores son inferiores a la mitad de los valores normales, indican artritis séptica. El aumento de las proteínas totales es un reflejo del aumento de la permeabilidad vascular, por lo que no reviste mayor interés clínico . Concentraciones de lactato > 15 mmol/L suelen asociarse con artritis séptica. Niveles inferiores no descartan la presencia de una posible infección. El pH normal ha de ser < 7,4 en los líquidos sinoviales. La lactato-deshidrogenasa se incrementa en los procesos inflamatorios e infeccio sos y refleja el infiltrado leucocitario. El colesterol se mue stra aumentado en la artritis reumatoide crónica. Es importante controlar el factor reumatoide y los anticuerpos antinucleares. Otro dato revelador en pacientes con artritis reumatoide es el halla zgo de beta2-microglobulina aumentada en el líquido sinovial.

Seminograma

El análisis del líquido seminal es fundamental par a una adecuada valoración andrológica.

En los últimos años ha habido grandes avances en el diagnóstico y el tratamiento de la infertilidad. Las causas de la infertilidad pueden ser físicas o emocionales. Apro ximadamente el 30 -40 % de todos los casos de infertilidad se deben a un factor «masculino», por lo cual es importante realizar un estudio específico para evaluar dicha infertilidad dentro del estudio global de infertilidad de la pareja. El semen es un líquido blanquecino que se expulsa por la uretra en la eyaculación. El eyaculado es el producto de la mezcla de secreciones procedentes del testículo, donde se producen los espermatozoides, junto con las secreciones de la próstata, de las vesículas seminales y de las glándulas bulbouretrales.

642

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MóduLo V

Análisis bioquímico

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Normalmente, cada centímetro cúbico de semen contiene millones de espermatozoides, pero la mayor parte del volumen se de be a las secreciones de las glándulas de los órganos reproductores masculinos (próstata y vesículas seminales, básicamente). El porcentaje de participación en las funcio nes de eyaculado se distribuye de la siguiente manera:

Vídeo 48-1. Pr eparación yestu dio de una muestra de sem en.

• Testículos y epidídimo: 5 %. • Vesículas seminales: 45 -80%. • Próstata y glándulas bulbouretrales y uretrales: 13-330/0. Un análisis seminal completo informa sobre las propiedades del semen en su con junto, tanto de la producción de espermatozoides como de la función de las glándulas sexuales accesorias. En un espermiograma clásico se utilizan ciertos indicadores para evaluar la calidad del semen: • Concentración de espermatozoides. • ' Movilidad, viabilidad y morfología de espermatozoides. • Características fisicoquímicas del semen: Color. Filancia. Volumen de eyaculado.

pH.

Para obtener un resultado indicativo es recomendable realizar al menos dos análisis semi nales, con un intervalo de no menos de 15 días ni más de 90, con una abstinencia sexual de 3 a 7 días.

• Análisis bioquímico: Fructosa. Cinc. Fosfatasa ácida. - Ácido cítrico. • Recuento de otras células (leucocitos, hematíes, células germinales). Los valores que se obtienen se comparan con los que indica la Organización Mundial de la Salud (OMS) en su Manual de Examen del Semen 5 a edición (2010), que establece unos criterios de normalidad para realizar una estandarización global. Se recomienda realizar un examen microscópico inicial tras la licuefacción, que se produce en menos de 20 minutos a temperatura ambiente. Se aconseja asimismo utilizar dos muestras de semen (Fig. 48-2). En este examen inicial microscópico se obtiene la concentración de espermatozoides, su motilidad y la existencia o no de aglutinaciones. También se puede observar la presencia de otras células (células del tracto uretral y células redondas, que son los leucocitos y células espermatogénicas). La valoración de la movilidad se ha de realizar en un microscopio de fase caliente. Para el recuento se puede usar un hematocitómetro o cualquier otra microcámara de recuento. Al menos se deberían contar cuatro campos diferentes de cada una de las dos muestras de semen y sacar la media de los dos recuentos. El recuento espermático total se calcula multiplicando el factor de dilución por su volumen. La movilidad se expresa como el porcentaje de espermatozoides móviles y su avance. En las muestras en las que no se observan espermatozoides, como en el caso de las que se realizan tras una vasectomía, se debe centrifugar la muestra y examinarla a continuación. La aglutinación de espermatozoides se observa cuando espermatozoides móviles se pegan unos a otros de diferentes maneras (cabeza con cabeza, cola con cola, etc.). La aglutinación sugiere un factor inmunológico y debe indicarse en el informe.

Figura 48-2. Observación microscó-

pica de semen. 643

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-,-

Capítulo 48

Estudio de otros líquidos y elementos corporales

.

Referencia

Límite inferior de referencia

Li cuefacción

Total a los 60 minutos

pH

?:-7,2

Volumen

1,5mL

Conce ntración espermática

15.000.000/mL

Concent ración tota l

39.000.000

Motilidad total (progresivos + no progres ivos )

40%

Motilidad progres iva Viabilidad Form as normales Leuco citos

El anális is de la morfolo gía de Los espermatozoides tiene gran import an cia en rela ción con la fertilidad.

< 1.000.000/ mL

El análisis de la morfología de los espermatozoides tiene importancia en relación con la fertili dad. Los espermatozoides morfológicamente anormales, por lo general, tienen varios defectos, y el promedio se denomina índice teratospérmico, que se trata de un factor pron óstico importante de la función del espermatozoide (Tabla 48-2). El examen bi oquí mico del líquido seminal se basa en la cuantificación de ciertos compon ent es que secretan las glándulas sexuales accesorias (vesículas seminales, prós tata y epidídim o) para verificar su funcionalidad. El líquido sem inal eyaculado consta de cuatro fracciones, que llegan a la uretra en ráp ida sucesión y que son emitidas en el siguiente orden:

• Fracción preeyaculatoria: supone el 10-15 % del volumen total. Es una secreción transpa rente que procede de las glándulas bulbouretrales y su fun ción es lubricar el canal uretral para que puedan vaciarse más fácilmente las otras fracciones. • Fracción previa: supone un 20 0/0 y corresponde a la secreción prostática. Contiene ácido cítrico y enzimas proteolíticas y sale acompañada de la tercera fracción. • Fracció n principal: supone el 5-100/0 y es la secreción de testículo epidídimo diferencial. Contiene a los espermatozoides. • Fracción final: es un 50-60 0/0 del volumen. Es una secreción coloide que pro cede de las vesículas seminales, que constituyen la fuente de fructosa del sem en, el principal nutriente de los espermatozoides. En el laboratorio se determinan los siguientes parámetros: • • • •

Fructosa. Ácido cítr ico. Cinc. Fosfatasa ácida .

La fructosa es un marcador de la funcionalidad de las vesículas seminales, mientras que el resto lo son de la funcionalidad prostática. El análisis bioquímico está indicado especialmente cuando el volumen eyaculado se encuentra por debajo de lo normal « 1,5mL), cuando existe una rápida disminución de la movil idad de los espermatozoides o cuando se quiere investigar el efecto de la medicación , tóxicos u otros factores sobre la función de las glándulas sexuales accesorias.

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•• •

Estas mediciones también deben indicarse en todos los pacientes azoospérmicos. En general, la disminución de la función secretora de di cha s glánd ulas se refleja en una disminución en el plasma sem inal del marcador específico. Además de las infecciones seminales, que son la causa má s com ún , otros trastornos qu e pueden afectar la capacidad secretora de las glándulas sexuales accesorias son las inflamaciones de cualquier etiología, así como las obstrucciones totales o parciales de las vías sem inales, gen eralmente secuelas de infe cciones o infl amaciones. Los tum ores y anomalías congén itas son causa muy rara de alteraciones fun cionales.

• ESTUDIO BIOauíMICO DE LíaUIDOS SEROSOS: LíaUIDOS PLEURALES, PERICÁRDICOS y PERITONEALES

Líquido pleural En condicione s fisioló gicas, el espaci o pleural contien e de 1 a 10 mL de fluido. Se considera patológico un volumen de líquido pleural que pueda ser detectado radiológicamente. El primer objetivo en el estudio del líquido pleural es diferenciar entre trasudado y exudado. Los criterios bioquímicos que permiten establecer la diferenciación entre trasudado y exudado son : • Cociente de la concentración medida de proteína y L-Iactato-deshidrogenasa en líquido pleural y suero (criterios de Light). • Cociente de la concentración medida de bilirrubina y colesterol en líquido pleural y suero. • Gradiente de albúmina, diferencia entre la medida de la concentración de albúmina en suero y líquido pleural (Tabla 48-3). • Si el derrame pleural es un trasudado, no son necesarios otros estudios bioquímicos. Si, por el contrario, el derrame pleural es un exudado, se debe investigar su etiología. Para ello se estudiarán las siguientes magnitudes: aspecto del líquido, concentración de eritrocitos y leucocitos, porcentaje diferencial de leucocito s, concentración de glucosa, actividad catalítica de a -amilasa y pH. El aspecto del líquido pleural es determinante. Se recomienda informar siem pre sobre el color y la turbidez de la muestra. Si el líquido es h emorrágico se debe realizar un hematocrito para descartar la existencia de un hemotórax. Si la pre sen cia de sangre se debe a una toracocentesis, el grado de coloración durante la aspiración no es uniforme y se observa un aclaramiento progresivo durante la obtención del líquido. La turbidez puede deberse a un aumento de la concentración celular o lipídica. El examen del sobrenadante tras la centrifugación permite su diferenciación. La determinación de la concentración de eritrocitos se puede realiz ar en una cámara hematocitométrica (de N eubauer, Burker o Thoma) o en un contador hema-

Trasudado

Si el derrame pLeural es un ex udado se debe estu diar el as pecto del líquido, concent ración de eritrocitos y leucoci tos, porcentaje diferencial de l eu cocitos, concentración de glucosa , ac tividad catalítica de a - a m ilasa y pH .

Exudado

>0,5

Proteínas líqu ido/ prote ínas suero

10 mU/L, mientras que cifras entre 5-10 mU/L sugieren hipotiroidismo subclínico. En el hipertiroidismo primario la TSH está inhibida por debajo del límite de sensibilidad de la técnica.

En ausen cia de enf er me dad hipotálamo-hip of isaria, la T5H es el marcador má s fi able de la fu nc ión ti roid ea.

Tetrayodotironina libre y triyodotironina libre La concentración de hormonas tiroideas totales hoy en día no es útil, porque su concentración depende de variaciones en las proteínas transportadoras y han sido sustituidas por la determinación de LT4 y LT3. Los niveles de hormonas libres son los que mejor expresan su disponibilidad para unirse a rec~ptores específicos. La LT4 es el parámetro de elección cuando la TSH está alterada o hay sospecha de hipertiroidismo a causa de trastornos hipotálamo-hipofisarios.

Tiroglobulina y calcitonina La tiroglobulina o antígeno coloide se sintetiza en las células foliculares y aumenta en trastornos como el bocio, el hipertiroidismo y el cáncer de tiroides. Es útil en el seguimiento del cáncer diferenciado de tiroides tras el tratamiento, donde el incre mento de tiroglobulina indica recidiva o metástasis. La calcitonina es el marcador tumoral de elección en el carcinoma medular de tiroides.

T5H

T en hipotiroidismo primario

J, en hipert iroidismo primario

Anticuerpos antitiroideos Se han descrito varios anticuerpos contra antígenos de la glándula tiroides , en par ticular:

• Anticuerpos antitiroglobulina. Su principal aplicación es el seguimiento del cán cer en el carcinoma indiferenciado de tiroides, porque el hallazgo en altas con centra ciones pu ede interferir dir ectament e con la determinación de tir oglobulina. • Anticuerpos antiperoxidasa (TPO). Actúan como agen te citotóxico en el proceso destructivo glandular, típico de enfermedades autoinmunes. Resultan positivos en la enfermedad de Graves, en la tiroi diti s de Hashimoto y en tra stornos extratiroideos autoinmunes. • Anticuerpos antirreceptor de TSH. Puede n estimular la función tiroidea y pro ducir hipertiroidismo, también inhibir la secreción, lo que causa hipotiroidismo. En la tabla 52 -3 se presentan los marcadores de enfermedades tiroideas.

ESTUDIO DE LAS HORMONAS SUPRARRENALES La glándula suprarrenal dispone de dos partes diferenciadas, una histológica y otra embriológica: la médula suprarrenal y la corteza suprarrenal.

T3 libre T4libre

¡ en hipertiroidismo

J, en hipotiroidismo Anticuerpos antitiroideos: • Ácido antitiroglobulina • Ácido anti-

T en patología tiroidea de origen autoinmune

TPO • Ácido anti-

T5H Calcitonina

i en carcinoma medular de tiroides

Tiroglobulina

T en bocio, hipertiroidismo y carcinoma medular de tiroides

TPO: Ac. an tiperox idasa ; T5 H: hor mona folicu loestimulante.

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Caracterización de las determinaciones de las hormonas

Capítulo 52

~

Figura 52-3. Estruc tu ra y secreción de la glándula suprarrenal.

Glándula suprarrenal

Corteza suprarrenal

Aldosterona (sistema renina-angiotensina)

Zona glomerular

Zona fasciculada

------. Zona reticular

Médula suprarrenal

Cortisol Andrógenos suprarrenales: - Androstendiona - Dihidrohepiandrosterona - Dihidrohepiandrosterona-S

Catecolaminas

Hormonas de la corteza suprarrenaL. Aldosterona, cortisol

y andrógenos suprarrenales La corteza suprarrenal aporta andrógenos en la mujer, mien tras que en e l hombre los a ndróg eno s se produ cen en los testículos.

Hiperaldosteronismo primario

t Aldosterona

Hiperaldosteronismo secundario

t Aldosterona

Síndrome de Cushing

t Cortisol en sangre que no suprime tras dexametasona

Feocromocitoma

t Catecolaminas ymetanefri nas en plasma yorina

y~ renina yrenina

La corteza está formada por tres zonas diferenciadas, que se definen como glome rular, fasciculada y reticular (Fig. 52-3). La aldosterona se produce exclusivamente en la zona glomerular y está controlada por el sistema renina -angiotensina. Las zonas fasciculada y reticular de la corteza suprarrenal producen cortisol y andrógenos suprarrenales (andr ostendiona, deshidroepiandrosterona [D H EA] y sulfato de DHEA). Los andrógenos suprarrenales ejercen su acción androgénica por conversión en testosterona en los tejidos periféricos. En las mujeres, la corteza suprarrenal es una fuente importante de andrógenos, mientras que en el hombre la fuente fundamental de producción androgénica se sitúa en el testículo. Las células de la corteza suprarrenal tienen receptores de lipoproteínas de baja den sidad (LD L) que les permiten captar el colesterol necesario para sintetizar las hormonas esteroideas suprarrenales. La función principal de la aldosterona es mantener el volumen sanguíneo circu lante. En la arteriola aferente renal se sintetiza la renina. Los estímulos que favorecen su sínte sis son la hiperten sión arterial, la depleción de volum en, el incremento de actividad simpática (cam bios posturales), la ingesta de sodio y la hipopotasemia. Su liberación es inhibida por la propia angiotensina y por el péptido natriurético auricular. La renina favorece la formación de angiotensina 1, que pasa a ser angiotensina 11 por acción de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) . La an giotensina 11 estimula la síntesis de aldo sterona. La aldosterona es el mineralocorticoide fundamental. Incr ementa la reabsorción de sodio y cloro en el riñón, con el aumento de la eliminación de pota sio e hidrógeno y retención de agua . La pa tología suprarrenal se detalla en la tabla 52-4. Aumentos en la secreción de aldos terona (hiperaldosteronismo primario con aldosterona alta y renina baja) pueden deberse a: • • • • •

Adenoma suprarrenal productor de aldosterona o síndrome de Conn. Hiperplasia suprarrenal. Carcinoma suprarrenal. Hiperaldosteronismo primario familiar. Adenoma extrasuprarrenal productor de aldosterona.

También puede haber hiperaldosteronismos secundarios (con aldosterona y renina altas) en situaciones con disminución del volumen circulante efectivo, como en el

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Análisis bioquímico

MóduloV

síndrome nefrótico, la insuficiencia cardíaca (no necesariamente asociadas a hipertensión arterial) o un tumor productor de renina. La clínica que produce el hiperaldosteronismo consiste en hipertensión arterial, hipopotasemia y alcalosis metabólica. Aumentos en la secreción de cortisol producen síndrome de Cushing, que puede deberse a:

La corteza adrenal si ntetiza cortisol en respuesta a la ACTH, al estrés y al ritmo diurno.

• Adenoma productor de cortisol, la causa más frecuente. • Carcinoma productor de cortisol. • Hiperplasia suprarrenal. También puede producirse un síndrome de Cushing por la administración exógena de glucocorticoides. Su clínica consiste en obesidad de distribución central, fragilidad capilar que ocasiona estrías en la piel y tendencia a los hematomas de fácil aparición, mayor riesgo de osteoporosis y fracturas vertebrales, diabetes mellitus e hipertensión arterial. Se diagnostica por un aumento del cortisol en sangre que no se suprime tras la administración de dexametasona la noche anterior, junto con un aumento del cortisol libre en orina de 24 horas. Disminuciones en la secreción de cortisol producen el síndrome de Adisson, que puede deberse a:

El déficit de secreción de cortisol produce el síndrome de Adisson.

• Patología autoinmune. • Destrucción de la glándula por infecciones (antiguamente, sobre todo por tuberculosis) o enfermedades infiltrativas.

Hormonas de la médula suprarrenal. Feocromocitoma La patología que puede presentar la médula suprarrenal consiste en la proliferación de un feocromocitoma, tumor que se origina de células del tejido cromafín, de origen neuroendocrino, situado fundamentalmente en la médula suprarrenal y productor de catecolaminas. El 25 % de los feocromocitomas son de origen hereditario y pueden formar parte del síndrome de neoplasia endocrina múltiple. Su clínica consiste en hipertensión arterial, aunque en el 500/0 de los casos no hay hipertensión arterial per manente, sino que aparecen crisis hipertensivas con cefaleas y sudoración profusa. Se diagnostica por un aumento de catecolaminas y metanefrinas (mayoritariamente) en plasma y orina. La muestra de orina debe ser de 24 horas y ha de emplearse un con servante ácido para su correcto procesamiento.

ESTUDIO DE LAS HORMONAS SEXUALES Las hormonas sexuales son las que sintetizan y segregan las glándulas sexuales, el ovario en la mujer (estrógenos y progesterona) yel testículo en el varón (testosterona). Todas ellas se sintetizan a partir del colesterol y están controladas por la hipófisis, que en el momento en que se alcanza la pubertad produce un incremento en la síntesis y liberación de gonadotropinas que, a su vez, estimula la producción de hormonas sexuales que desarrollan los aparatos genitales y los caracteres sexuales secundarios. En la edad adulta participan en el mantenimiento de los ciclos menstruales en la mujer y en la producción y maduración de los espermatozoides, en el hombre. A partir de una determinada edad, que oscila entre los 40 y los 60 años, se reduce la producción hormonal y cesan los ciclos menstruales en la mujer (menopausia) y la producción de testosterona en el hombre, aunque de forma menos brusca y marcada que en las mujeres.

La producción de hormonassexuales experimenta cambio s a lo largo del ciclo vital.

Función gonadal masculina Los testículos tienen dos funciones muy dist intas, una gametogénica y otra endocrina, ambas están reguladas por un mecanismo de retroacción en el que interviene

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Capítulo 52

Caracterización de las determinaciones de las hormonas

el hipotálamo a través de las GnRH y de la hipófisis anterior mediante la FSH y la LH. Constan de dos compartimentos: • Sistema de túbulos seminíferos , formados por las células germinales y de Sertoli, que estimuladas por la FSH producen y transportan los espermatozoides y sintetizan la inhibina B, que ejerce un papel inhibidor sobre la secreción hipofisaria de FSH. • Grupos de células intersticiales o de Leydig, que estimuladas por la LH producen los esteroides androgénicos, necesarios para el desarrollo y mantenimiento de los caracteres sexuales masculinos y la espermatogénesis. A su vez, inhiben la secreción hipofisaria de LH.

La función gonadal masculina puede evaluarse con el espe rmio grama .

La testosterona es el andrógeno más importante y en el hombre un 95 % es de producción testicular; el resto proviene de la conversión periférica de la androstendiona y la DHEA (hígado, piel y tejido adiposo). Un 97-99% circula unida a proteínas, un 400/0 a albúmina (con baja afinidad), un 400/0 a globulina enlazante de las hormonas sexuales (sex hormone bindigglobulin, SHBG) con alta afinidad y un 17% a otras proteínas. La testosterona libre es la más activa en el espacio celular, si bien la que está unida a la albúmina lo hace con baja afinidad pero también está disponible en los tejidos, de aquí el uso del término testosterona biodisponible, que refleja funcionalmente mejor la actividad de la testosterona. Las células de la mayoría de los tejidos sensibles a los andrógenos la transforman en dihidrotestosterona, que es la forma en que finalmente se une al receptor y pasa al núcleo celular. Se metaboliza en el hígado y se elimina por la orina. La testosterona libre es de difícil medición, y es un parámetro a veces poco fiable, sobre todo en concentraciones bajas, por lo que puede utilizarse en su lugar el índice and rogénico libre (IAL). IAL

=

testosterona X 100/SHBG

Función gonadal femenina Los estrógenos condicionan los caracteres sexuales femeninos y la progesterona los cambios del endometrio.

"---y------J~

Fase folicular

Fase lútea

.lA Figura 52-4. Ciclo de las hormonas sexuales femeninas. F5H: hormona Ioliculoestimulante; LH: hormona luteinizante.

El ovario tiene dos funciones bien definidas: mantener y liberar el ovocito en el tracto genital para la fertilización y secretar estradiol y progesterona. En la mujer en edad fértil los ciclos menstruales vienen marcados por un patrón de secreción de FSH y LH. En la primera fase del ciclo o fase folicular, hacia el final de la fase la LH sufre una gran elevación, cerca de la ovulación, mientras el pico de elevación de FSH se produce coincidiendo con el de la LH. Durante la segunda fase del ciclo, fase luteínica o lútea, las cantidades de FSH y LH son menores, con picos ocasionales de LH. En la figura 52-4 se representa el ciclo de las hormonas sexuales en la mujer. Durante la menopausia las gonadotropinas siguen secretándose en forma episódica, con niveles de FSH superiores. Los estrógenos son responsables de las características sexuales femeninas. El estradiol es el estrógeno más potente, que aumenta sus concentraciones durante la segunda mitad de la fase folicular, alcanza su pico máximo el día anterior al pico de la LH y luego disminuye. Durante la menopausia sus concentraciones se encuentran claramente disminuidas. La progesterona es responsable de los cambios que sufre el endometrio uterino, necesarios para la implantación y crecimiento del embrión. Sus concentraciones son bajas antes del pico de FSH y LH y luego se incrementan hasta alcanzar su máximo a mitad de la fase luteínica, cayendo progresivamente hasta la menstruación. La hormona antimulleriana se segrega en el ovario y representa el mejor marcador de la función ovárica. Se emplea en técnicas de reproducción asistida como predictor de la reserva ovárica y de probabilidad de embarazo. Puede utilizarse también para evaluar el daño ovárico tras el tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer. En las mujeres, la mayor parte de la testosterona deriva de la androstendiona. El aumento de andrógenos se conoce como hiperandrogenismo. La causa más frecuente en la

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MóduLo V

Análisis bioquímico

mujer es el síndrome de ovario poliquístico (SOP). Se detecta en mujeres en edad fértil, y se caracteriza por trastornos en la función ovárica que pueden ocasionar infertilidad, hirsutismo, acné, presencia de resistencia insulínica y aumento del riesgo cardiovascular.

Valoración hormonal

En el SOP aparece resistencia insulínica, aumento de testosterana y de DHEA S Y aumento de hormona antimulleriana.

La valoración bioquímica de las hormonas implicadas en la función gonadal, junto con las que pertenecen al eje hipotálamo-hipofisario y las pruebas de estimulación con GnRH, es fundamental para el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento de disfunciones endocrinas sexuales, así como de control de tratamientos paliativos de otras patologías (cáncer de próstata y de mama, procesos de fecundación in vitro, ete.). El interés clínico de su estimación se encuentra en las alteraciones por un exceso de producción: pubertad precoz, hirsutismo, acné, hiperestim ulación ovárica, ete. Por el contrario, también son de interés en un defecto de síntesis: infertilidad, pubertad tardía, alteraciones menstruales, hipogonadismos hipogonadotropo e hipergonadotropo (según si el fallo es hipofisario o gonadal), menopausia precoz, etcétera.

PRUEBAS DE EMBARAZO Y EVALUACiÓN DE LA FUNCiÓN PLACENTARIA El embarazo es un estado fisiológico durante el cual se producen cambios metabólicos y bioquímicos que afectan a la placenta, al feto y a la madre. La placenta es el tejido fetal que se diferencia porque produce hormonas esteroideas (estrógenos y progesterona) y peptídicas (gonadotrofina coriónica, lactógeno placentario). No obstante, es un órgano endocrino incompleto, ya que para esta función requiere los precursores que proceden del feto o de la madre. El feto y la placenta actúan como un sistema endocrino combinado que permite el desarrollo y el mantenimiento del embarazo. Ambos carecen de ciertas enzimas (sulfatasa y deshidrogenasa) necesarias para llevar a cabo determinados procesos metabólicos. La placenta necesita el colesterol procedente de la madre para la síntesis de progesterona, la DHEA S materna y fetal para el 17-p-estradiol y la 16-0H-DHEA S para la síntesis de estriol, así como precursores maternos para la síntesis de las hormonas peptídicas. La medición en sangre y orina de las hormonas y proteínas que sintetiza la placenta son útiles para el diagnóstico de embarazo, así como para la detección de posibles complicaciones (aborto, preeclampsia, etc.), Si bien actualmente los avances en métodos como la ecografía han reducido las magnitudes bioquímicas necesarias para evaluar la viabilidad fetal, otras siguen siendo útiles y se revisan a continuación.

La pLacenta produce hormonas esteroideas y peptídicas, aunque es u n órgano endocrino incompleto.

Gonadotrofina coriónica humana La glucoproteína gonadotrofina coriónica humana (hCG) tiene aproximadamente un peso molecular de 400.000 dalton y está compuesta por dos subunidades unidas de manera no covalente: a y p. La subunidad a es similar a las de sub unidades de FSH, LH y TSH, mientras que la subunidad p determina la especificidad biológica e inmunoquímica. Cuando el dímero se disocia, la hormona pierde su actividad y la sub unidad p es el factor limitante en la aparición de cadenas completas. Su semivida media es de 20 días. Las células trofoblásticas de la placenta sintetizan hCG y se detectan precozmente en el suero materno alrededor de las 24 horas posteriores a la implantación del óvulo, unos 6-8 días tras la concepción. Las concentraciones aumentan rápidamente, se duplican aproximadamente cada 2 días, hasta alcanzar un máximo a los 60-80 días, y este dato se utiliza como prueba precoz de embarazo. Sus principales funciones son el mantenimiento del cuerpo lúteo durante las pri meras 6-8 semanas del embarazo, hasta que la placenta es capaz de sintetizar suficientes esteroides (progesterona), y la promoción de la esteroidogénesis en la unidad fetoplacentaria, con el estímulo de la secreción de andrógenos en el tejido testicular fetal y también la actividad inmunosupresora.

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Caracterización de las determinaciones de las hormonas

Capítulo 52

Su medición en sangre y orina puede ser útil para distintas aproximaciones: • Diagnóstico de embarazo. Son suficientes los métodos cualitativos en la primera orina de la mañana entre los días 3 y 10 después de la ovulación. • Diagnóstico de embarazo ectópico o aborto. Son necesarias las mediciones seriadas para poder distinguir un estadio inicial de un embarazo normal de un embarazo ectópico o un aborto; en estos se mantienen de forma persistente concentraciones bajas de hCG. Tras un aborto o un embarazo ectópico se detecta durante alrededor de 9-35 días, hasta·que desaparece. • Diagnóstico y seguimiento de enfermedad trofoblástica gestacional u otros tumores productores de hCG. Se caracterizan por altas concentraciones de hCG, mayores a las que corresponderían a un embarazo normal, además de concentraciones apreciablemente bajas en lactógeno placentario.

Estrógenos El estado fetoplacentario se determina con las concentraciones de estrógenos.

En la gestación se produce un aumento progresivo de estradiol, estrona y estriol. El estrógeno más activo es 17 -~-estradiol; sin embargo, el estriol es el más abundante. Al comienzo del embarazo el cuerpo lúteo aporta la mayor parte de estrógenos, hasta que la placenta asume su producción, con la colaboración del feto y la madre, quienes suministran los precursores (DHEA S y 16-0H-DHEA S). La mediciones de estrógenos en sangre y orina maternas pueden utilizarse como indicadores del estado de la unidad fetoplacentaria, si bien, debido a su amplia variabilidad interindividual, deben realizarse estimaciones seriadas para ver su evolución.

Progesterona La progesterona es una hormona esteroidea producida por el cuerpo lúteo hasta la sexta semana, momento en que la unidad fetoplacentaria se convierte en la principal fuente y sus concentraciones aumentan. Para ello, es necesaria la disponibilidad de colesterol procedente de la madre como precursor. La progesterona es indispensable para que el embarazo 'se desarrolle satisfactoriamente. La detección de concentraciones bajas durante las primeras 10 semanas de gestación puede indicar una alta probabilidad de aborto o embarazo ectópico.

Lactógeno placentario El lactógeno placentario es una hormona peptídica que se produce en las células del sincitiotrofoblasto de la placenta. Presenta homología con la hormona del crecimiento y la prolactina, y su producción es directamente proporcional al tamaño de la placenta. En embarazos sin complicaciones alcanza un valor máximo entre las 34-38 semanas. Es un indicador de la función fetoplacentaria, pues no presenta fluctuaciones circadianas y su semivida es corta, de unos 15 minutos, pero no parece proporcionar más información clínica que la concentracióin de estriol. Su medición en sangre materna asociada a la de hCG puede utilizarse para el diagnóstico de tumores trofoblásticos (mola hidatiforme y coriocarcinorna), en los que su concentración disminuye mientras que la hCG aumenta.

Marcadores angiogénicos: factor de crecimiento placentario (PIGF) y forma soluble del receptor de la tirosinacinasa (sFlt-1) La placenta también parece estar relacionada en la preeclampsia, una de las complicaciones más terribles del embarazo. Se caracteriza por una insuficiencia placentaria debido a una reducción de la perfusión uteroplacentaria. Aunque la causa exacta se desconoce, se piensa que ante la situación de hipoxia, la placenta, por un lado, libera a la circulación materna un excesode factor antiangiogénico (sFlt-1) y, por otro, pocos factores angiogénicos (PIGF). Se postula que este desequilibrio entre los factores reguladores de la angiogé-

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Análi ~is bioquímico

Módulo V

nesis liberados desde la placenta es el mecanismo que ocasiona el daño vascular materno, por eso es posible que la medición del índice sFlt-l/PIGF sea de ayuda para el cribado, el diagnóstico y la predicción de complicaciones en la preeclampsia.

No debo olvidar que... •

las hormonas se cuantifican en la actualidad por métodos que se basan em~\ tecnología de inmunoanálisis, sobre todo en los de última generación, inmunoanálisis muy sensibles como la quimioluminiscencia.

•

Pueden producirse síndromes endocrinos clínicos por deficiencia hormonal, por producción excesiva o por resistencia a la hormona.

•

los prolactinomas son los tumores más frecuentes en la hipófisis.

•

la hormona tirotropa es el más sensible marcador bioquímico de función tiroidea, en ausencia de enfermedad hipotalámica o hipofisaria. En la actualidad se determina por inmunoanálisis de tercera generación, con un límite de detección de 0,1 mU/l. la concentración de hormonas tiroideas totales no es útil y se ha sustituido por las mediciones de lT4 y lT3.

•

En la corteza suprarrenal se produce aldosterona (su aumento puede deberse a un hiperaldosteronismo primario), cortisol (su incremento puede ser a causa de un síndrome de Cushing y su disminución a un síndrome de Adissonl y andrógenos suprarrenales.

•

la causa más frecuente de hiperandrogenismo en la mujer es el síndrome de ovario poliquístico.

•

la función gonadal masculina puede evaluarse con la realización de un espermiograma.

•

la función gonadal femenina puede evaluarse con la determinación de hormonas foliculoestimulantes, luteinizantes y estradiol.

Preguntas de repaso

Caso práctico

1. ¿CuáL de estas hormonas no segrega La hipófisis?: a. b. c. d.

T5H. ACTH.

GH. TRH.

2. ¿CuáL de estas determinaciones no se utiliza ya en La actualidad para eLdiagnóstico de hipotiroidismo?: a. T5H. b. Anticuerpos antirreceptor de T5H.

c. LT4. d. T4 total.

Un hombre de 56 años acude a su médico de familia porque durante el último año sufre crisis de cefaleas con sudoración profusa, acompañada de palpitaciones y nerviosismo. Coincidiendo con la visita al médico vuelve a tener otra crisis similar, durante la cual se determina una tensión arterial de 190/100, con una frecuencia cardíaca de 110 pulsaciones por minuto y gran sudoración. Entre los antecedentes familiares de interés, explica que su padre falleció a los 59 años de un accidente cerebrovascular, causado por una crisis de hipertensión arterial. Tiene dos hermanos sin patología conocida ni episodios de hipertensión arterial. • Cuestión 1. ¿Qué prueba analítica fundamental se debe realizar al paciente? • Cuestión 2. Respecto a la determinación en orina de 24 horas, ¿qué consideraciones habría que tener en cuenta? Cuestión 3. ¿Conviene recomendar algún estudio clínico familiar?

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Capítulo 52

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Caracterización de las determinaciones de las hormonas

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I dice e e ntenidos

• Int roducció n • Fisiopatología del cáncer • Determinación y utilidad clínica de los ma rcadores tumorales

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INTRODUCCiÓN El cáncer es una enfermedad genética provocada por alteración en la expresión de los genes de la célula de forma acumulativa y secuencial; las células que se transforman crecen sin control y tienen la capacidad de invadir y provocar metástasis. Hoy en día, el cáncer es una de las principales causas de muerte en Europa. En España, según datos estadísticos de 2012, en mujeres los tumores más frecuentes son el cáncer de mama, colorrectal y de pulmón. En hombres, los de mayor prevalencia son el cáncer de próstata y también el cáncer colorrectal y de pulmón.

• • • • •

Cáncer Carcinogénesis Marcadores Especificidad Sensibilidad

FISIOPATOLOGíA DEL CÁNCER Carcinogénesis La capacidad de un agente de producir una neoplasia se denomina carcinogénesis. El término neoplasia implica un crecimiento celular descontrolado, que clínicamente puede ser benigno o maligno. El término tumor describe lesiones ocupantes de espacio, sean o no neoplasias. No obstante, el término cáncer se utiliza generalmente para definir neoplasias malignas. El cáncer comienza en una célula, es decir, que es de origen monoclonal. Esa célula alterada escapa a los controles y se vuelve anárquica, e inicia la proliferación de más «células anárquicas», que a su vez pueden inducir a cambios similares en las células vecmas, El cáncer se debe a la acción de agentes externos que alteran los genes, así como a fallos en los procesos celulares intrínsecos. Los agentes carcinógenos son responsables de mutaciones en protooncogenes (genes que participan en el crecimiento normal de las células), en genes supresores y genes reparadores del ácido desoxirribonucleico (ADN). En la actualidad, se acepta que el proceso de carcinogénesis consta de tres etapas sucesivas: iniciación, promoción y progresión tumoral:

El cáncer es un crecimiento anormal de un grupo de células, que altera la estructura celular y posee capacidad de invadir y provocar metástasis .

• Iniciación. Se produce una alteración del genoma de la célula. En esta fase, el carcinógeno se une de forma irreversible al ADN y provoca una mutación que lleva a la activación de un oncogén o a la inactivación de un gen supresor. Ello origina resistencia a la apoptosis o menor sensibilidad a los factores inhibidores del crecimiento. El proceso es irreversible y guarda memoria; parece que depende de la dosis recibida de carcinógeno, aunque no se ha podido establecer un umbral y en algunas ocasiones aparece espontáneamente. • Promoción. Es la expansión reversible de la población clonal de la célula iniciada. A diferencia de la fase de iniciación, es reversible, presenta dosis umbral y respuesta máxima. No necesariamente requiere la previa exposición a un agente carcinogénico, pero sí a un segundo agente, denominado promotor, que puede ser 705

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.Capitulo 53

La carcinogénesis es un proceso que consta de tres etapas: iniciación, promoción y progresión.

Caracterización de las determinaciones de los marcadores tumorales

específico de un determinado tejido orgánico. No se conoce bien el mecanismo de acción de los agentes promotores, pero parece que no actúan directamente sobre el ADN, sino por su unión a receptores de membrana (acción epigenética). • Progresión. En esta etapa las células malignizadas de manera irreversible acumulan nuevas mutaciones, lo que les proporciona una actividad más agresiva, que propicia la invasión, la capacidad metastásica y la resistencia farmacológica. Esta fase se atr ibuye a la acción de los carcinógenos y a la inestabilidad cariotípica.

Causas de cáncer Existen estudios que demuestran que la mayor parte de los cánceres humanos (70900/0) guardan relación con 'factores exógenos o ambientales previsibles. A los agentes externos se les denomina factores de riesgo o agentes carcinógenos. A continuación se an alizan las principales causas conocidas de cáncer, que pueden ser exógenas (tabaco, alcohol, dieta, factores ocupacionales, contaminación ambiental, radiaciones, fármacos, virus y bacterias) y endógenas (factores genéticos) (Tabla 53-1 ). La mayor parte de los cánceres humanos guardan relación con factores externos o ambientales.

• Tabaco: es el factor exógeno de riesgo de cáncer más importante y la primera causa aislada de mortalidad y morbilidad evitable. El consumo de tabaco es la causa del 90 % de los casos de cáncer de pulmón, incrementa el riesgo de cáncer de la cavidad oral, laringe, faringe, esófago, estómago, páncreas, riñón, vejiga, cuello uterino y leucemias. El riesgo de cáncer relacionado con el tabaco varía en función

Cáncerrelacionado

Agente Tabaco

Factor exógeno más importante

Causa el 90% de los cánceres de pulmón

ALco hoL

Implicado en el 3% de muertes por cáncer

Cavidad oral, faringe, laringe, hígado, esófago

Dieta

Por acción de carcinógenos naturales, contaminantes, etc.

Factores ocupacionaLes

El 5% de los tumores se produce por exposición a cancerígenos del medio laboral

Asbesto: se asocia cáncer de pulmón, mesotelioma pleural y peritoneal

Contaminación .ambientaL

Contaminación industrial, carburantes, radón y humo de tabaco

Relac ionado con el 2% de tumores y el 10 % de cáncer de pulmón

Radiaciones ionizantes

Lesiones en el ácido desoxirribonucleico

Cáncer de piel

Fármacos

Estrógenos, citostáticos, in m unosu presores

Leucemias, linfornas, tumores hepáticos

Virus

Papilomavirus, virus de las hepatitis B y C, virus de Epstein-Barr

l.eucernias. linfomas, cáncer de cuello de útero, hepatocarcinomas

Bacterias

Helicobacterpyiori

Cáncer gástrico

Factores genéticos

Susceptibilidad familiar

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MóduLo V

Análisis bioquímico

•

•

•

•

•

•

•

de la cantidad y el tiempo de exposición, la edad de inicio del hábito de fumar, el grado o la profundidad de inhalación, el tipo de tabaco, la forma de fumar, el contenido de alquitrán y nicotina del tabaco o el uso de filtro en los cigarrillos. Alcohol: está implicado en un 3% de las muertes por cáncer en los países desarrollados. Presenta un efecto irritativo directo y también puede ejercer como cocarcinógeno su metabolito, el acetaldehído. Presenta un riesgo sinérgico con el tabaco, que se estima en un incremento del riesgo en 35 veces. Las neoplasias que se asocian son el cáncer de la cavidad oral, faringe, laringe, hígado y esófago. Dieta: intervienen factores dietéticos a través de distintos mecanismos como, por ejemplo, la acción de carcinógenos naturales, contaminantes o productos del cocinado o la conservación de alimentos. Factores ocupacionales: se estima que el 5% de los tumores malignos se producen por exposición a productos cancerígenos en el medio laboral. La mayoría se diagnostican en varones (relación 7: 1) y tienen características comunes, como la-aparición a edades tempranas, la especificidad de los órganos, la aparición tras exposiciones prolongadas y repetidas y un tiempo de latencia largo. El asbesto es uno de los tóxicos más estudiados, que se asocia al cáncer de pulmón, el mesotelioma pleural y el peritoneal. Contaminación ambiental: la contaminación industrial, los carburantes, la contaminación de interiores secundaria al radón yal humo de tabaco guardan relación con el 2 % de los cánceres en general y ellO % de los cánceres pulmonares. Radiaciones: se consideran ionizantes cuando poseen la capacidad de liberar suficiente energía para romper los enlaces químicos fuertes biológicamente estables. La radiación ejerce su efecto sobre las dianas biológicas, de forma directa al ionizar el punto diana o indirecta al interactuar con otras moléculas, como el agua, y formar radicales libres. Estas acciones provocan lesiones en el ADN. Otro tipo de radiación es la de los campos electromagnéticos (electrodomésticos y teléfonos móviles) , que tienen muy baja frecuencia y poca capacidad de ionización. Las radiaciones ultravioleta (UV) forman parte del espectro electromagnético con escaso poder ionizante, por su baja energía. El efecto cancerígeno de los rayos UV está ligado a la longitud de onda. La exposición a la radiación UV y el tipo de piel son los dos factores principales que propician el desarrollo de cáncer de piel. El efecto carcinogénico es directo, iniciador y promotor. Fármacos: el consumo de fármacos se estima responsable en un 1-20/0 del desarrollo de tumores malignos. La exposición prolongada a estrógenos se asocia a tumores hepáticos, de mama y de endometrio. Los citostáticos tienen capacidad mutagénica, teratogénica y carcinogénica. El etopósido y los agentes alquilantes se han relacionado con leucemias mieloides en adultos y leucemias linfoides en niños. Los inmunosupresores, como la ciclosporina y la azatioprina, se han relacionado con linfomas, sarcoma de Kaposi y tumores cutáneos, entre otros procesos cancerígenos. Virus: se les atribuye el 5-10 % de los cánceres, porque actúan como agentes externos con capacidad para alterar los genes. Los virus tienen alta capacidad para infectar las células y pueden seguir infectando durante largos períodos. De las seis familias de virus ADN, cinco poseen capacidad de transformación maligna; de las 13 familias de virus ARN, sólo la familia Retroviridaetiene capacidad carcinogénica demostrada. El virus linfotrópico T humano tipo 1 (HTLV-1) se ha relacionado como causa directa de cáncer, y puede producir leucemias y linfomas tipo T en adultos. El papilomavirus (HPV) se relaciona con lesiones anogenitales. Las cepas HPV-16 y HPV-18 son responsables del 700/0 de los tumores de cuello de útero. Recientemente se han desarrollado vacunas para prevenir el cáncer de cérvix provocado por HPV Dentro de los herpes virus, el de virus de Epstein-Barr (VEB) se encuentra implicado en la patogenia dellinfoma de Burkitt y del carcinoma indiferenciado de nasofaringe, entre otros. En la fam ilia de los hepadnavirus destaca el virus de la hepatitis B (VHB), que es hepatotrópico de ADN y está muy relacionado con el desarrollo de neoplasias hepáticas. El virus de la hepatitis C (VHC)

Las lesiones en el ADN por radioaciones, ¿con qué tipo de tumor se relaciona?

La radiación uLtravioLeta B [UVB), en especial, induce la malignización puesto que produce modificaciones del ADN.

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Capítulo 53

La hepatitis B crónica se asocia al desarrollo de hepatocarcinoma; en estos procesos se produce una integración clonal del ADN vírico al genoma del huésped.

Las pruebas genéticas no detectan enfermedades, pero sí identifican mutaciones que aumentan el riesgo del posterior desarrollo de la enfermedad.

Caracterización de las determinaciones de los marcadores tumorales

pertenece a la familia Flaviviridae. Se replica principalmente en los hepatocitos del hígado y causa la hepatitis C, aunque hay controversia acerca de si este virus se puede replicar también en linfocitos o monocitos. Cada año se infectan con el VHC entre 3 y 4 millones de personas en todo el mundo. Entre el 75 y el 800/0 de los infectados contraen una enfermedad crónica. Parece claro que en un 250/0 de los enfermos de cáncer del hígado la causa fundamental determinada es la hepatitis C. • Bacterias: Helicobacter pylori es un bacilo gramnegativo que coloniza el estómago, lugar en el que es uno de los patógenos más frecuentes. El riesgo de padecer cáncer gástrico en individuos infectados guarda relación con la cepa que posee el gen que codifica la proteína cagA. H pylori se encuentra en el 80 -100 % de las personas con linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa MALT del estómago. • Factores genéticos: el proceso de formación de un tumor consiste en la acumulación de múltiples alteraciones en el genoma de las células que lo forman, razón por la cual el cáncer también puede ser considerado una enfermedad genética. Si una célula sigue el proceso de una cantidad de mutaciones previas antes de llegar a la transformación maligna, esas mutaciones se transmitirán a las células hijas descendientes durante la mitosis. Una célula mutada tiene mayor capacidad de proliferar que las células normales, y así escapa al control normal de crecimiento, lo que contribuye a una mayor posibilidad de que aparezcan nuevas alteraciones en el material genético. Hay pocos tumores con alteraciones constantes, como ciertos procesos linfoproliferativos y leucemias con translocaciones específicas (t(14; 18) de los !infomas; t(11;14) de los linfomas del manto; t(9;22) de leucemia mieloide crónica). La susceptibilidad familiar se produce cuando uno de los progenitores transmite una mutación genética asociada al cáncer, es decir, un cambio en la secuencia de ADN. La genética molecular ha permitido identificar y secuenciar algunos genes cuyas mutaciones predisponen a los portadores al cáncer o a síndromes familiares. Cuando se identifica a un individuo portador, se le debe remitir a la unidad de consejo genético para evaluar el riesgo de aparición de tumores y para asesorarle en las distintas opciones de manejo para reducir sus riesgos o para detectar el posible cáncer de manera precoz .

• DETERMINACiÓN Y UTILIDAD CLíNICA DE LOS MARCADORES TUMORALES Clasificación de los marcadores tumorales Se definen como marcadores tumorales a un amplio espectro de moléculas, muy variables, como enzimas, hormonas, antígenos oncofetales, etc., producidas o inducidas por la célula neoplásica y cuya presencia puede ser detectada en sangre u otros líquidos biológicos. Esta definición no indica que los marcadores tumorales sean específicos de cáncer, ya que la mayoría de ellos los sintetizan y liberan también las células sanas; además, diversas patologías benignas que afectan a tejidos productores de marcadores tumorales pueden provocar asimismo incrementos séricos de estos marcadores, lo que da lugar a falsos positivos. Una de las labores más prometedoras que se han desarrollado con los marcadores tumorales es la de su empleo en la monitorización del curso de la enfermedad neoplásica. Generalmente, existe una relación directa entre los valores del marcador y la extensión de la enfermedad, lo que les confiere utilidad, no sólo en la determinación del estadio patológico, sino con respecto a la validez del pronóstico. Al hablar de marcadores tumorales es importante conocer los dos conceptos principales: • Sensibilidad: capacidad de la prueba para detectar la enfermedad en sujetos enfermos. • Especificidad: capacidad de la prueba para detectar la ausencia de la enfermedad en sujetos sanos.

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• Marcadores tumorales de alta sensibilidad y alta especificidad: son aquellos que, a pesar de que pueden ser detectados en diversas situaciones fisiológicas, en ausencia de éstas o ante incrementos apreciables, indican siempre la existencia de un tumor maligno. Se incluyen dentro de este grupo la subunidad beta de la gona dotropina coriónica ( ~- H CG) y la calcitonina. • Marcadores tumorales de especificidad y sensibilidad variable: se caracterizan por sensibilidad y especificidad bajas en los estadios iniciales. Por el contrario, en los estadios avanzados las concentraciones séricas de estos marcadores permiten asegurar que se trata de un tumor maligno. Dentro de este grupo se pueden incluir la mayoría de los marcadores: antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno prostático específico (PSA), antígenos carbohidratados CA125, CA15.3, CA19.9, etcétera. • Marcadores tumorales con sensibilidad variable y baja especificidad: presentan una sensibilidad variable que depende del estadio, aunque su especificidad es baja, incluso en las fases avanzadas de la enfermedad. Se aplica principalmente en el pronóstico y la monitorización terapéutica.

La ut ilidad de un marcador en la clí ni ca dep end e de su grado de espec ific idad y sens ibil idad.

Estrategias para mejorar el uso de los marcadores tumorales La inespecificidad de los marcadores tumorales, con respecto a su origen, plantea el problema de discriminar el origen tumoral benigno o maligno ante la verificación de un incremento en el marcador. Se dispone de cuatro criterios que ayudan a distinguir y valorar correctamente los resultados de los marcadores (Tabla 53 -2 ): • Concentración sérica del marcador tumoral: en la mayoría de ellos suele ser moderada, en ausencia de neoplasia. Cuanto mayor es la concentración de un marcador que se detecta en un paciente, mayores son las probabilidades de que se trate de un tumor maligno. • Descarte de una patología benigna: ante un incremento de un marcador tumoral es necesario descartar la existencia de determinadas patologías benignas, que pue den incrementarlo, como las alteraciones en los tejidos productores o en el catabolismo. La mayoría de los marcadores tumorales se catabolizan en el hígado y se excretan por vía renal. Algunas alteraciones en estos órganos provocan un menor catabolismo ylo la eliminación de los catabolitos, e indirectamente provocan su acumulación, que resulta en cifras mayores al intervalo que se con sidera normal. La mayor parte de los marcadores tumorales sufre incrementos moderados (de 2 a 4 veces el límite superior de la normalidad) en los pacientes con cirrosis hepática o insuficiencia renal: CEA, CA125, ProGRl?, CYFRA 21 -1, etc. En pacientes con insuficiencia renal algunos marcadores tumorales pueden alcanzar concentraciones séricas similares a las que se hallan en patologías neoplásicas, por lo que no resultan útiles en estos enfermos, como el que se asocia al carcinoma de células escamosas (SC C), el 5-100 o el de ovario (mediante la proteína 4 del epidídimo humano [H E4]). Las alteraciones en los tejidos productores de un determinado marcador también pueden provocar incrementos, habitualmente moderados, como el PSA en las prostatitis o en la hipertrofia benigna de próstata, y el CEA en la colitis ulcerosa o en la enfermedad de Crohn. • Estudio secuencial del marcador tumoral: el hallazgo de altas concentraciones de cualquier marcador, de forma aislada, tiene un valor limitado. Cuando existen dudas sobre un resultado, deben realizarse dos o tres determinaciones seriadas con un intervalo de tiempo superior al de su vida media plasmática (15-20 días, en la mayoría de los marcadores tumorales). Si las cifras del marcador tienen un incre mento continuo (superior al coeficiente de variación interensayo) a lo largo del tiempo (por encima del nivel normal), se puede afirmar que, con gran probabilidad, es de origen tumoral, ya que indican el crecimiento del tumor. Por el contrario, si las concentraciones séricas no se modifican o se aprecia una tendencia al decremento, el origen hay que buscarlo en otra patología no neoplásica. En la

Por sí solo, un valor aislado de un marcador tumoral no tiene significación clínica.

Concentraciones séricas de marcador tumoral

A>concentración > posibilidad de tumor

Descartar la patología benigna

Pacientes con insuficienc ia renalo hepática

Estudio secuencial del marcador tumoral

Determinaciones seriadas

Interferencias técnicas

Falta de especificidad del anticuerpo

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Caracterización de las determinaciones de los marcadores tumorales

Capítulo 53

figura 53-1 se muestra la evolución un paciente con resultados anormales de CEA, cuyo control en el tiempo permite distinguir claramente la recidiva tumoral, con valores crecientes indicativos de proliferación tumoral. • Interferencias técnicas: pueden deberse a distintas razones, como a la falta de especificidad del anticuerpo, a las reacciones cruzadas con otras moléculas o a la presencia de anticuerpos heterófilos. Además, hay que considerar que no son comparables los resultados de un marcador tumoral si han sido obtenidos mediante distintos métodos analíticos. A Figura 53-1. Niveles séricos de antígeno carcinoembrionario (CEA) en una paciente con recidiva hepática por cáncer de colon.

Marcador

Normal

Principales marcadores tumorales: determinación y utilidad clínica Los principales marcadores tumorales que se emplean en la actualidad se resumen en la tabla 53-3 :

Falsos positivos

Indicaciones

Aplicaciones clínicas

AFP



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Lupus eritematoso sistémico

96%

Lupus inducido por fármacos

100%

Esclerodermia

97%

Síndrome de Sjoqren

90%

Polimiositis/ dermatomiositis

78%

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Detección de a'nticuerpos <

t;

-

- Títulos < 1/40 (S UI /mL): negativos. - Valores comprendidos entre 1/40 Y 1/160 son: positivos débiles sin repercusión clínica en el caso de que no existan síntomas. Se recomienda el seguimiento de los pacientes con títulos 1/80-1 /160. Valores > 1/160 (20 UI /mL): positivos. • Su detección es poco útil si el paciente no presenta síntomas (fiebre, fatiga, aumento de la velocidad de sedimentación globular, aumento de la proteína e reactiva o signos indicativos de EAI (exantema, eritema, fotosensibilidad, artritis, mialgias, xeroftalmia, úlceras orales, xerostomía, pleuritis, pericarditis, psicosis, proteinuria, anemia hemolítica, púrpura, trombocitopenia, leucopenia, etc. ). • En ausencia de datos clínicos que sugieran EAI y con ANA negativos no procede realizar dsADN ni ENA. La baja frecuencia de ENA y/o dsADN positivos con ANA negativos en pacientes con sintomatología justifica el hecho de no pasar al segundo nivel diagnóstico en el laboratorio, salvo si existe sospecha de EAI inc luso con ANA negativos y posibles patrones citoplasmáticos (p. ej., síndrome de Sjogren [SS]con anti-Ro positivos; algunos casos de anti-]o l positivos, etc.), • No todos los ANA que se identifican aportan un verdadero significado diagnóstico. • La frecuencia de aparición de los ANA depende de la técnica que se emplea para su detección. • La variación en el título de ANA por inmunofluorescencia indirecta tiene poca correlación con la evolución de la enfermedad, salvo en el caso de anticuerpos antipeNA y anticuerpos anticromatina (con patrón homogéneo nuclear), en los cuales la disminución o el aumento del título se asocia a la eficacia del tratamiento. • El análisis de los ANA es un método de escrutinio muy sensible en los pacientes con EAI sistémicas (Tabla 59-1 ). • Existe una alta prevalencia de ANA en personas sanas, sobre todo en mujeres, que se incrementa fuertemente con la edad, aunque habitualmente con títulos bajos . Lógicamente, esta prevalencia depende de cuál es la dilución que fija el límite de detección. Así, estudios recientes observan una prevalencia del 32 % en personas sanas con ANA positivo a títulos de 1/40, mientras que a 1/160 la prevalencia cae hasta el So/o. • En la imagen de fluorescencia por inmunofluorescencia indirecta se pueden observar diferentes patrones (Fig. 59-2), aunque éstos pueden darse simultáneamente en un mismo individuo y los patrones son diagnósticos de un tipo específico de ANA: Periférico: fluorescencia alrededor del núcleo. Sugiere anticuerpos anti-ADN. Homogéneo: reconocen moléculas ADN-histonas. Moteado: sugiere anticuerpos frente a proteínas extraíbles del núcleo (ENA). Nucleolar: suele asociarse a anticuerpos frente a ARN nucleolar.

Anticuerpos antihistonas Estos anticuerpos son típicos del lupus eritematoso sistémico (LES), donde se detectan en un SO 0/0, así como del LES inducido por fármacos (95%), en el que radica su utilidad clínica, tanto en su diagnóstico como en su seguimiento. No obs tante, muestran una gran variabilidad y se localizan también en enfermedades sistém icas (algunas artritis reumatoides, esclerosis sistém icas y determinadas infecciones).

Anticuerpos anti-ADN Existen dos tipos de anticuerpos frente a ADN: • Los que reaccionan con el ADN de cadena sencilla (ssADN), frecuente en LES, artritis reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, hepatitis crónicas, etcétera. 810

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Módulo VI

Técnicas de inmunodiagnóstico ~

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~ Figura 59-2. Ejemplo s de patrones por inmunofluorescencia indirecta de anticuerpos antinucleares [ANA].

Homogéneo

Centriolar

Moteado

Nuclear dots

Centrámero

Nucleolar

• Los que reaccionan con elADN nativo (dsADN) . Éstos reaccionan con más intensidad y son más específicos del LES.

Anticuerpos anti-ENA Los antígenos que pueden extraerse del núcleo bajo condiciones fisiológicas, como se ha dicho, se denominan ENA. Los más relevantes son:

• Ro/SSA: su prevalencia puede llegar hasta un 10% en las personas sanas. En el síndrome de Sjogren es de un 70-90% y su presencia se asocia a un curso grave de la enfermedad. Está presente en: Un 40-60% de LES, un 70-90% de lup us cutáneo y más del 90% de lupus neonatal. Un 15-20% de esclerosis sistémica progresiva, 10% de artritis reumatoide. Puede aparecer en el síndrome de solapamiento de polimiositis con dermatomiositis y síndrome seco o de Sjogren.

• La/SSB: normalmente está acompañado de anticuerpos anti-Ro/SSA. Se detecta en: Un 85-90% en el síndrome de Sjogren primario y 50-600/0 en el secundario. Muy específico de enfermedad, se asocia con manifestaciones extraglandulares, como púrpura y leucopenia. Un 10-15 % de LES y se asocia con menor prevalencia de enfermedad renal. Un 25-30% de LES cutáneos, en los que puede observarse junto a Ro/SSA.

Clínicamente existe una relación directa entre la presencia de anticuerpos anti-AON nativo y la actividad clínica del LES, de forma que las recaídas suelen ir preced idas de u n a u mento de las concentraciones de estos anticuerpos.

• Sm: se detectan en el 300/0 de LES. Son muy específicos y su presencia se considera criterio diagnóstico. No se asocia con actividad de la enfermedad. Este anticuerpo puede aparecer acompañado de anticuerpos anti-RNB a veces por contaminación en la preparación. 811

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• RNP: si se detectan anticuerpos anti-RNP (U1RNP) y la fracción 70 (la molécula RNP se compone de tres proteínas/fracciones: 70, a y e) y a altas concentraciones, identifica a pacientes con enfermedad mixta del tejido conjuntivo (MCTD). Clínicamente, estos pacientes tienen un curso más leve de la enfermedad con una baja incidencia de nefritis. Está presente en: - 30-40% de LES (sólo se detecta U1RNI?, pero no anticuerpos frente a RNP70) y se relaciona con el fenómeno de Raynaud y/o con la enfermedad pulmonar in tersticial, pero no con glomerulonefritis. Puede aparecer, aunque es poco frecuente, en la artritis reumatoide, el síndrome de Sjogren, la esclerodermia y polimiositis o dermatomiositis.

• Scl-70 (anticuerpo antitopoisomerasa I): es el marcador de la esclerodermia (20700/0). Está presente en: - El 20-50% de esclerodermia difusa. - Tan sólo en un 15 % de la forma localizada. Su presencia es indicativa del curso de la enfermedad y no está presente ni en el síndrome CREST (esclerosis sistémica cutánea limitada) ni en el solapamiento de polimiositis con esclerodermia.

• tRNA-sintetasa: son específicos de la polimiositis/dermatomiositis, aunque tienen el inconveniente de su baja sensibilidad. De ellos cabe destacar los anti-Jo 1, presentes en un 20-30% de los casos de poliomisitis. Todos estos pacientes poseen una clínica característica denominada síndrome antisintetasa. Hay que resaltar que hasta un 45 % de estos anticuerpos son negativos por inmunofluorescencia (se identifican como un patrón citoplasmático), por lo que pueden pasar desapercibidos en el protocolo analítico.

Casi todos los pacientes con anticentrámero presentan el fenó-

meno de Raynaud.

Anticuerpos anticentrómero Estos anticuerpos se "dirigen contra proteínas involucradas directamente en la unión ADN celular al huso mitótico durante la división celular. Presentan un patrón característico por inmunofluorescencia y se detectan en el 57-96 % de pacientes con esclerodermia cutánea limitada, fundamentalmente en el síndrome CREST, con menos frecuencia en la esclerodermia difusa (8-20%) . Se han detectado también en el síndrome de Sjogren, la cirrosis biliar primaria y la artritis reumatoide.

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¿Cuál es el principal inconveniente de la inmunofluorescencia indirecta?

DETERMINACiÓN DE AUTOANTICUERPOS POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Albert H. Coons, en 1941, describió la técnica basada en la fijación de fluoresceína sobre un anticuerpo específico que permitía descubrir este último en una mezcla anticuerpo-antígeno, mediante el examen al microscopio con radiación ultravioleta. Desde entonces hasta la actualidad se ha diversificado la oferta en el mercado de técnicas de inmunofluorescencia para la detección de autoanticuerpos, lo que ha posibilitado la identificación de autoanticuerpos típicos de EAI y ha facilitado su diagnóstico, así como el seguimiento y la monitorización de los tratamientos en algunos casos en cparticular (p. ej., dsADN en el seguimiento de la exacerbación de la nefritis lúpica). Se puede hablar de inmunofluorescencia de dos tipos:

• Método directo (inmunofluorescencia directa). Al suero/muestra problema se añaden anticuerpos marcados con fluoresceína y, al mezclarlo con los antígenos de sospecha, éstos aparecen fluorescentes si se unen a su anticuerpo específico marcado. 812

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• Método indirecto (inmunofluorescencia indirecta). Se coloca la muestra problema (con sospecha de presencia de un anticuerpo determinado) junto con el antígeno específico de ese anticuerpo y de una antiglobulina fluorescente específica (anti-Ac', es un anticuerpo frente al anticuerpo problema, que se une a él por una región distinta a la del antígeno). Si el suero contiene el anticuerpo problema, éste es captado por el antígeno (unido normalmente a una fase sólida, FS) y fija a su vez la antiglobulina, con lo que todo el inmunocomplejo se vuelve fluorescente (FSIAg--Ac--anti-Ac F) . Si el suero no contiene los anticuerpos problema, la antiglobulina no se fija y el antígeno permanece no fluorescente. Las técnicas de inmunofluorescencia indirecta se utilizan habitualmente en el diagnóstico y seguimiento de las EAI, pero requieren una alta especialización por parte de los profesionales del laboratorio para su interpretación, de manera que se minimicen los sesgos subjetivos que se pueden producir en las lecturas al microscopio de los distintos patrones, que se observan en función de los autoanticuerpos que se buscan y de los sustratos o tejidos que se emplean para su detección: • ANA en portaobjetos con células HEp2. • dsDNS en portaobjetos con Chritidia lucillae. • AMA/ASMA/LKM/anticélulas parietales gástricas, en portaobjetos con tejido triple (de riñón, hígado y estómago). • ANCA (anticitoplasma de neutrófilos, para el diagnóstico de vasculitis), sobre portaobjetos con neutrófilos. • Otros.

Una correcta elaboración de las prepa racio nes en in m u nofluorescencia indirecta para su visua lización en el microscopio de fluorescencia es fu nda mental para una posterior interpretación correcta. Siempre se deben incluir controles de calidad positivos y negativos, que permitan discriminar el grado de positividad en las muestras.

Cuando las muestras son altamente positivas se realizan diluciones seriadas y como resultado se informa únicamente del de la dilución más alta que resulte positiva (título).

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DETERMINACiÓN DE AUTOANTICUERP05 MEDIANTE ELI5A

Aunque para la determinación de autoanticuerpos las técnicas de referencia (gold standard) son en su mayoría las que se realizan por inmunofluorescencia indirecta, en los últimos años se han desarrollado metodologías de inmunoanálisis que también, en mayor o menor medida, permiten detectar esos autoanticuerpos. El enzimoinmunoanálisis ELISA (análisis de inmunoadsorción ligado a enzimas) es un método que se emplea habitualmente para la detección y cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas (v, capítulo 58). El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de señal que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. Con esta técnica se determinan los anticuerpos presentes en las muestras problema, especialmente en líquido cefalorraquídeo, líqui do sinovial o sobrenadante de un cultivo celular (p. ej., linfocitos), en los que su concentración es muy inferior a la del suero. La determinación se lleva a cabo mediante un enzimoinmunoanálisis en fase sólida de tipo sándwich, con lo que se obtiene un producto final coloreado, que se puede medir con ayuda de un espectrofotómetro. La cantidad de sustancia coloreada que se forma está en relación directa con la cantidad de anticuerpos presente en la muestra problema. Para conocer su concentración exacta se compara la absorbancia del problema con la absorbancia de blancos y de patrones de referencia, que contienen concentraciones de anticuerpos conocidas y que se procesan en paralelo. Entre las ventajas en la detección de autoanticuerpos que presentan estos inmunoanálisis, destacan: • En el caso de los ANA, permiten efectuar los cribados de las muestras en los laboratorios en que la demanda es muy alta, que realizan normalmente la inmunofluorescencia indirecta posterior únicamente en las muestras positivas. 813

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• Permiten una detección objetiva (y no subjetiva) de determinados autoanticuerpos que, por inmunofluorescencia indirecta, ofrecen patrones confusos o que requie ren una alta especialidad del operador. • Posibilitan discriminar los autoanticuerpos presentes en patrones mixtos de inrnuno fluoresce ncia indirecta. • Propo rcionan una mayor automatización de las técnicas en EA!.

No debo olvidar que...

Preguntas de repaso

•

El correcto diagnóstico de una enfermedad autoinmune [sobre todo las que present an una clínica dudosa) comienza con una práctica correcta en ellabor at or io, tanto a la hora de preparar las muestras, como con la interpretación y la lectura de los resultados.

•

El laboratorio , del mismo modo que precisa la información clínica de los pacientes cuyas muestras va a analizar, debe informar de los resultados de las pruebas y orientar al médico que las solicita de la patología que se sospecha y no deben limitarse a informar de los resultados simplemente como posit ivos o negativos. La relación entre el médico solicitante y los profesionales del laboratorio siempre debe de ser fluida y recíproca.

•

El papel del técnico de laboratorio no debe limitarse a gestionar los equipos de automatización ya relizar los controles de calidad, sino que debe alcanzar un escalón superior: en una colaboración conjunta con el facultat ivo de labo ratorio , debe anticipar los autoan ticuerpos que se han de buscar y, en función del diagnóstico presuntivo informado , interpretar los resultados obtenidos en el laboratorio .

Caso práctico

.

1. Dentro de las enfermedades con anticuerpos organoespecíficos no figura: a. b. c. d.

Pénfigo. Lupus . Vasculit is . Sín drom e de Godpast ure .

2. Los anticuerpos anti-Ro pertenecen al grupo de los:

La señora López acude a su médico de cabecera por sequedad en los ojos y eccemas en los labios. La petición al laboratorio , que no aporta información clínica alguna salvo malestar ocular, incluye la determinación de ANA , que resulta negativa , pero la sospecha del personal de laboratorio , tras consultar de nuevo al médico que solicita la analítica , indica la necesidad de realizar ot ras técnicas para facilitar el diagnóstico . ¿Qué ocurrió?

a. Ant icuerp os anticardioli pinas . b. Anticuerpos frente a nucleosomas. c. Ant icuer pos fren te a antígenos extra íbles del núcleo [ENA) d. A n t i c u e r p os anticitoplasma de neutrófilos [ANCA).

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BIBLIOGRAFíA

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,

Indice de contenidos •

Introducción

•

Conceptos clave en alergología

•

Diagnóstico de enfermedades alérgicas

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e técnicas sibilidad

TRODUCCIÓ Las afecciones alérgicas son un grupo de enfermedades de expresión clínica muy diferente, que tienen en común una exagerada respuesta inmunológica a algunos agentes (los alérgenos), con la característica de que en condiciones normales no producen efectos. La patología alérgica se sitúa en el contexto de las reacciones por hipersensibilidad. En el año 1963, Gell y Coombs establecieron una clasificación en cuatro tipos, que se resumen como:

• Hipersensibilidad • Alergia • Enfermedades alérgicas

• IgE • Diagnóstico molecular

• Hipersensibilidad tipo I o inmediata: reacciones en las que los antígenos se combinan con inmunoglobulinas de tipo E (IgE) específicas, que se han generado en un contacto anterior sin que se hayan producido síntomas. • Hipersensibilidad tipo 11: reacciones que resultan de la intervención de anticuerpos (Ac) de tipo IgG e IgM . • Hipersensibilidad tipo 111: la sintomatología se produce por el depósito de inmunocomplejos circulantes que se forman por la unión de antígenos (Ag) con anticuerpos. • Hipersensibilidad tipo IV: es la que está mediada por células. Por lo tanto, aunque en un sentido amplio el término hipersensibilidad puede referirse a cualquiera de estas reacciones inmunológicas, en la práctica clínica el empleo de las técnicas de laboratorio suele limitarse a las reacciones de hipersensibilidad que Gell y Coombs describen en el tipo I, en su ya clásica clasificación. Este capítulo se centra, pues, en las reacciones alérgicas mediadas por IgE, que se desarrollan a continuación. Se conocen gran cantidad y variedad de alérgenos, entre los que destacan: • Alergia por alérgenos aeroambientales. Fundamentalmente se trata de pólenes, ácaros, hongos o epitelios de animales. Alergia alimentaria. Teóricamente, casi cua lquier alimento puede producir sintomatología y destacan por su frecuencia: frutas, frutos secos, legumbres, hortalizas, cereales, leche y derivados, pescados y mariscos, huevos y determinadas carnes. Alergia al veneno de himenópteros. Alergia a medicamentos. • Alergia de contacto por alérgenos diversos . Incluyen cosméticos, tintes para el cabello, níquel y otros metales. Otros alérgenos posibles, como parásitos (p. ej., Anisakis).

Las reacciones de hipersensibilidad se clasifican en cuatro grupos, según su mecanismo de actuación.

Prácticamente, casi todas las sustancias del entorno pueden desencadenar una reacción

aLérgica.

Independientemente del agente desencadenante, la patología alérgica se puede expresar clínicamente de forma diversa, que depende del órgano diana (piel, pulmón o tracto gastrointestinal), con manifestaciones distintas, entre otras: 817

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", 1 : .

:?~:

.~!-Jt,~Yl~3::I":';;;!JJ12~':{-~Cl'~::?'J::'{:;,;~~}"·,,. nación de una historia clín ica comp leta con el exame n fís ico y el uso de t écnicas diagnósticas in vivo e in vitro específicas.

•

En todas las pruebas para el diagnóst ico alergológico es preciso informar adecuadamente al paciente y so lici tar su consen timien to informado .

•

Antes de iniciar cua lqu ier prue ba alergo lógica es preciso hacer una hist oria clínica y una exploración física det alla das.

•

Entre las distintas pruebas in vivo de que se dispone para el diagnóstico alergológico se debe em peza r siempre por la ap l icac ión de las qu e resulte n menos cruentas y más segu ras .

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Caso práctico

Preguntas de repaso 1. SeñaLar qué fármaco tiene menos posibilidades de interferir en eL resuLtado de Las pruebas cutáneas: a. b. c. d.

Antihistarninicos. Corticoides tópicos. Montelukast. Antidepres ivos.

Los r esultado s de un estudio mediante pruebas cutá neas que se realizan a un paciente con el alérg eno sospechoso han resultado negativos a las 48 horas tras sufrir una anafilaxia. ¿Cómo se debe interpretar ese hallazgo?

2. En reLación con Los faLsos negativos de Las pruebas cutáneas, señaLar La afirmación correcta: a. No hay falsos negativos en estas pruebas. b. La t écnica que se usa es independiente de los resultados. c. Algunas enfermedades pueden pro ducir resultados falsos negativos. d. Sólo pueden producir falsos negat ivos factores relacionados con la calidad y conservación de los extractos.

e

BIBLIOGRAFíA

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Indice de contenidos •

Introd ucción

•

Preparación de suspensiones celulares

•

Funcionamiento de un citómetro de flujo

•

Aplicaciones de la citometría de flujo

•

Otras técnicas de separación celular

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e

INTRODUCCiÓN

La citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico que se basa en hacer pasar una suspensión de células alineadas de una en una por delante de un haz de luz láser. Esta interacción permite identificar y caracterizar las células de forma individualizada, con una elevada sensibi lidad en la detección de poblaciones celulares poco frecuentes. Las células normales expresan antígenos que dependen del linaje y del grado de diferenciación celular. El análisis de la expresión antigénica permite definir el inmunofenotipo y así detectar alteraciones con la identificación de las células patológicas. Los anticuerpos monoclonales (AcMo) son necesarios para reconocer los antígenos celulares, por lo que son imprescindibles en las técnicas de citometría. La capacidad de disponer de un análisis multiparamétrico rápido, preciso, sensible y objetivo sitúa a la CMF en una posición privilegiada frente a otras técnicas de análisis celular convencional. La CMF ha incrementado progresivamente las aplicaciones sustituyendo o completando muchos métodos tradicionales de laboratorio. Los avances tecnológicos en el desarrollo de los citómetros, el descubrimiento de nuevos AcMo y fluorocromos, así como el mayor conocimiento de los antígenos involucrados en la maduración de los diferentes linajes hematopoyéticos, han facilitado la incorporación de esta metodología a las unidades de diagnóstico clínico. Hoy en día, la CMF constituye una técnica habitual en el estudio de diversas enfermedades. La Organización Mundial de la Salud la incluye como herramienta indispensable para el diagnóstico y clasificación de las neoplasias hematológicas. Esto hace que, en la actualidad, los citómetros de flujo formen parte del equipamiento habitual de los laboratorios asistenciales. Aunque las aplicaciones clínicas de la CMF son muy numerosas, en este capítulo se tratan fundamentalmente las que hacen referencia al estudio inmunofenotípico de las células hematopoyéticas, necesario para el análisis de poblaciones linfocitarias y en el diagnóstico de leucemias y linfomas.

e

• • • • •

Citometría de flujo Suspensión celular Análisis celular Adquisición de muestras Separación celular

La citom etría de flu jo [C M F) consiste en pasar una suspensión de células por un haz de luz láser.

PREPARACiÓN DE SUSPENSIONES CELULARES

Independientemente de las células que se desea estudiar, las técnicas de CMF que se emplean en la identificación de poblaciones celulares incluyen cuatro etapas fundamentales: la obtención de una suspensión celular, el marcado con AcMo conjugados con fluorocromos, la adquisición y el análisis en el citó metro de flujo. Las células que se estudian con la CMF han de estar en suspensión.

Obtención de una suspensión celular Las técnicas de citometría para la identificación de poblaciones celulares requieren que las células se encuentren en suspensión par a realizar el análisis multiparamétrico de forma individualizada, esto implica que en algunas de las muestras sea necesario incluir pasos previos al marcado con AcMo.

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Capítulo 61-

_

Aplicación de técnicas de identificación de poblaciones' celulares por citometría de flujo .

...

Las muestras que se van a procesar deben estar a temperatura ambiente.

Las muestras que se procesan para el análisis celular son muy variadas; las más comunes son la sangre periférica y la médula ósea; otras son menos frecuentes, como líquidos orgánicos, productos celulares de selección de células progenitoras hematopoyéticas CD34 positivas (CD34+), lavados broncoalveolares (LBA), piezas de biopsia (fundamentalmente, adenopatías) y muestras de punción aspirativa con aguja fina (PAAF). Igual que ocurre con todas las muestras biológicas, los especímenes que se reciben para CMF deben ser manipulados con precaución y se han de tratar siempre como potencialmente infecciosos. La temperatura, la conservación y el tiempo que transcurre desde la extracción de la muestra hasta el momento de realizar la técnica modifican la viabilidad y la expresión de antígenos de las células. En general, las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta que se procesan. Para que los resultados sean fiables existe un tiempo límite antes del procesamiento del estudio inmunofenotípico de las muestras. Pasado este tiempo, la viabilidad de la prueba disminuye significativamente, las células modifican su morfología y pueden determinar falsos positivos o falsos negativos para algunos marcadores. Respecto a los tiempos máximos de conservación, existe mucha variación que depende de la muestra: para sangre periférica y médula ósea el tiempo es de 24 horas; las piezas de biopsia y las de PAAF deben ser procesadas lo más rápidamente posible. La utilización de conservantes comerciales, fundamentales en las muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) en las que se produce una rápida disminución de la viabilidad celular, permite prolongar estos intervalos asegurando la estabilidad de la muestra. Otro factor que se ha de tener en cuenta en el momento de la extracción es el anticoagulante. El que más se emplea es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), anticoagulante de elección para sangre periférica y médula ósea (Tabla 61-1 ). Es importante cuantificar las células presentes en la muestra realizando un recuento previo para ajustar el número de células de la suspensión respecto al volumen de AcMo, sobre todo en sangre periférica, médula ósea y productos celulares de selección para trasplante. La sangre periférica, los productos celulares de selección de progenitores hematopoyéticos CD34+ y las muestras de PAAF, generalmente, se marcan sin ninguna

Tipode muestra

¿Qué se debe hacer a la hora de procesar LCR en el que hay pocas células?

Anticoagulante

Tiempomáximode conservación

Sangre periférica

EDTA

24 h*

Médula ósea

EDTA

24 h*

Líquido cefalorraq uídeo

EDTA

30 min*

Lavado broncoalveolar

No aplicable

24 h

Líquido ascítico

EDTA

24 h

Líquido pleural

EDTA

24 h

Biopsias

EDTA

60 min

EDTA/PCD

24 h

EDTA

60 min

Productos celulares de selección de células CD34 positivas PAAF

Tomada de: Orfao A, et al, 2003. EOTA : ácido etilendiaminotetraacético; PAAF: punción aspirativa con aguja fina; PCO: fosfato citrato dextrosa. *La utilización de conservante aumenta el tiempo máximo de conservación.

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manipulación previa. La médula ósea puede contener agregados celulares que forman grumos y se hace necesaria la filtración. Los LBA también se filtran antes de proceder a su marcado con anticuerpos. En el caso de mue stras las hipocelulares, como el LCR, se requiere una muestra concentrada que se obtiene mediante centrifugación y luego se recuperan las células del sedimento. Las piezas de biopsia se disgregan mecánicamente y después se filtran para obtener la suspensión celular.

La CM F requiere una preparación previa de la muestra de manera óptima para garantizar su viab ilidad, así como la fiabilidad de los resultados.

Anticuerpos monoclonales Los AcMo que se utilizan en los laboratorios asistenciales generalmente son productos comerciales y constituyen una herramienta imprescindible en las técnicas de citometría. Las células se marcan con AcMo, que se dirigen específicamente contra una molécula con carácter antigénico. En la actualidad existe una gran disponibilidad de AcMo que reconocen antígenos leucocitarios y se designan con el nombre de CD (cluster o/diffirentiation o grupo de diferenciación). Los paneles de AcMo de caracterización leuco citaria incluyen antígenos de línea, de diferenciación y de función, que facilitan la identificación de poblaciones celulares de sangre periférica y de médula ósea (Tabla 61-2). Las combinaciones de diferentes AcMo (en tubos) constituyen los paneles para la identificación de las células. Cada AcMo está con jugado con un fluorocromo distinto. El desarrollo de nuevos citómetros provistos de mayor número de dispositivos de láser ha permitido el empleo de combinaciones con m últiples AcMo, lo que ha posibilitado la inclusión de paneles de 6 a 8 marcadores, con lo que se obtiene la información de más antígenos. Los paneles que se utilizan en el laboratorio para el análisis de las poblaciones linfocitarias en sangre periférica están muy estandarizados e incluyen AcMo que identifican cada subtipo linfocitario (Tabla 61-3). En lo que respecta al diagnóstico de leucemias y linfomas, en el año 20 05 se constituyó el Grupo EuroFlow, formado por investigadores de diferentes países del área de la citometría y la biología molecular, con el objetivo de estandarizar las técnicas de citometría y hacer más reproducibles los resultados. Sus recomendaciones describen los paneles de AcMo que son aplicables al diagnóstico de las neoplasias hematológicas.

Varios AcMo conjugados con distintos fluorocromos se combinan para identificar diferentes antígenos celulares en tubos con el mismo volumen de muestra.

F uorocromos Los fluorocromos conjugados a los AcMo son moléculas capaces de absorber luz de una determinada longitud de onda al ser excitados por un láser y de emitir fluorescencia a longitud de onda mayor. Si el antígeno que se quiere determinar está presente en la célula, el AcMo se une al antígeno, el fluorocromo se excita y emite entonces una fluorescencia que permite detectar la presencia del antígeno. Los fluorocromos que se usan con más frecuencia son el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la ficoeritrina (PE), la proteína peridinina clorofila (PerCP) y la aloficocianina (APC). Más recientemente se han inco rporado los fluorocromos en tándem, como la ficoeritrina con cianina 7 (PECy7) o la aloficocianina con un análogo de cianina 7 (APCH7), cuya molécula principal es PE o APC con un segundo fluorocromo, en este caso cianina, unida a la molécula (Tabla 61-4). Los fluorocromos PE y APC son más brillantes que la PerC]?, mientras que el FITC presenta débil emisión. Los fluorocromos en tán dem se degradan con mayor facilidad y pierden intensidad de emisión. Se deben reservar los fluorocromos más brillantes para los anticuerpos de expresión más débil y seleccionar las combinaciones que minimicen el solapamiento de las fluorescencias.

Cada AcMo se encuentra conjugado con un fluorocromo que se excita a una determinada longitud de onda por la luz del láser y emite siempre a una longitud de onda mayor.

Técnicas e marca o con a ic erpos monoc ona es En los laboratorios clínicos de CMF el marc ado de las células con AcMo se realiza mediante una técnica de inmunofluorescencia directa, en la que los AcMo se encuentran conjugados con el fluorocromo. Una vez se ha obtenido la suspensión y ajustado

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Antígenos de diferenciación no específicos de línea CD34

Precursores hematopoyéticos

CD38

Precursores hematopoyéticos , células plasmát icas y linfoides By T activadas

HLA-DR

Precursores hematopoyéticos , células By monocíticas

CD45

Pan leucocitario

Antígenos Linfoides B CD19, CD79ac

Pan B

CD1 O, CD20, CD22, TdTc

Diferenciación linfoide B

Anti - kappa, anti- lam bda

Clonalidad linfo ide B

Antígenos lintoides T CD3/CD3c

Pan T

CD1 a, CD2, CD5, CD7, TdTc

Diferenciación li nfoide T

CD4y CD8

Linf ocitos T c Linf ocitos T colaboradores y supresores

Antígenos de céluLa NK Células NK,

CD16, CD56

Antígenos de diferenciación mieLoide CD1 3, CD33, CD117, MPOc

Mieloides

CD1 O, CD11 b, CD15, CD16

Células gran ulocíticas

CD14, CD36, CD64, HLA-DR

Células monocíticas

CD71, CD235a

Células eritroides

CD41, CD42, CD61

Células megacar iocíticas

e: citop la smático; HLA-DR: ant íge no de hi st ocomp atibilid ad hum an o de cla se 11 ; MPOc : mielop er oxid asa; NK : natural killer; TdTc: tran sferas a desoxinucleotidíli ca t erminal.

El marcado de las células puede efectuarse en la superfic ie, el citoplasma o el núcleo celular.

el número de células según el recuento a una concentración aproximada de 10 X 106 células/mL, se procede a marcar las células con los AcMo que se han seleccionado en función del estudio que se desea realizar. De forma breve, la técnica de marcado de antígenos en superficie consiste en poner en contacto en un tubo el volumen de la suspensión, normalmente 100 ul. Y

~Í~~~ia 6:1'~3; R~~;é[ ~i~,~';f~a nti c u ergos monoclonales que se emplean :~ ,.•:::::s""

Otras aplicaciones de los estudios de tipificación útiles en la clínica son : • Asociación de enfermedades con determinados antígenos HLA (lupus eritematoso sistémico DR3). • Pruebas de paternidad. • Abortos de repetición. • Relación filogenética entre poblaciones.

No debo olvidar que... •

El complejo mayor de histocompatibilid ad [CMH) ayuda a discriminar lo propio de lo extraño.

•

Existen tres clases de CMH: 1, 11 Y 111.

•

Las moléculas de clase 1 actúan como re ceptores de péptidos endógenos .

•

Las moléculas de clase 1I fijan una varie dad heterogénea de péptidos procedentes, en general, de proteínas exóg enas.

•

Existen dos vías de presentación del antígeno.

•

Se relaciona con determinadas enfermedades.

•

Es de aplicación en trasplantes .

Preguntas de repaso

Caso práctico

1. Según la estructu ra del comp lejo mayor de hi stocompat ibili dad [CMH) ¿en cuántos gr upos se divide?:

a. Dos. b. Tres. c. Cuatro. d. Cinco.

2. ¿En qu é célu las se expresa el antíge no leuco citario humano tipo I (HLA I)?: a. Células presentadoras de antígen os [CPA). b. Macrófagos. c. Todas las células. d. Todas las células nucleadas.

Una mujer de 35 años , con un trabajo sedentario de oficina y antecedentes de dislipidemia e hipertensión arterial tratada, alergia a la penicilina y que fue operada de apendicitis a los 14 años de edad, consulta por haber sufrido episodios repetidos, aunque espaciados en el tiempo durante los últimos 5 años , de dolor articular, principalmente en la zona lumbar. El dolor aparece sin causa aparente, haciéndola permanecer en cama con una importante rigidez durante varios días. Tras sufrir estos episodios se le ha producido una rigidez en la zona lumbar. La paciente ha sido tratada por sacroileítis. En los últimos días sufre también dolor en la zona del tendón de Aquiles. En el examen físico, la paciente se encuentra orientada , sin fiebre , bien hidratada y con buen color en la piel. Mide 156 cm de altura y tiene 60 kg de peso ; la presión arterial es de 150/85. No se observan adenopatías en cuello y cabeza y no hay signos meníngeos ni otras alteraciones en esa zona. ¿Qué pruebas se deben solicitar?

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BIBLIOGRAFíA

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Microbiología clínica

Capítulo 64. Introducción a la bacteriología Capítulo 65. Técnicas de procesamiento de muestras bacteriológicas Capítulo 66. Aplicación de técnicas de t inción y observación de microorganismos: preparación de medios para el cultivo de bacterias

Capítulo 67. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos Capítulo 68. Aplicación de técnicas de ident if icación bacteriana Capítulo 69. Técnicas de identificación genotípica de microorganismos. Análisis epidemiológico Capítulo 70. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana Capítulo 71. Patología infecciosa humana por aparatos Capítulo 72. Aplicación de técnicas de ident if icación de hongos y parásitos Capítulo 73. Identificación de virus

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,

I dice de contenidos •

Introducción

•

Características de las bacterias. Estructu ra y anatomía bacteriana

•

Taxonomía y nomenclatura

•

Partes de la bacteriología

•

Microorganismos implicados en procesos infecciosos. Relación huésped-parásito

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~i

e

' n a la bacteriología

INTRODUCCiÓN

La microbiología constituye una herramienta esencial en el diagnóstico de la enfermedad infecciosa, porque permite identificar y acceder al agente etiológico responsable del cuadro clínico y determina el tratamiento con una terapia antibiótica adecuada. El desarrollo de nuevas técnicas aplicadas al diagnóstico (biología molecular) ha supuesto un gran avance en microbiología y en especial en la bacteriología, la especialidad que se dedica del estudio de las bacterias.

e

CARACTERíSTICAS DE LAS BACTERIAS. ESTRUCTURA Y ANATOMíA BACTERIANA

Las bacterias son microorganismos unicelulares que se clasifican en el grupo procariotas: se caracterizan porque están rodeadas por una pared celular, tienen ribosomas del tipo 70S y carecen de verdadero núcleo (sólo poseen una formación nuclear sin membrana). Generalmente su tamaño es de unas pocas micras (entre 0,5 y 5 um). En general, su pared celular se compone de peptidoglucanos. Algunas estructuras en una célula bacteriana son constantes: pared celular, membrana citoplasmática, citoplasma y material nuclear; otras son estructuras externas facultativas opcionales: fimbrias o pili, flagelos y cápsula. El aspecto de las bacterias al microscopio se clasifica en tres formas fundamentales: esférica (cocos), cilíndrica recta (bacilos) y cilíndrica curvada (espirilos). El tamaño de los cocos suele ser de 0,4 a 1,0 pm de diámetro. El tamaño de los bacilos varía: pueden ser tan pequeños como los cocos (cocobacilos), intermedios (de 0,5 a 1,5 um) y de mayores dimensiones, como los bacilos propiamente dichos (de 3,0 a 4,0 um). Las bacterias de distribuyen en agrupaciones típicas que ayudan a completar su estudio morfológico. Los cocos se agrupan en parejas (diplococos) , en cadenas (estreptococos), en racimos (estafilococos) yen tétradas (micrococos); los bacilos se agrupan en empalizada o en letras y caracteres chinos (corinebacterias); los espirilos no suelen agruparse, pero adquieren formas típicas, semejantes a una coma (vibrios) o con curvat ura y aspecto ondulado (campilobacterias). Algunas bacterias se organizan con gran pleomorfismo (adoptan más de una forma en su ciclo vital); otras bacterias adquieren disposición filamentosa y ramificada semejante a micelios de hongos (actinornicetos); algunas son alargadas, finas o gruesas o se muestran enrolladas en espiral (espiroquetas). El estudio de las estructuras de las bacterias utiliza un orden descriptivo, desde el interior al exterior de la bacteria, que se detalla a continuación (Fig. 64-1 ):

• Nucleoide. Es una estructura nuclear elemental que contiene una gran molécula circular de ácido desoxirribonucleico (ADN) , pero no está rodeada por una membrana, la característica propia y diferencial de los organismos procariotas. • Citoplasma. Carece de orgánulos delimitados por membranas y no posee las formaciones protoplasmáticas propias de las célu las eucariotas. El citoplasma contiene:

• • • • •

Estructura celular Bacilos Cocos Taxonomía Defensas

b' \ a ~ii~ '~\ :~¿-----=

-'+'~-~ . . ~

Las bacterias presentan formas y agrupaciones típicas que ayudan a completar su estudio morfológico.

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11

~apítulo

64

Introducción a la bacteriología

... Figura 64-1. Estructura bacteriana. Mesosoma

Núcleo

Ribosoma

Cuerpos de inclus ión

Cápsula

- Pequeñas moléculas circulares de ADN. - Vacuolas (gránulos que contienen sustancias de reserva). - Ribosomas (necesarios en la síntesis de proteínas) de tipo 70S.

Las bacterias son microrganismas procariotas (carecen de núcleo definido), de pequeño tamaño (de 0,5 a 5IJml y no disponen de organelas citoplasmáticas con pared celular de peptidoglucanos y ribosomas 70S.

• Membrana citoplasmática. Está formada por una bicapa lipídica, que interviene en dos funciones principales: actúa como barrera de permeabilidad selectiva y conforma el soporte para los distintos sistemas enzimáticos. • Pared celular (membrana externa). Es el estrato rígido que confiere la forma a la bacteria. Se considera el esqueleto de la célula y está compuesta principalmente por peptidoglucanos (mureína). Las bacterias grampositivas poseen una gruesa pared celular conformada por varias capas interconectadas de peptidoglucanos, que constituye elSO-90% de la estructura total. Por el contrario, las bacterias gramnegativas poseen una fina capa de peptidoglucanos que constituyen un 20% de la pared celular y que se encuentra rodeada por una segunda membrana lipídica exterior que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas. • Espacio periplasmático. Se encuentra en las bacterias gramnegativas y está situado entre la membrana citoplásmica y la membrana externa y contiene enzimas hidrolíticas. • Cápsula. Es una estructura que se forma por la acumulación de sustancias de excreción del metabolismo de la bacteria y por la interacción con el huésped. Está constituida por polisacáridos y polipéptidos: protege y participa en la adhesión. Algunas bacterias no disponen de cápsula y otras son capaces de desarrollarse como endosporas, un estado latente de bacterias capaces de resistir condiciones extremas. • Estructuras exteriores. Entre las formaciones estructurales externas de la célula bacteriana destacan flagelos y pili.

e

TAXONOMíA Y NOMENCLATURA

La taxonomía consiste en la clasificación, la nomenclatura y la identificación de los microorganismos, que se definen como:

• Clasificación. Es la ordenación o reestructuración de los organismos en grupos o taxones (dominio o imperio, clase, orden, familia, género o especie) en función de semejanzas mutuas o de parentesco evolutivo. • Nomenclatura. Se considera la parte de la taxonomía que trata de asignar un nombre científico a los grupos taxonómicos, de acuerdo con los criterios y las normas preestablecidas por convenio y admitidas internacionalmente.

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Microbiología Clínica

Módulo VII

• Identificación. Es la parte práctica de la taxonomía que permite adjudicar un organismo determinado a un grupo taxonómico conocido o establecido previamente. Todos los organismos se pueden integrar en uno de los cinco reinos: Procaryotae, Protista, Fungi, Plantae y Animalia. Según el sistema de nomenclatura de Linneo (1707-1770), cada organismo vivo se designa con dos nombres consecutivos, el género y la especie, que se escriben en cursiva (p. ej., Escherichia coli, Staphylococcus aureus). El género bacteriano identifica a un grupo de especies estrechamente relacionadas entre sí. La especie bacteriana considera el conjunto de poblaciones clonales (individuos genéticamente idénticos con un único antepasado común) con gran similitud fenotípica entre sí y que a la vez difieren apreciablemente de otros conjuntos de poblaciones clonales. Además de las propiedades estructurales, la catalogación de especies recurre a las propiedades bioquímicas y fisiológicas de los organismos; por este motivo, la taxonomía clásica se basa en la caracterización morfológica, fisiológica y bioquímica de las diferentes especies (Tabla 64- 1). Entre los caracteres taxonómicos morfológicos, se consideran principalmente los que se verifican mediante la tinción de Gram (+/- ), la tinción de Ziehl-Neelsen, la morfología de sus colonias o agrupamientos y la configuración de estructuras especiales (esporas, cápsulas). Entre los caracteres bioquímicos y fisiológicos destacan, entre otros, las pruebas de rojo de metilo, de Voges Proskauer, de oxidasa y catalasa y de fermentación de azúcares. A continuación se explica el procedimiento de la tinción de Gram, ya que en ella se basa la taxonomía bacteriana; otras tinciones y pruebas bioquímicas se describen más adelante. La tinción de Gram es un procedimiento diferencial que se utiliza ampliamente en microbiología. Permite distinguir los microorganismos en dos grandes grupos: grampositivos y gramnegativos, según la coloración que adquieren cuando se realiza la tinción, que revela la diferente constitución de la pared celular de los microorgarusrnos. Las bacterias grampositivas, con mayor cantidad de peptidoglucanos, no se decoloran y retienen el colorante inicial, el violeta de genciana; las bacterias gramnegativas, que contienen menor cantidad de peptidoglucano, sí se decoloran fácilmente, permiten la salida del colorante inicial y pasan a adquirir la tonalidad rosa del último colorante que se añade (safranina) . La descripción del procedimiento incluye los siguientes pasos:

Cada organismo vivo se designa con dos nombres consecutivos: género y especie.

Vídeo 64-1. Realización de una tinción de Gram.

¿Por qué se decoloran las bacterias gramnegativas?

1. El colorante básico violeta de genciana penetra en la célula bacteriana, tanto de los microorganismos grampositivos como de los gramnegativos. 2. Luego, ellugol penetra en la célula y constituye un complejo insoluble con el violeta de genciana.

Características

Ejemplos de propiedades que se observan

MorfoLógicas

Forma y tamaño celular, morfología de colonias, reacción a la tinción, presencia de cilios o flagelos, forma y localización de esporas

Bioquímicas/ fisioLógicas

Condiciones de crecimiento [pH, temperatura, oxígeno), motilidad, fuentes de carbono utilizadas, uso de carbohidratos con producción de ácido o no, características enzimáticas, tipo de metabolismo

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•

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11

Introducción a la bacteriología

Capítulo 64

3. La mezcla de alcohol-acetona tiene como misión la decoloración: las bacterias grampositivas, debido a su gruesa pared de peptidoglucano, no se decoloran, mientras que las gramnegativas sí lo hacen. El complejo violeta genciana-yodo queda atrapado dentro de la pared celular y tiñe de color azul las bacterias grampositivas. 4. Finalmente se adiciona safranina, cuya función es poner de manifiesto las bacterias decoloradas, es decir, destacar las bacterias gramnegativas, que adquieren una tonalidad rojiza (Fig. 64 -2).

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Bacterias gramnegativas ~

A Figura 64-2. Tincion de Gram.

D istintos autores han establecido numerosas clasificaciones taxonómicas, que se fundamentan en diferentes criterios con pretensiones más o menos exhaustivas. En este capítulo se opta por una clasificación muy simplificada que se basa en los parámetros clásicos, como la capacidad tintorial de la bacteria (Gram +/-), su morfología (cocos, bacilos, cocobacilos) y su atmósfera de crecimiento (aerobios, anaerobios, micr oaerofilia), así como en otras pruebas bioquímicas cuyos resultados son homogéneos en determinados grupos de microorganismos. Junto a estos parámetros clásicos, también se tiene en cuenta la secuenciación genética. Se toma como referencia uno de los principales manuales de microbiología clínica actuales (editado por James Versalovic, 2011) (Tablas 64 -2 y 64 -3).

e

PARTES DE LA BACTERIOLOGíA

Bacterias «comunes» En este apartado se detallan los aspectos microbiológicos más relevantes de las bacte rias más comunes y mayor interés clínico, así como los principales cuadros clínicos en que estas bacterias están implicadas.

Cocos grampositivos a. Género Staphylococcus: son cocos redondos, que se distribuyen aislados, en parejas, cadenas cortas o racimos irregulares. Son aerobios y anaerobios facultativos (con metabolismo respiratorio con oxígeno o fermentativo sin oxígeno). Producen catalasa. Se distinguen tres especies de interés: S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus. S. aureus tiene una mayor relevancia clínica y se caracteriza porque es productor de coagulasa. Forma parte de la flora normal del organismo humano; se encuentra en la mucosa nasal, la cavidad oral, el intestino grueso y la piel. Se asocia a infecciones cutáneas y de mucosas (foliculitis, impétigo, pénfigo, panadizos), infecciones del tracto urinario (ITU), osteomielitis, artritis, conjuntivitis, endocardit is, sepsis o toxiinfección alimentaria (por alimentos contaminados). b. Género Streptococcus: son cocos pequeños, que se sitúan aislados, en parejas o en cadenas. S. pneumoniaese presentan en parejas y adoptan forma lanceolada; disponen de cápsula. Son anaerobios facultativos. S~ crecimiento requiere una atmósfera de dióxido de carbono (C0 2 ) . Todos los estreptococos son catalasa negativos. Se diferencian por el tipo de hemólisis (betahemolíticas para S. pyogenes del grupo A y S. agalactiae del grupo B; alfahemolíticas para S. pneumoniae) , la sensibilidad a la bacitracina (S. pyogenes) ,, a la optoquina (S. pneumoniae), hidrólisis del hipurato (S. agalactiae) y por serotipificación. La mayoría de estreptococos forma parte de la flora comensal de la orofaringe, el intestino y la piel. Cuando son patógenos pueden provocar infecciones localizadas u originar cuadros sépticos: S. pyogenes puede causar infecciones del tracto respirator io, faringitis y amigdalitis; glomerulonefritis; vaginitis y endocarditis. S. agalactiae causa vaginitis, infecciones urinarias en mujeres, sepsis y meningitis neonatal. S. pneumoniae se aísla como causa de infecciones respiratorias, en particular neumonías, sinusitis, otitis y también en meningitis y sepsis. Los estreptococos del grupo viridans se han asociado con endocarditis y bacteriemias. No obstante, en otras ocasiones sólo son meros contaminantes. 864

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Los cocos grampositivos de mayor relevancia clínica y microbiológica son: estafilococos [5. aureus), estreptococos [5. pneumo-

Géneros Mycoplasma y Ereaplasma

niae, 5. pyogenes, 5. agalactiae)

y enterococos.

Chlamydia y Chlamydophila MicopLasma y bacterias de crecimiento intraceLuLar obligado

Rickett sia Ehrlichia, Anaplasma Coxiella Tropherima

Toma da de: Versalovic J, ed. Manual of Clinical M icrobiol ogy. 10th ed. Washington: AS M Press, 2011.

c. Género Enterococcus (estreptococos del grupo D): habitan en el tracto intestinal

humano y de otros mamíferos. E. faecalis es la especie que se aísla más frecuentemente y se encuentra implicada en ITU, sepsis y endocarditis. Es característica la resistencia a betaláctamicos y aminoglucósidos de E. faecium.

Cocos gramnegativos

Los cocos gramnegativos de mayor relevancia clínica y microbiológ ica son N. gonorrhae, N. meningitidisy M. catarrhalis.

a. Género Neisseria: son cocos que se agrupan en pareja, con la forma característica en «granos de café». Son aerobios. Producen catalasa y oxidasa. Las especies patógenas se diferencian por la fermentación de azúcares y por serotipificación. N gonorrhae es el agente etiológico de la uretritis gonocócica, se puede localizar en la orofaringe, el recto y se puede transmitir y afectar al recién nacido (conjuntivitis, sepsis neo natal) . N meningitidiscausa meningitis y sepsis, aunque también puede ser saprofita nasofaríngea. b. Género Moraxella: son cocos o coco bacilos cortos, que se encuentran en parejas o aislados. Son aerobios. M. catarrhalis (Branhamella) es la especie de mayor interés y forma parte de la flora comensal de la orofaringe. Se ha asociado con infecciones respiratorias, otitis y conjuntivitis. c. Género Veillonella: son cocos pequeños, que se disponen en parejas o forman masas irregulares. Son anaerobios estrictos. También son comensales del tracto respiratorio, del tracto intestinal y de la mucosa vaginal. Se comportan como patógenos oportunistas y causan procesos infecciosos en localizaciones próximas a su hábitat.

Baci os gra

ositivos

a. Género Corynebacterium: son bacilos pequeños, dispuestos en empalizada o en letras y caracteres chinos. Son aerobios. Son catalasa positivos. Permanecen inmóviles y se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, así como en la piel y las mucosas de humanos y animales. A excepción de C. diphteriae, el resto de especies de corinebacterias se consideran saprofitas, aunque pueden comportarse como patógenas oportunistas en pacientes inmunodeprimidos. C. urealyticum se ha asociado con cistitis y C. jeikeium con sepsis en pacientes inmunodeprimidos. Rhodococcu equi (C. equi) se ha descrito como productor de infección pulmonar en casos de síndrome de inmunodeficiencia adquirida. b. Género Propionibacterium: son bacilos pequeños de aspecto difteroide. Son anaerobios. E acnes se aísla en humanos como flora normal de la piel, la cavidad oral y el contenido intestinal. Se ha localizado en infecciones de heridas, abscesos, sepsis y endocarditis. c. Género Listeria: son pequeños bacilos pleomórficos, cortos, aislados o dispuestos en empalizada o en cadenas. Son anaerobios facultativos. Producen catalasa. Son

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Microbiología Clínica

d.

e.

f.

g.

h.

1.

Módulo VII

móviles a 20-25 "C, pero permanecen inmóviles a 37 "C. Hidrolizan la esculina. L. monocytogenes origina en humanos un cuadro infeccioso generalizado que afecta principalmente al sistema nervioso central, al hígado y al miocardio. La infección asintomática se produce de manera frecuente. En ocasiones se describe como causa de infección genital, septicemia, endocarditis y, sobre todo, meningitis en el recién nacido. También se relaciona con el rechazo en trasplantes. Género Lactobacillus: son bacilos pleomórficos, finos y largos, propensos a decolorarse. Son anaerobios facultativos. Se aíslan frecuentemente como parte de la flora vaginal normal y en la cavidad oral. Género Bacillus: son bacilos grandes y rectos, con los extremos redondeados. Pueden mostrar esporas centrales (B. anthracis) , terminales o subterminales. Son aerobios obligados o facultativos. Se aíslan con frecuencia contaminando los cultivos procedentes de la piel, las mucosas y el tra cto intestinal. B. anthracis es el agente etiológico del carbunco y B. cereus es común en cuadros de toxiinfección alimentaria. Género Clostridium: son bacilos grandes, con extremos romos y tienden a decolorarse. Pueden mostrar esporas. Son anaerobios. Son catalasa negativos. Forman parte de la flora comensal del intestino. Determinadas especies causan patologías a través de la producción de exotoxinas: C. perfringens (gangrena gaseosa), C. tetani (tétanos), C. boulinum (botulismo), C. septicum (sepsis en inmunodeprimidos) y C. difficile (colitis seudomembranosa) . Género Actinomyces: son bacilos pequeños, gram positivos o gram variables, alargados y con ramificaciones que terminan en filamentos. No son ácido-alcohol resistentes. Son anaerobios o aerobios facultativos. A. israelii es anaerobio obligado y se ha identificado como el agente etiológico de la actinomicosis. Género Nocardia: son bacilos finos, largos, ramificados, capaces de formar filamentos y redes. Muestran una tinción desi gual, como cuentas de rosario. Son parcialmente ácido-alcohol resistentes. Son aerobios obligados. Son resistentes a la desecación. Pueden originar infecciones pulmonares, abscesos cutáneos y sepsis. N asteroides es la especie más frecuente de no cardia. Género Borrelia: se describe más adelante en el apartado bacterias «especiales».

¿Recuerda un ejemplo de coco gramnegativo?

Entre los bacilos grampositivos destacan los géneros Clostridium, Corynebacterium, Listeria y Nocardia.

Bacilos gramnegativos a. Género Gardnerella: son pequeños bacilos pleomórficos gram variables. Son aerobios facultativos. Son resistentes al ácido nalidíxico, la colistina y las sulfamidas. G. vaginalis se considera el causante de vaginosis bacteriana. b. Género Haemophilus: son pequeños bacilos pleomórficos, agrupados. Para su desarrollo requieren factores de crecimiento (X y/o V). Son catalasa positivos y oxidasa negativos. H influenzae es la especie que se encuentra con más frecuencia en la clínica. Origina diversos procesos infec ciosos: faringitis, bronquitis, neumonía, otitis, conjuntivitis, meningitis y otros. H parainfluenzae provoca infecciones respiratorias. H ducreyes el agente productor del chancro blando. c. Género Brucella: se describe más adelante en el grupo de bacterias de lento crecimiento. d. Género Bordetella: son bacilos muy pequeños o cocobacilos que tienden a una coloración bipolar. Son aerobios obligados. Son catalasa positivos. B. pertussis es el agente causal de la tos ferina. e. Familia Enterobacteriaceae: incluye los géneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, shigellay Yersinia, entre otros. Engloba un gran número de géneros. Son bacilos anaerobios facultativos. Son catalasa positivos y oxidasa negativos. Fermentan la glucosa y reducen los nitratos; las pruebas bioquímicas más diferenciadoras de estas bacterias son: fermentación de la lactosa, producción de la fenilalaninadesaminasa, desoxirribonucleasa, indol, citrato, ureas a, lisinadescarboxilasa, ornitodescarbo~ilasa y la prueba de movilidad. Todos estos géneros incluyen importantes patógenos extrahospitalaroios e intrahospitalarios (neumonías, ITU y sepsis), aunque algunos de

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•

•

Capítulo64

Entre Los bacilos gramnegativos destacan: G. vaginalis, H. /nfluenzae, Brucella spp, B. pertussis, Pseudomonas spp, familia Enterobacteriaceae, C.jeyuni y C. coli, H. pylori, V cholerae, A. hidrophila y B. fragilis.

Desde el punto de vista clínicomicrobiológico, entre las bacterias que no se tiñen por la tinción de Gram destacan: L. pneumophila, M. tuberculosis, T. pallidum, M. pneumonia, R. conorii, C. burnettiy C. pneumoniae.

Introducción a La bacterioLogía

ellos en general provocan infecciones en el medio hospitalario (Serratia spp, Klebsiella spp y Enterobacter spp). f. Género Pseudomonas: son bacilos grandes, aerobios obligados. Son catalasa positivos y oxidasa positivos (excepto J? maltophilia). No fermentan la glucosa, reducen los nitratos y son patógenos oportunistas. J? aeruginosa es la especie que se implica con más frecuencia en otitis, neumonía y bacteriemia, ITU, infecciones de las heridas y quemaduras. g. Género Alcaligenes: son bacilos grandes. Son aerobios. Son catalasa positivos y oxidasa positivos. Reduce los nitratos. A. faecalis provoca infecciones oportunistas. h. Género Aeromonas: son bacilos grandes. Son aerobios facultativos. Son catalasa positivos y oxidasa positivos. Fermentan la glucosa y reducen los nitratos. A. hydrophila origina infecciones de las heridas, otitis y diarrea. 1. Género Vibrio: son bacilos cortos, finos y curvados. Son aerobios facultativos. Son catalasa positivos y oxidasa positivos. Fermentan la glucosa y reducen los nitratos. Muchas especies producen toxiinfecciones alimentarias por consumo de pescado crudo; colonizan las heridas y causan otitis. J. Género Campylobacter: son bacilos finos, curvados y microaerófilos. Son oxidasa positivos. C. jejuni interviene en cuadros diarreicos y sepsis en pacientes inmunodeprimidos. k. Género Helicobacter: sus características son muy parecidas a las campilobacterias. Son microaerófilos. Son oxidasa positivos. Se han relacionado con gastritis y úlcera - duodenal. 1. Género Bacteroides: son bacilos pleomórficos anaerobios. Fermentan los azúcares. B. fragilis es la especie que se aísla con más frecuencia. m. Género Fusobacterium: son bacilos pleomórficos anaerobios.

Bacterias que no se tiñen con La tinción de Gram a. Género Legionella: no se tiñe con la tinción de Gram. Son bacilos grandes, pleom órficos, cortos y alargados. L. pneumophila es el agente causal de la legionelosis (neumonía atípica). b. Géneros Mycobacterium, Treponema, Leptospira, Mycoplasma, Rickettsia y Chlamydia: se describen más adelante en este mismo apartado, así como en temas específicos en otros capítulos de este libro.

Bacterias anaerobias

Para el transporte de las muestras se requiere el empleo de los medios adecuados que proporcionen un ambiente con un bajo poder de oxidorreducción.

Son bacterias que no requieren oxígeno como aceptor final de electrones, para utilizar la energía; de hecho, el oxígeno suele ser tóxico para ellas, de las que existe un amplio abanico de microorganismos, desde los muy tolerantes y resistentes hasta los extremadamente lábiles a este gas. Forman parte de la flora microbiota normal como comensales y mutualistas, especialmente frecuentes en la orofaringe, nasofaringe, vagina e intestino, desde donde se eliminan, a excepción de los clostridios, que sobreviven mediante la formación de esporas. Para la búsqueda de bacterias anaerobias se recomienda la toma de muestra con aguja y jeringa (nunca con torunda) y su transporte debe realizarse rápidamente al laboratorio, en medios con bajo poder de oxidorreducción; análogamente, los medios de cultivo deben incubarse en atmósfera anaerobia (

M~crobiología Clínica

.

MóduLo VII

Chapin K, Murray PRo Stains. En: Murray PR, ed. Manual of Clinical Microbiology. 7 th ed. Washington DC: American Society for Microbiology, 1997. Koneman EW, Allen S. Koneman Color Atlas and Texbook ofDiagnostic Microbiology. 6 th ed. USA: Ed. Lippincort Williams &Wilkins, 2006. Koneman RM, Snyder ]W Reagents, Stains, and Media Bacteriology. En: Versalovic ], ed. Manual of Clinical Microbiology. io- ed. Washin gton DC: American Society for Microbiology, 2011. Sánchez C, Guerrero C. Procedimientos en microbiología clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). N° 3a: Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología. 2003. Thomson RB. Specimen collection, transport, and processing: Bacteriology. En: Murray PR, Baron E], ]orgensen H, Laundry ML, pfaller MA, eds. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Washington DC: American Society for Microbiology, 2007.

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Indice de contenidos •

Introducción

•

Consideraciones previas a la siembra

•

Técnicas de siembra e inoculación

•

Técnicas de incubación

•

Técnicas de determinación del crecimien to

•

Descripción macroscópica de los cultivos

•

Vocab ulario relacionado

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de técnicas nto de micro

e

INTRODUCCiÓN

El procesamiento de la muestra en el laboratorio de microbiología exige tener en cuenta dos cuestiones: las características de la muestra que se recibe y los microorganismo s que se investigan; ambas tienen el objetivo de obtener información sobre la presencia o la ausencia de un microorganismo, que permita tratar y resolver un proceso infeccioso que afecta a un paciente. Es fundamental gestionar bien el material desde el momento en que una muestra llega al laboratorio, porque en ocasiones no puede repetirse o es irrecuperable (material quirúrgico, biopsias). Un error en el procesamiento de la muestra puede imposibilitar un diagnóstico. Además, hay que conocer los posibles microorganismos implicados en el proceso clínico que se quiere investigar y las distintas alternativas o posibilidades en medios de cultivo u otras técnicas que puede ofrecer el laboratorio para obtener un crecimiento específico. Según su naturaleza, antes de proceder a la siembra, la muestra puede requerir un proceso previo (dilución, homogeneización, centrifugación o tratamiento con distintos productos). La siembra se hace de forma reglada según los protocolos validados y vigente s en cada laboratorio.

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CONSIDERACIONES PREVIAS A LASIEMBRA

El procesamiento de la muestra comienza cuando llega al laboratorio. Las muestras deben cumplir ciertos criterios para su aceptació n y procesamiento (Tabla 67-1). Si se rechaza una muestra debe comunicarse al peticionario y explicarle la carencia o el defecto que se observa. Si la 'm uestra se ha tomado con una técnica invasiva o es irrecuperable, se procede a procesarla, indicando en todos los casos la deficiencia que se ha detectado. Hay que ser muy escrupuloso en la selección, ya que no siempre las muestras son rentables desde el punto de vista microbiológico (Tabla 67-2). Otras consideraciones que se han tener en cuenta son:

• • • • •

Siembra Incubación Crecimiento bacteriano Medio de cultivo Aislamiento

La muestra puede requerir un proceso previo a la siembra según su naturaleza: dilución, homogeneización, centrifugación o tratamiento con distintos productos. La siembra se hace de forma reglada según los protocolos validados y vigentes en cada laboratorio .

• Las muestras no deben almac enarse más de 24 horas sin procesar y permanecer refrigeradas, excepto las que se supone que son estériles (líquidos biológicos, biopsias, etc.). • El material sólido o muy consistente se debe homogeneizar con una solución salina. En caso necesario, se procede a triturarlo en un homogeneizador de vidrio o automático (Stomacher), un mortero o se corta con un bisturí, siempre con el empleo de una técnica estéril. Se procura que el suero salino que acompaña a la muestra o que se añade para triturarla no la diluya excesivamente. • Las muestras viscosas (p. ej., respiratorias) pueden tratarse con un fluidificante como la N-acetil-cisteína, que es inocua para los gérmenes. • Las muestras intrínsecamente contaminadas se deben someter a descontaminación con hidróxido sódico u otros productos antes de sembrarlas: por ejemplo, las mues911

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¿Qué período de lectura tienen las pruebas diferidas?

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Aplicación éle técnicasde identificación bacteriana

• Coagulasa. Permite detectar la capacidad de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. Se utiliza plasma de conejo. La presencia de coagulasa distingue Stapbylococcus aureus (coagulasa positivos) de otras especies de Staphylococcus. La prueba de la coagulasa en tubo se puede verificar tras una incubación de 4 horas, pero si resulta negativa debe mantenerse la incubación hasta 24 horas. Si se hace en portaobjetos, se produce una aglutinación inmediata. • Fenilalanina-desaminasa (FDA). Esta enzima capacita a un microorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina formando ácido fenilpirúvico, lo que provoca una acidez que se pone de manifiesto al añadir unas gotas de cloruro férrico. Esta actividad enzimática es característica de los géneros Proteus, Providencia y Morganella sobre el resto de enterobacterias. Reactivo: 120 g de cloruro férrico, 25 mL de CIH y 1.000 mL de agua destilada. Se guarda en frasco topacio. • Desoxirribonucleasa (ADNasa). Ciertas bacterias (Moraxella spp) tienen la capacidad de hidrolizar enzimáticamente el ácido desoxirribonucleico (ADN) produciendo una mezcla de mononucleótidos y polinucleótidos. • Hidrólisis de la gelatina. Mediante la gelatinas a algunos microorganismos pueden hidrolizar la gelatina y fraccionarla en sustancias menos complejas: péptidos y aminoácidos. • Descarboxilasas. La descarboxilación ataca el extremo carboxilo de los aminoácidos para reducirlos a una amina y dióxido de carbono (C0 2 ) . Los tres aminoácidos que se investigan buscando la correspondiente descarboxilasa son arginina, lisina y ornitina: lisina y ornitina producen cadaverina y putrescina (diarninas); la arginina origina citrulina por actuación de una deshidrolasa. Esta prueba se debe efectuar en paralelo con un tubo de control que contiene el medio base sin aminoácido. Puesto que se trata de una reacción anaerobia, el medio se cubre con aceite mineral. El proceso se produce en dos tiempos: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio que toma color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la descarboxilación, Cuando este último proceso tiene lugar se forman las aminas que incrementan el pH y se produce en este caso un viraje del indicador a color violeta. Estas pruebas se usan en la identificación de bacilos gramnegativos y grampositivos. • Lipasa. Esta enzima descompone las grasas en ácidos grasos y glicerol. Se forma un halo opaco alrededor del medio enriquecido con Twen 80 (rico en ácido linolénico). • Lecitinasa. En presencia de esta enzima se forma un halo opaco alrededor de la colonia cuando se cultiva en medio con yema de huevo (rico en lecitina). • Citrato. Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono, con lo que se produce una alcalinización del medio. Esta reacción es típica de los géneros Enterobacter, Klebsiella, Serrada, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. • Malonato. Se prueba la capacidad de los microorganismos de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono. De modo paralelo se produce una alcalinización del medio que se detecta por un viraje de azul de bromotimol, que cambia de verde a azul. Los microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. Se emplea en la diferenciación de especies de Enterobacteriaceae. La mayoría de las especies de Enterobacter y Klebsiella utiliza malo nato de sodio. Prueba de CAM~ Detecta la capacidad de un microorganismo para producir una proteína (el factor CAMP). La proteína produce un efecto sinérgico con la p-hemolisina de S. aureus sobre los eritrocitos del medio, que se observa como un fenómeno lítico en la intersección de la siembra de dos microorganismos que se cultivan en perpendicular. • Galerías comerciales. En la actualidad se comercializan sistemas semiautomáticos y automáticos que combinan distintas propiedades (bioquímicas y morfológicas) en forma de galerías, paneles o tarjetas miniaturizadas, que se incuban y se leen de forma automática (Ta a 68-2). Según el resultado, positivas o negativas, se les asigna un valor establecido previamente que forma parte de un código numérico.

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.

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Módulo VII

Microbiología Clínica

Tabla 68-2. Bases químicas de los sistemas de identificación Reacción básica

Reactivo

Indicador de resultado positivo

Necesidad de crecimiento

Utilización de ca rboh idratos

Ca mbio de color debido a acidificación revelada por presencia de indicado r de pH

Sí (15-24 hl

Presencia de proteína s (productos nitrogen ados]

Cam bio de color debido a basificación revelada por presencia de indicador de pH

Sí (15-24 hl

Enzimática

Enzimas prefor madas

Cam bio de color deb ido a la liberación de compuestos cromógenos y/o fluorógenos gen er ados a part ir de la hidrolización enzimática de comp lejos incoloros

No (2-4 hl

Utilización de base carbonada

Sus trato orgánico

Ca mbio del color debido a la actividad me tabólica. Viraje de l azul de te trazoílo a púrpura

Sí

Detección de ácidos volátiles y no volátiles

Ácidos grasos cel ulares

Detección por cromatografía en función de una base de datos preestablecida

Sí

Detección visual de crecimiento

Varios sustratos

Medida de turbid ez deb ida al crecim iento microbiano en presencia de sustrato

Sí

Bioquímicos

Un ejemplo (Fig. 68-1 ) de cómo se puede obtener el código numérico para com parar con un patrón conocido sería el siguiente: las pruebas se agrupan de tres en tres (prueba A BCD E F G, etc.) y se establece un valor O si es negativo y 1,2 Y 4, respectivamente, en cada triplete de pruebas; si todas las pruebas del triplete (p. ej., A: fermentación de glucosa, B: producción de gas de glucosa, C: descarboxi lación de lisina) son positivas, se asigna 7 a ese triplete; si A y B son positivas, el valor es 3 (1 + 2) y así se obtiene una cifra que la aplicación informática interpreta comparando con los códigos numéricos que constan en su base de datos, de modo que, si se obtiene 3341 en la cepa problema y se trata de un bacilo gramnegativo, el sistema lo identifica como Proteus mirabilis. Muchos sistemas incorporan tam bién concentraciones seriadas de antimicrobianos de forma que se combina identificación y sensibilidad en el mi smo panel. Es importante tener presente que aunque los sistemas comerciales consiguen en general una buena correlación (> 95%) con la identificación de referencia, hay factores que pueden distorsionar los resultados, como el tiempo y la temperatura de incubación, el pH, el medio de cultivo y, sobre todo, la contaminación del inóculo y la falta de experiencia del operario.

A

A

e

D

E

8,88 F

G

H

J

88 K

L

A: Fermentación de la glucosa B: Producción de la glucosa C: Descarboxilación de la lisina

G: Fermentación de la lactosa H: Fermentación del dulcitol 1: Desaminación de la fenilanina

o: Descarboxilación de la ornitina

J: Hidrólisis de la urea K: Utilización de citrato L: Fermentación de manitol

E: Producción de H2S F: Producción de indol Código: 3341

..... Figura 68-1 . Esquema de galería come rcial para caracterización de propiedades bioquímicas.

Proteus mirabilis

931

ERRNVPHGLFRVRUJ

•

Capítulo 68

Aplicación de técnicas de identificación bacteriana

Finalmente, las pruebas bioquímicas incluyen las pruebas de sensibilidad/resistencia. La sensibilidad/resistencia de ciertos gérmenes ante determinados antimicrobianos puede utilizarse como un parámetro que ayuda para la identificación cuando es un carácter fijo; por ejemplo, Bacteroides fragilis es resistente a penicilina, kanamicina, colistina y vancomicina. Otros antibacterianos de utilidad demostrada son:

Indique una utilidad de las galerías comerciales.

• Novobiocina. La resistencia a novobiocina (con un disco impregnado con 5 ~g) identifica Staphylococcus saprophyticus. • Bacitracina. La sensibilidad a bacitracina (disco con 3 unidades de carga) diferencia S. pyogenes (grupo A), causante de la faringitis estreptocócica y la fiebre reumática, del resto de los grupos de estreptococos betahemolíticos. Éstos no muestran el halo de inhibición del crecimiento característico de s. pyogenes tras la incubación en CO 2 durante 18-24 horas. • Opto quina. La sensibilidad a optoquina utilizando un disco con 400 ~g tras la incubación durante 18-24 horas en CO 2 distingue S. pneumoniae de otros estreptococos. El halo debe ser ~ 14 mm para el disco convencional (6mm de diámetro). • Solubilidad en bilis. Algunas especies bacterianas son lisadas por las sales biliares (taurocolato y desoxicolato sódicos), de forma que se provoca una disminución de la tensión superficial que, unida a la actuación de enzimas autolíticas, destruyen la célula. Este efecto es típico de s. pneumoniae, en que se aprecia una umbilicación central de la colonia en agar sangre. • Crecimiento en caldo hipersalino. Detecta la capacidad de algunos microorganismos para tolerar altas concentraciones de cloruro sódico (5-6,50/0).

Métodos químicos Los métodos químicos analizan distintos componentes de la pared de la bacteria. La proteómica estudia y caracteriza el proteoma (conjunto de proteínas que expresa un genoma). Puede abordarse de modo global o bien con el examen de las proteínas de forma individual. Las técnicas concretas dependen del objetivo de la investigación: • La técnica que más se utiliza para analizar el proteoma de forma global es la electroforesis bidimensional y la espectrometría de masas. • Las técnicas para el análisis individual de las proteínas se centran en la digestión de las proteínas con enzimas proteasas que originan distintos fragmentos proteicos (se denomina «huella peptídica» al conjunto de fragmentos peptídicos que se generan; es específica de cada microorganismo). Actualmente se estudia la automatización de la proteómica y ya existen bases de datos que contienen información de numerosas huellas peptídicas. La espectrometría de masas de ionización/desorción suave mediante láser (matrix assisted laser desorption ionization time-offlight massspectrometry, MALDI-TOF [M SJ) es una técnica que analiza proteínas y obtiene patrones que sirven como biomarcadores en distintas enfermedades (p. ej., cáncer o enfermedad de Alzheimer). En los últimos años se ha comercializado para el análisis de bacterias, levaduras y hongos. La muestra en cuestión se somete a ionización mediante láser y una vez que se produce la ganancia de carga eléctrica, los iones que resultan se separan al pasar por un campo eléctrico de acuerdo a su carga y masa (m/z), lo que da lugar a un espectro característico que sirve para diferenciarla de otras especies. Se utiliza sobre cepas que se han multiplicado en un medio de cultivo y no directamente sobre las muestras. Se ha desarrollado el también el sistema SELDI-TOF (surface enhanceddesorption ionization) que permite la identificación más rápida con la simplificación de la metodología MALDI. La espectroscopia Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) se basa en el análisis químico de una sustancia que se excita cuando se somete a la acción de una radiac ión de infrarrojos determinada. La energía que absorbe cada molécula produce

932

ERRNVPHGLFRVRUJ

Módulo VII

Microbiología Clínica

un movimiento vibratorio que origina una hue lla característica de esa sustancia. La huella de la composición de un microorganismo es compleja, pero a la vez es específica de ese taxón (grupos de organismos emparentados). Se ha desarrollado una base de - datos de microorganismos ya identificados que sirve de patrón para comparar la cepa problema. La espectroscopia FTIR realiza la identificación a partir de colonias ya crecidas y es un método rápido (aproximadamente 2,5 horas), con buena capacidad de discriminación y barato, aunque en la actuali dad su uso es minoritario. El análisis del patrón proteico de la célula por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida (multi locus enzyme electrophoresis, MLEE) ofrece información de la composición proteica de cada taxón. Existen bases de datos que sirven de patrón para comparar las cepas mediante análisis automatizado por ordenador. Dado que las proteínas son la expresión del ADN, la ventaja que tiene esta técnica es que la información que aporta podría reemplazar a la obtenida con la hib ridación ADN-ADN (v. capítulo 28). Esta prueba exige que la electroforesis y previ amente el cultivo bacteriológico, se hayan procesado en condiciones muy estandarizadas para que los datos que se obtienen sean fiables. También se utilizan en la identificación bacteriana otros parámetros químicos, entre ellos los análisis de ácidos grasos, de componentes de la pared celular, así como de los distintos tipos de peptidoglucanos (responsables de la coloración violeta de los gérmenes grampositivos), la presencia y distribución de enlaces peptídicos (específica de género o especie); el contenido en ácido teicoico de la mem brana celular y la investigación de isoprenoides quinonas en la membrana citoplas mática. Los caracteres fenotípicos reciben la influencia de distintas condiciones ambientales, por lo que los que se basan en estos caracte res pueden resultar menos sensibles y reproducibles que los métodos genotípicos. La expresión de un carácter fenotípico es el resultado de la interacción del genotipo con el ambiente y, por lo tanto, se puede ver modificado cuando las condiciones ambientales varían.

Los caracteres genéticos no se modifican por las condiciones ambientales, al contrario que los caracteres fenotípicos y, por lo tanto, los métodos genotípicos son más sensibles y reproducibles que los métodos fenotípicos.

Técnicas inmunológicas Las técnicas inmunológicas identifican los mi croorganismos por medio de la detección de sus antígenos. Tienen la ventaja de qu e son rápidas y aportan información sobre la infección antes de que crezca el cultivo e, incluso, en casos en que el cultivo (o la tinción) resulta negativo o el paciente ha recibido antimicrobianos. Existen actualmente pruebas de detección de patógenos de gran interés clínico, como N meningitidis (causante de meningitis), N gonorrhoeae (uretritis), agentes de diarrea (Clostridium difficile, enterobacterias pató genas), S. agalactiae (causante de sepsis neonatal) y s. pyogenes (causante de faringoamigdalitis aguda y otros cuadros clínicos graves). Su uso está muy extendido en el diagnóstico de las neumonías, ya que permiten la prescripción precoz de antimicrobianos en pacientes graves cuando se detectan antígenos de Legionella spp o s. pneumoniae en la orina de pacientes afectados. Actualmente, la mayoría de las bacterias de interés clínico se puede identificar por técnicas microbiológicas convencionales utilizando caracteres fenotípicos que requieren usualmente el aislado previo del microorganismo. Sin embargo, la identificación de microorganismos exigentes de crecimiento lento o incluso de los que no crecen en medios de cultivo, se puede beneficiar de las técnicas genéticas que se tratan en el capítulo siguiente.

e

Las técnicas inmunológicas identifican los microorganismos con la detección de sus antígenos específicos en la muestra.

PROTOCOLO DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACiÓN DE COCOS GRAMPOSITIVOS

Los cocos son bacterias redondeadas que se diferencian fundamentalmente por la forma de agruparse, en racimos o en parejas o cadenas. Los principales microorganismos que se agrupan en racimos son Staphylococcus y Micrococcus, que contienen catalasa y son capaces de crecer en cloruro sódico (CINa) al 5 %.

933

ERRNVPHGLFRVRUJ

•

• Los estafilococos crecen formando colonias de 2-3 mm, lisas y cremosas. Para clasificar Staphylococcus se determina la presencia de coagulasa:

Staphylococcus aureus es coagulasa positivo, además fermenta el manitol y crece formando colonias hemolíticas de color amarillo. Es un germen comensal y patógeno frecuente. Staphylococcus coagulasa negativo forma colonias de color blanco. En general produce infecciones iatrogénicas (derivadas de la actuación médica) yoportunistas (en pacientes inmunodeprimidos). Entre Staphylococcus coagulasa negativos, causan infecciones con mayor frecuencia S. epidermidis (productores de ureasa) y S. haemolyticus, que puede provocar bacteriemia, endocarditis e infección de partes blandas, así como infecciones relacionadas con la implantación de prótesis y catéteres. S. saprophyticus (resistente a novobiocina) produce infección del tracto urinario en mujeres jóvenes. S. lugdunensisse ha mostrado como causa de artritis y bacteriemias. Indique dos características de las pruebas inmunológicas.

• Los micrococos son gérmenes catalasa positivos, anaerobios obligados, de apariencia similar a estafilococos coagulasa negativos, con los que se pueden confundir. Pueden producir infecciones oportunistas en algunos pacientes, pero no son frecuentes. Los cocos que forman parejas o cadenas de distinta longitud (Enteroccus spp, Streptococcus spp, Leuconostoc spp, Lactococcus spp) no contienen catalasa; la mayoría son anaerobios facultativos y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con CO 2 (crecimiento capnofílico). Muchos de estos gérmenes son oportunistas y patógenos humanos y su identificación es importante para el tratamiento de distintas enfermedades infecciosas: • Los estreptococos son a veces difíciles de diferenciar y se clasifican según distintas propiedades: La capacidad de producir hemólisis completa en el medio (betahemólisis), hemólisis incompleta (alfahemólisis) y ausencia de hemólisis (gammahemólisis) La aglutinación a antígenos específicos (hidratos de carbono de la pared celular) (Tabla 68-3):

Tolerancia Microorganismo 8acitracina

Optocina

Streptococcus pyogenes

S

R

Streptococcus agalactiae

R

R

Streptococcus anginosus

R

R

Streptococcus dysgalactiae

R

R

Streptococcus pneumoniae

R

S

Grupo viridans

R

R

Hidrólisis del hipurato

Reacción CAMP

Solubilidad en bilis

PYR

Reacción VogesProskauer

+

+

+

+

+

PYR: L-pirrolidonil arilamidasa; R: resistente; S: sensible.

934

ERRNVPHGLFRVRUJ

Microbiología Clínica

MóduloVII

Tabla 68-4. Identificación de cocos grampositivos catalasa positivos Cata lasa

Aerobio esctricto

Oxidada

NaCl

+

+

+

+(5%)

+

-

-

+(6,5-%)

+

-

-

+(5-%)

Grupo de microorganismo

Micrococcus Alliococcus Staphylococcus

Propiedades bioquímicas: muchos estreptococos alfahemolíticos y no hernolíticos carecen de los antígenos de la pared celular específicos del grupo. Estos microorganismos requieren pruebas bioquímicas y/o de resistencia para su identificación. La mayoría de los estreptococos son PYR negativos, excepto S. pyogenes (que aglutina al grupo A de Lancefield) y alguna cepa de s. pneumoniae (que son sensibles a optoquina). No crecen a 10°C, lo que los distingue del género Lactococcus. Leuconostoc, patógeno ocasional, tiene la peculiaridad de ser resistente a vancomicina (antibiótico con actividad sobre gérmenes grampositivos en general). • Los enterococos (cocos entéricos) comparten el antígeno de los estreptococos D de Lancefield y estuvieron incluidos en este género hasta 1984. Los más importantes son Enterococcus faecalis y E. faecium. Son colonizadores intestinales y crecen formando colonias blanco-grisáceas bien visibles a las 24 horas. Son gérmenes móviles, capaces de crecer entre 10 y 45"C y que toleran concentraciones de NaCl del 6,5 %. Sus reacciones características son: PYR+, LAP+ yennegrecimiento de la bilis-esculina. La clasificación de las distintas especies exige la práctica de varias pruebas bioquímicas (fermentación, motilidad, producción de pigmento, etc.),

•

¿Qué característica Leuconostoc?

Los protocolos de identificación de los cocos grampositivos se muestran en las tablas 68-4 y 68-5 .

e

PROTOCOLO DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACiÓN DE COCOS GRAMNEGATIVOS

Incluye los géneros Neisseria, Eikenella y Kingella. Las especies N gonorrhoeae y N meningitidis son patógenos estrictos y causan , respectivamente, uretritis (infección de transmisión sexual), meningitis, bacteriemia y sepsis, entre otros cuadros clínicos graves. Neisseria se identifica como cocos gramnegativos aerobios que se disponen en parejas (diplococos); son achatados por los lados, lo que les confiere el aspecto de granos de café. Tienen metabolismo oxidativo, poseen oxidasa y se caracterizan por distintos requerimientos nutricionales para el crecimiento y la asimilación de carbohidratos

Tabla68-5. Identificación de cocos grampositivos catalasa negativos PYR

LAP

6,50/0 NaCl

BBE

Movilidad

45°C

+

+

+

+

+/-

+

-

-

-

-/+

10 -c

Resistencia a la vancomicina

Grupo de microorganismos

Enterococcus + -

Leuconostoc Streptococcus

*BBE: bilis esculina; LAP: leucina aminopeptidasa; PYR: L-pirrolidonil arilamidasa; R: resistente; S: sensible.

935

ERRNVPHGLFRVRUJ

•

•

Capítulo 68

Aplicación de técnicas de identificación bacteriana

Tabla 68-6. Características diferenciales de las especies de Neisseria más frecuentes Característica

N.gonorrhoeae

N. meningitidis

+/-

+/-

Crecimiento en: Medio agar chocolate/agar sangre Medio Thayer-Martin Medio Martin-Lewis (35 OC) Agar nutriente (35 OC)

+

+

-

Variable

+ -

-

+ + -

-

-

Ácido a partir de: Glucosa Maltosa Lactosa Sacarosa Fructosa

-

-

Reducción de nitratos

(Tabla 68 -6). Eikenella corrodens y Kingella kingae colonizan la bucofaringe y actúan como patógenos oportunistas, y producen endocarditis e infecciones en caso de mordeduras. K kingaese ha descrito como causa de artritis séptica en niños. Moraxella spp origina infecciones respiratorias.

e

PROTOCOLO DEAISLAMIENTO E IDENTIFICACiÓN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS AEROBIOS

La apariencia después de la tinción de Gram y las características macroscópicas de la colonia se utilizan para establecer una clasificación preliminar: • Los Bacillus se observan como bacilos esporulados con forma regular en la tinción. Son contaminantes frecuentes y productores ocasionales de patología como Bacillus anthracis (que se ha utilizado en actos de bioterrorismo). Siempre hay que procurar, ante la sospecha de este tipo de microorganismos, no manipular ni procesar la muestra y mucho menos el cultivo. • Listeriaspp son bacilos con forma regular y no formadores de esporas. Poseen catalasa y metabolismo fermentativo, crecen como colonias hemolíticas y tienen moviEs un germen frecuente en la flora lidad a temperatura ambiente, pero no a 35 ambiental, que sólo suele afectar a poblaciones muy definidas (embarazadas, recién nacidos, ancianos e inmunodeprimidos). • Los bacilos con forma irregular se pueden clasificar en:

oc.

¿Qué bacilo ha sido usado en bioterrorismo?

Corynebacterium spp: son catalasa positivos, se agrupan en la tinción en forma de letras chinas. Pueden ser patógenos, como Corynebacterium diphtheriae (agente de la difteria), o causar infecciones oportunistas, como Corynebacterium jeikeium. Gardnerella spp, causante de vaginosis bacteriana, tiene forma cocoide, es gram variable en la tinción e hidroliza el hipurato. Nocardia spp se muestra ramificada en la tinción; es parcialmente ácido-alcohol resistente y tiene un olor característico. Causa patología respiratoria y abscesos de partes blandas. Mycobacterium se caracteriza por ser ácido-alcohol resistente y crecer en medios específicos con morfología específica (como miga de pan en medio de Lowenstein-Jenssen). Mycobacterium tuberculosis es el microorganismo causante de la tuberculosis; que se contagia por inhalación, tiene especial trascendencia en pacientes inmunodeprimidos y cuando la cepa ha adquirido resistencia a antimicrobianos.

936

ERRNVPHGLFRVRUJ

e

PROTOCOLO DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACiÓN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS

El grupo de bacilos gramnegativos comprende un abanico muy amplio de microorganismos que, en principio, se clasifican según su capacidad para crecer en agar sangre. También se pueden clasificar agrupados según su morfología y sus propiedades de desarrollo con distintos sustratos, como azúcares o aminoácidos. Además, la asimilación de azúcares puede seguir la vía oxidativa (que produce ácido en la superficie del medio Kligler) o fermentativa (que forma ácido en el fondo del tubo con medio Kligler). También se utilizan en esta clasificación ot ras pruebas que se describen en las tablas 68-7, 68-8 y 68-9. Se determinan distintos microorganismos gramnegativos: • La familia Enterobacteriaceae (Tablas 68-7 y 68-8), en general, es el hallazgo más frecuente en los laboratorios clínicos de identificación bacteriana. Están ampliamente distribuidas en el tubo digestivo humano y de animales, y causan igualmente patología digestiva (Salmonella, Shigella), bacteriemia, sepsis y neumonía (Klebsiella pneumoniae). Escherichia coli es el germen más frecuentemente aislado en el laboratorio como causante de enfermedad, pero prácticamente todos los géneros están implicados en cualquier tipo de infecci ón: además de las anteriores, afectan a heridas, partes blandas, articulaciones, el trac to urinario, etc. Además, debido a la endotoxina (compuesta por lipopolisacáridos de la pared celular de estas bacterias) son capaces de producir shock tóxico. Por otro lado, estas bacterias son capaces de adquirir mecanismos de resistencia frente a los grupos de antimicrobianos más frecuen tes. • Los bacilos gramnegativos no fermentadores se refieren a los que no recurren a los hidratos de carbono como fuente de energía o bien utilizan una vía no fermentadora para degradarlos. Muchos de estos microorganismos tienen escasa virulencia, pero otros, como P aeruginosa, Burkholderia pseudomallei o Acinetobacter, pueden ser patógenos y causar infecciones relacionadas con circunstancias derivadas de la atención sanitaria, sobre todo en pacientes inm unodeprim idos. Es frecuente el hallazgo de estos microorganismos, que actúan como colonizadores de pacientes que han sido atendidos en unidades de vigilancia intensiva o en las de grandes quemados. • Entre los gérmenes gramnegativos que no crecen en agar sangre (se conocen como microorganismos exigentes) están Bordetella spp , cocobacilo causante de la tos ferina; Campylobacter spp y Helicobacter, bacterias curvas y oxidasa positivas patógenos digestivos; causan diarrea sanguinolenta (Campylobacter spp) y úlcera péptica e incluso cáncer gástrico (Helicobacter spp). Legionella spp es un bacilo gramnegativo capnófilo, de crecimiento específico en medio BCYE (buffered charcoalyeastextraen, débil productor de oxidasa y catalasa, se transmite por medio de aerosoles y causa neumonía atípica grave en pacientes inmunodeprimidos. Haemophilus spp, para su crecimiento requiere componentes especiales como hemina (factor X) y/o nicotinamida adenina dinucleótido (NAD; factor V); son asimismo bacilos gramnegativos pleomóficos y capnófilos, productores débiles de oxidas a, catalasa variables. Haemophilus spp causa patología respiratoria y sistémica (bacteriemia, meningitis, endocarditis) (Tabla 68-9).

e

¿Qué bacilo gramnegativo es el más frecuentemente aislado en el laboratorio?

OTRAS BACTERIAS DE IMPORTANCIA CLíNICA: BACTERIAS ANAEROBIAS. RICKETT5IA, CHLAMYDIA y MYCOPLA5MA

• Las bacterias anaerobias proliferan preferentemente en atmósfera libre de oxígeno. Se clasifican según su morfología en la tinción de Gram y por la presencia o ausencia de esporas, la resistencia a antimicrobianos como kanamicina y vancomicina, la posible inclusión de pigmento, el crecimiento en medios que contienen bilis y por otras 937

ERRNVPHGLFRVRUJ

(,.)

-o

Morfología celular

Pseudomonas stutzeri

Vibrio

Grupo de microoganismos

Bacilos

Nitrato de agua

Burkholderia pseudomallei

Fermenta la lactosa, trealosa o xilosa

Bacilos

Urea

Crecimiento en medio MacConkey

Burkholderia cepacia complex

Arginina desearboxilasa

Bacilos

Lisina desearboxilasa

Bacilos

Polimixina B

Pseudomonas aeruginosa, Pfluorescens, Pputida

Pigmento fluorescente

Enterobacteriaceae

Oxidación de la glucosa

Bacilos

Movilidad

Fermenta la sacarosa

Pasteurella, Actinobacillus

Oxidasa

6% ClNa

. ......

Bacilos

Colonias pigmentadas

,w...

Aeromonas, Plesiomonas

Fermenta la glucosa

.......

Bacilos

HGLFRVRUJ Bacilos

00

Módulo VII

Microbiología Clínica

Tabla 68-8. Pruebas bioquímicas básicas para la identificación de enterobacterias Krigler Modificación delpH

Gas

HzS

AlA

+

Shigellaspp

AlelA

S.somnei

RM

VP

Indol

Cit

PAD

Ureasa

Mot

Lisina

Arg

Orn

ONPG

-

+

-

+

-

-

-

+

+

-1+

+1-

+

-(*]

-

+

-

-1+

-

-

-

- (*]

-

-

-

-

AlelA

- (*]

-

+

-

-

-

-

-

- (*]

-

-

+

+

E. tarda

AlelA

+

+(*]

+

-

+

-

-

-

+

+

-

+

-

Salmonella spp

AlelA

+

+(*]

+

-

-

+

-

-

+

+

+1-

+

-

C. freundii

AlA :AlelA

+

+(*]

+

-

-

+

-

+1-

+

-

+1-

-1+

+

C. koseri

AlelA

+

-

+

-

+

+

-

+1-

+

-

+1-

+

+

K. pneumoniae

AlA

++(*]

-

-

+(*]

-

+

-

+

-(*]

+

-

- (*]

+

K. oxytoca

AlA

++(* ]

-

-

+(*]

+

+

-

+

-(*]

+

-

-(*]

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E. aerogenes

AlA

++(*]

-

-

+(*]

-

+

-

-

+

+

-

+

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E. cloacae

AlA

++(* ]

-

-

+(*]

-

+

-

+1-

+

-

+

+

+

H. alvei

AlelA

+

-

-1+

+(*]

-

-

-

-

+

+

-

+

+

P. aglomerans

AlA: AlelA

-/+

-

-1+

+1-(*]

-/+

+1-

-1+

-/+

+

-

-

-

+

S. marcescens

AlelA

+

-

-/+

+(*]

-

+

-

-

+

+

-

+

+

P. vulgaris

AlelA

+1-

+(*]

+

-

+

-1+

+(*]

++(*]

+

-

-

-

-

P. mirabilis

AlelA

+

+(*]

+

+/-

-

+/-

+(*]

++(*]

+

-

-

+

-

M. morganil

AlelA

+

-

+

-

+

-

+(*]

++(*]

+

-

-

+

-

P. rettgeri

AlelA

-

-

+

-

+

+

+(*]

++(*]

+

-

-

-

-

P. stuartii

AlelA

-

-

+

-

+

+

+( *]

-1+

+/-

-

-

-

-

P. alcalífacins

AlelA

-l-

-

+

-

+

+

+(*]

-

+

-

-

-

-

y. enterocolitica

Ale/A

-

-

+

-

+1-

-

-

+1-

-(§]

-

-

+

+

E. colí

H2S: Sulfuro de hidrógen o; RM : rojo de metilo; VP: Voges -P rosk a uer ; Cit: citra to; PAD : feni la lanina desamin asa; Mot: motilidad; Arg: a rginina ; Orn: ornitina ; ONPG: O - n i tro fen i l- ~-D-ga lac topi ra nó s i do; ++: reacción positiva fuert e; + : ~ 90% ce pas positivas; -: ~ 90% cepas neg ativas; +/ - : 50-9 0% cepas positivas; -l«. 50-90% cepas negat ivas; 1*] : reacción clave ; I§]: inmóviles a 36 "C, móviles a 22 oC; Alc: alcalino , desa rrolla color rojo; A: ácido , desa rrolla color ama rillo.

pruebas, que se describen en la tabla 68-10 . Las bacterias preferentemente anaerobias conforman un grupo de microorganismos muy diverso, que es parte de la flora habitual del organismo humano. El grupo Bacteroides fragilis participa en la flora abdominal y está implicado en algunas infecciones de esta región. Prevotella y Porphyromonas están presentes en la flora de la boca y de la región perineal y son causa de infecciones de estas regiones. Fusobacterium spp coloniza la boca, la región genital y el tracto respiratorio y se aísla en abscesos preferentemente en la región tor ácica. Clostridium spp incluye especies anaerobias estrictas y otras aerotolerantes. Forman parte de la flora intestinal y su papel en la producción de infecciones se favorece en personas inmunodeprimidas; Clostridium perfringens produce infección de heridas, mionecrosis (gangrena gaseosa) bacteriemia, neumonía por aspirac ión, abscesos, etc., así como intoxica939

ERRNVPHGLFRVRUJ

•

Tabla 68-9. Identificación de bacterias gramnegativas con escaso o nuLo crecimiento en agar sangre Sólo crecimiento en

Crecimiento en agar sangre

Requerimiento

Colonia excelente

Oxidasa

Grupo de microorganismos

Morfología celular

Urea

Pobre

Cocos pequeños

+

Pobre

Cocos pequeños

-

+

Pobre

Bacilos

-

-

+

Bartonella

Pobre

Bacilos

-

+

-

Eikenella

Pobre

Bacilos

-

+

-

Kingella Capnocytophaga

X± NAD

Brucella Bordetella

Nulo

Chocolate

Bacilos fusiformes

-

-

-

Nulo

Chocolate

Bacilos

-

-

-

+

Haemophillus

Nulo

BCYE*

Bacilos gramnegativos alargados

-

-

-

-

Legionella

* BCYE: agar extracto de levadura tamponada; NAO: nicotinamina adenina dinudeótido; X: hemina.

ciones alimentarias. C. difficile provoca colitis seudomembranosa en pacientes hospitalizados en tratamiento con antibióticos. C. septicum causa bacteriemia en pacientes diabéticos. C. botulinum causa botulismo por la ingestión de alimentos contaminados (p. ej., conservas en mal estado) que provoca una parálisis fláccida muy grave. C. tetani produce el tétanos por la contaminación de heridas y se manifiesta con convulsiones espásticas, a diferencia del botulismo, en que por contrario se manifiesta con parálisis fláccida, como se ha dicho. • Rickettsia, Chlamydia y Mycoplasma son microorganismos intracelulares, es decir, que para dividirse es necesario que se encuentren dentro de una célula. Chlamydia produce neumonías comunitarias ( Chlamydophila pneumoniae y Chlamydia psittaci,

~~r!1

.... -... ..

.-

1111 .!..lSI

Crecimiento en BBE

Bacilos o cocos

-

t

R/R

Bacilos o cocos

-

t

SiR

Bacilos o cocos

-

-

R/S

Bacilos o cocos

-

-

-

Bacilos o t/variable cocos Bacilos o t/variable cocos Cocos

-

•

.. .. ..

LO

-

Tolerancia Pigmento o adiscos de fluorescencia kanamicina y roja vancomicína

Tinción de Gram

Morfología celular

..

..

..

Nitrato

.-

"Ir:~

Catalasa

Colonias Formación de grandes, esporas crecimiento irregular

Bacilos con forma de vagoneta, betahemólisis

Grupo de microoganismo

Grupo 8acteroides fragilis

Grupo Fusobacterium

-

-

t/-

-

-/t

R/R

t/-

-

-

SiR

-

-

-

No frecuente

S/S

-

t/-

-

t

SiR

t

motiferum/varium Porphyromonas

Prevotella

* B BE: bilis esculina; R: re sistente; S: sensible .

940

ERRNVPHGLFRVRUJ

-

t

Lactobacillus

t

Clostridium perfringens Veillonella

Módulo VII

Microbiología Clínica

que produce neumonías en pacientes que conviven o se han relacionado con periquitos, loros y otras aves). C. trachomatis es responsable de una alto porcentaje de uretritis no gonocócica, que provoca importantes secuelas, como infertilidad en mujeres.

- Micoplasma no se colorea con la tinción de Gram, ya que carece de pared celular (puede teñirse con Giemsa). Causa patología genital (M. hominis y Ureaplasma urealyticum). M. pneumoniae produce neumonía atípica, sobre todo en niños.

Rickettsia causa zoonosis, ya que se transmite por picadura de artrópodos y provoca fiebre exantemática (lesiones enroj ecidas en la piel). Su pared tiene una estructura similar a la de organismos gramnegativos. Diferentes especies de Rickettsia parasitan animales (huéspedes) que se convierten en vectores, que dependen de su región geográfica. La especie que habita en Europa es R. conori. Se puede mantener viable en cultivos celulares. Coxiella spp es un cocobacilo con pared tipo gramnegativo, intracelular obligado (vive en los macrófagos). Se transmite por aerosoles y se considera una zoonosis. Se conocen más de 40 especies y Coxiella burnetii produce la fiebre Q, de distribución mundial. Las infecciones por anaerobios suelen ser polimicrobianas y de origen endógeno, es decir, están causadas por la flora propia del individuo. Por la dificultad que entraña el cultivo de estos gérmenes, el diagnóstico se suele efectuar con técnicas serológicas y métodos geno típicos (v. capítulo 69).

No debo olvidar que... •

La identificación rutinaria se realiza en los laboratorios de modo convencional con el análisis de las características fenotípicas, es decir, morfológicas, fisiológicas, químicas y bioquímicas.

•

Los métodos fenotípicos han de ser interpretados como orientativos y deben ser confirmados para obtener la iden tificación definitiva. Es necesario controlar estrictamente los factores am bientales que pueden influir de forma decisiva en el cultivo.

•

Una mala interpretación de las pruebas pr im ar ias puede conducir a una identificación errónea, a una mala información al clínico y a un probable mal diagnóstico para el paciente.

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Capítulo 68

Aplicación de técnicas de identificación bacteriana

Preguntas de repaso

Caso práctico

1. ELegir La respuesta incorrecta. La identificación fenotípica de un microorganismo se basa en: a. Caracteres morfológicos. b. Detección de ácidos nucleicos específicos de un agente infeccioso en una muestra clínica. c. Propiedades fisiológicas. c. Composición química.

2. En un paciente con neumonía grave, eLclínico necesita prescribir rápidamente un tratamiento antimicrobiano. ¿Qué técnicas podrían orientar aL diagnóstico y, por Lo tanto, aL tratamiento?: a. b. c. d.

Microscópicas. Inmunológicas. Hibridación con sonda. Cualquiera de ellas es correcta.

Un paciente de 20 años acude a urgencias por dolor abdominal periumbilical, que comenzó 3 días atrás con náuseas y vómitos. Tras el interrogatorio y la exploración, para el médico de guardia no queda clara la causa del cuadro clínico, por lo que ingresa al joven en observación. Desde entonces el dolor se ha localizado en la fosa ilíaca derecha, por lo que decide llamar al cirujano de guardia. Cuando el especialista explora al paciente, le d iag nostic a ape nd i citi s aguda y de cid e i nt erve n ir lo qu i rú rg ica me nte. Du ra nte la intervención se observa que el apéndice aparece perforado y que se ha acumulado líquido libre en la cavidad abdominal. El cirujano decide tomar muestras de ese exudado y enviarlas al laboratorio. .. ¿Qué flora se debe recuperar en el cultivo? ., ¿Qué medios de cultivo se deben utilizar? 41)

e

Si pasadas 24 horas aparece crecimiento de microorganismos ¿Cómo se debe plantear la identificación de los distintos microorganismos?

BIBLIOGRAFíA

Bou G, Fernández A, García C, Sáez JA, Valdezate S. Procedimientos en microbiología clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. 20 10. Humes R, Snyder JW Laboratory detection of potential agents ofbioterrorism. En: Murray PR, Baron ES, Jorgensen JH, Landry ML, pfaller MA (Eds.). Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Washington, DC: ASM Press, 2007; 107-17. Koneman E~ Allen S. Koneman Color Atlas and Texbook of Diagnostic Microbiology. óth ed. USA: Ed. Lippincort Williams & Wilkins, 2006. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaüer IA. Microbiología Médica. Madrid: Elsevier, 2006. Murray PR, Shea Y.ASM pocket guide to clinical microbiology. 3th ed. Washington: American Society for Microbiology, 2004; 175.

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ndice de contenidos •

Introducción

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Técnicas de identificación mediante análisis del qenorna

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Análisis epidemiológico

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Vocabulario relacionado

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identificación genotípica rganismos. Análisis epidemiológico

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INTRODUCCiÓN

Los métodos de identificación se clasifican actualmente en dos grandes grupos: fenotípicos (v, capítulo 68) y genotípicos. La identificación genotípica se basa en el estudio de los ácidos nucleicos de los microorganismos. Detectan en una muestra clínica el rastro del ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o las proteínas de un agente infeccioso, de forma que se puede conseguir identificar ese agente incluso aunque no se haya podido aislar. La mayor ventaja de estos métodos reside en la estabilidad de los marcadores genéticos que emplean y en la posibilidad de su aplicación para distintos géneros y especies de microorganismos de modo universal. Actualmente se dispone de técnicas seguras, sensibles y específicas que han hecho que los laboratorios de microbiología reduzcan el trabajo de investigación que depende directamente de los cultivosy hayan podido ampliar las expectativas de diagnóstico y los estudios epidemiológicos de las enfermedades infecciosas.

e

TÉCNICAS DE IDENTIFICACiÓN MEDIANTE ANÁLISIS DEL GENOMA

Técnicas de detección de ácidos nucleicos El principio básico de las técnicas moleculares es la localización de una secuencia de ADN o ARN (diana) por hibridación con un a secuencia complementaria (sonda), seguida de la detección de ese híbrido (señal) po r técnicas de análisis instrumental. Hay dos tipos de técnicas: aquellas en que el híbrido no se amplifica antes de la detección y las que se basan en la amplificación de ese híbrido.

• • • • •

Identificación genotípica Amplificación Análisis epidemiológico Infección nosocomial ARNr 165

Un microorganismo se puede tipificar según sus caracteres fenotípicos o sus caracteres genotípicos [que se refieren a los ácidos nucleicosJ.

Técnicas sin amplificación de ácidos nucleicos Las sondas de ADN se pueden utilizar como se hace con los anticuerpos específicos para detectar, localizar y cuantificar determinadas secuencias de ácidos nucleicos en muestras clínicas. La creación de sondas de ADN se efectúa por clonación de los fragmentos genómicos específicos (v, el capítulo 28) o a través de un genoma vírico completo utilizando vectores bacterianos. Para conseguir copias de ADN de los virus ARN se utiliza una transcriptasa inversa retrovírica. Las sondas de AD N son capaces de detectar secuencias genéticas específicas en muestras de biopsias tisulares, pero tienen escasasensibilidad y por ello se utilizan de forma preferente cuando el inóculo de la muestra es alto (Chlamydia trachomatis en exudado cervical) o para confirmar cultivos una vez han crecido y con ello agilizar los resultados. Desde que se ha llegado a conocer el genoma completo de muchos microorganismos, la hibridación con sondas se ha desarrollado con los chips o arrays de ADN, una serie de sondas deADN que van adheridas a un soporte sólido en el que ocupan una disposición determinada. El ácido nucleico diana (AD N o ARN) se marca con un fluo-

El objetivo de las técnicas moLecuLares es la identificación de un microorganismo mediante la localización de una secuencia de su ADN o ARN por medio de la hibridación con una secuencia complementaria conocida y la detección posterior de ese híbrido.

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•

Capítulo 69

Técnicas de identificación genotípica de microorganismos. Análisis epidemiológico

róme ro o un isótopo radiactivo antes de proceder a la hibridación y posteriormente se revela en la reacción. Esta técnica permite procesar a la vez miles de genes y, por lo tanto, su evolución se ha visto condicionada a un tratamiento estadístico informatizado de los datos. La técnica LiPA (lineprobe assay), de uso extendido, es de este tipo. Se usa para identificar especies de distintas bacterias (Brucella spp) Streptococcus spp, Campylobacter spp, Helicobacter pylori, Mycobacterium spp, etc.) e incluso para la detección directa de bacterias en hemocultivo, antes de que crezca el microorganismo aislado.

Técnicas con ácidos nucleicos con amplificación de La señaL, la diana o La sonda ¿Qué utilidad tiene la técnica

LiPA?

Las técnicas con amplificación de la señal consiguen incrementar su sensibilidad aumentando la concentración de la molécula marcadora que, al unirse al ácido nucleico diana, aumenta la capacidad de detección. Tiene la ventaja de que no se altera la cantidad de moléculas diana y, por lo tanto, la señal emitida es proporcional a la concentración de moléculas diana original y se evitan las contaminaciones que afectan al proceso de amplificación de la diana. Estas técnicas se utilizan para desarrollar estudios cuantitativos. Un ejemplo de las técnicas de amplificación de señal es la hibridación con captura de híbridos, en la que el híbrido formado se conjuga con fosfatasa alcalina y emite una señal quimioluminiscente que se registra en un luminómetro. Del mismo modo, los análisis con ADN ramificado (branched-DNA, b-ADN) son útiles para la detección de pequeñas cantidades de secuencias específicas de ARN o ADN: la muestra se incuba en un tubo revestido de una secuencia corta deADN complementario (ADNc) capaz de capturar el ARN de la diana; en un paso posterior se agrega una cadena AD N artificialmente ramificado, capaz de enganchar al híbrido ARN-ADN que se ha formado previamente, que resulta en un complejo que emite una potente señal revelada por un sustrato quimioluminiscente. Esta señal se cuantifica en un luminómetro, como en el caso de la hibridación. Las técnicas con amplificación de la diana (el ácido nucleico que se estudia) se realizan mediante un proceso enzimático que copia la diana con el propósito de multiplicar el ácido nucleico y detectarlo posteriormente. La reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction, PCR) amplifica copias simples, una vez separadas las dos hebras de ADN (diana), en varios millones de veces. En esta técnica (Fig. 69-1) se incuba la muestra con dos aligó meros cortos de ADN (cebadores o iniciadores; primers, en inglés) que contienen las secuencias complementarias a las de los extremos de un segmento conocido del ADN, a los que se añade una polimerasa de ADN dotada de estabilidad térmica a altas temperaturas, así como nucleótidos y tampones. Cuando se produce la reacción, los oligómeros se hibridan con su secuencia complementaria de ADN y actúan como cebadores (iniciadores), para que reaccione la polimerasa y copie ese segmento de ADN. A continuación se calienta la muestra para desnaturalizar el ADN (separar las cadenas de doble hélice formadas por la polimerasa) y se enfría de inmediato, con lo que se consigue la hibridación de los cebadores con el nuevo ADN (formado en el ciclo anterior). Cada copia de ADN formado funciona como patrón para la síntesis de nuevas cadenas. El proceso se repite un gran número de veces (de 20 a 40 veces), de forma que se consigue amplificar la secuencia del ADN original exponencialmente. El desarrollo de la PCR ha dado lugar a distintas modificaciones de la técnica. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), una variante de la PCR convencional, utiliza la transcriptasa inversa de los retrovirus para convertir el ARN mensajero en ADN, en un paso previo a su amplificación por PCR. La PCR múltiple es capaz de detectar y amplificar simultáneamente, en un único tubo, distintas secuencias específicas de la muestra y, por lo tanto, diferentes microorganismos, lo cual incrementa la complejidad de la técnica y el riesgo de contaminación; se usa en la detección e identificación de enterobacterias (resulta de gran interés la detección de toxinas en Escherichia coli O 157:H7, causante de la diarrea enterohe-

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Microbiología Clínica

Módulo VII

... Figura 69-1. Representación esque 5'

3' Muestra ADN objetivo

3'

1

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mática de la reacción en cadena de la polime rasa (PCRl. AON: ácido desoxirribonucleico.

Desnaturalización

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Se repite el ciclo 5' 3'

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Cadenas sintetizadas

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- \ / =''> =. 800/0). • Epididimitis aguda. Generalmente, se trata de una infección secundaria al paso de microorganismos desde la uretra prostática, a través de la vía del conducto deferente. El cuadro clínico habitual cursa con fiebre y dolor en el hemiescroto, que aumenta de tamaño. El diagnóstico microbiológico se basa en el cultivo de orina. En hombres menores de 40 años el microorganismo causante que predomina es Chlamydia trachomatis; en hombres mayores de 50 años las infecciones suelen ser secundarias a un proceso obstructivo o a instrumentación uretral (p. ej., sonda) y están provocadas por enterobacterias. El tratamiento incluye antimicrobianos activos frente a enterobacterias capaces de alcanzar altas concentraciones del fármaco en el parénquima testicular y epididimario. • Bacteriuria asintomática. Se define como la presencia de más de 100.000 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL en dos muestras de orina en ausencia de sintomatología clínica. Recuentos muy elevados pueden persistir durante años sin que el paciente manifieste síntomas urinarios, que se acompañan de piuria en el 30% de mujeres jóvenes sanas, el 500/0 de las embarazadas, el 750/0 de las diabéticas y en el 90 % de los ancianos.

Infecciones del sistema nervioso central La manifestación clínica inicial de las infecciones del sistema nervioso central puede ser aguda, sub aguda o crónica y depende de la etiología, la virulencia del microorganismo y la localización del proceso infeccioso. Los agentes infecciosos pueden invadir los órganos diana por vía hematógena, a partir de un foco infeccioso cercano, o pueden proceder de intervenciones neuroquirúrgicas. • Meningitis. Se define como la inflamación de las leptomeninges. Las meningitis bacterianas agudas están producidas por microorganismos piógenos. Las bacterias más frecuentes en los recién nacidos son Streptococcus agalactiae, E. coli y Listeria monocytogenes; en niños y adolescentes son las del grupo de los meningococos; en adultos mayores de 30 años los neumococos y en mayores de 50 años e inmunodeprimidos se debe considerar también L. monocytogenes. Además, distintos virus pueden causar meningitis y meningoencefalitis agudas. Los enterovirus (de predominio estacional) y los herpesvirus son los más frecuentes; en pacientes inmunodeprimidos pueden existir formas de presentación más crónicas de meningoencefalitis producidas por virus como, por ejemplo, citomegalovirus. • Absceso cerebral. Es un proceso supurativo que se localiza en el parénquima cerebral y suele producirse a partir de la extensión de un foco infeccioso contiguo o bien por vía hematógena. Suele proceder de una flora bacteriana mixta en la que se deben sospechar diversos microorganismos aerobios, estreptococos (Fig. 71-2) y anaerobios.

Enfermedades de transmisión sexual

.. Figura 71-2. Cadena de Streptococcus.

• Uretritis y cervicitis. La uretriris gonocócica se produce por Neisseria gonorrhoeae. Las uretritis no gonocócicas pueden estar causadas por diferentes agentes, como C. trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, virus del herpes simple (VHS) , Trichomonas vaginalis, Candida, enterobacterias, Treponema pallidum o el virus del papiloma humano. Los agentes causales más frecuentes de cervicitis son C. trachomatis, N gonorrhoeaey M genitalium.

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Microbiología Clínica

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Módulo\/11 J

• Úlceras genitales. Las causas más frecuentes de estas infecciones son el VHS y

T. pallidum.

Infecciones osteoarticulares En particular, se refieren a artritis y osteomielitis: • Artritis séptica. Artritis infecciosas que producen bacterias piógenas, capaces de originar una rápida destrucción articular. Staphylococcus aureus es el microorganismo que se aísla con más frecuencia y la localización anatómica habitual es la rodilla. El diagnóstico se basa en el análisis urgente del líquido articular y de su cultivo en medios aerobios y anaerobios. Los hemocultivos son positivos en el 50-70% de los casos. • Osteomielitis. Es una infección que afecta a la cortical, la médula o ambas estructuras del hueso. Actualmente, se ha observado un incremento de su incidencia en relación con el aumento de pacientes politraumatizados, de pacientes diabéticos y sometidos a cirugía ortopédica. Se puede producir por infección de cualquier microorganismo, aunque lo más frecuente es que su etiología sea bacteriana, con un claro predominio de cocos grampositivos, siendo S. aureus el agente más frecuente.

Staphylococcus epidermidis es el microorganismo más frecuente en las formas asociadas a i n t e rve n c ion es q u i r ú r g i c a s con material de osteosíntesis y artroplástico.

Infecciones de la piel y tejidos blandos Incluyen todas las infecciones que afectan a la piel, los anejos cutáneos, el tejido celular subcutáneo, fascias y músculo estriado. Pueden producirse por una amplia variedad de microorganismos que forman parte de la microbiota de la piel y de las mucosas, pudiendo también proceder del medio ambiente. Su diagnóstico es habitualmente clínico y se reserva el diagnóstico microbiológico para los casos complicados.

Infecciones oculares • Conjuntivitis. Su etiología más común es vírica y suele tener un curso autolimitado, que por lo general no requiere pruebas para establecer el diagnóstico etiológico. Los virus más frecuentes son adenovirus, virus respiratorios y herpesvirus. Entre las causas bacterianas los agentes etiológicos más habituales son S. aureus, S. pneumoniae, Streptococcus pyogenes y H influenzae. • Queratitis. Es una infección del epitelio y de otras capas de la córnea. La mayor parte están causadas por bacterias, como estafilococos coagulasa negativos, enterobacterias y Pseudomonas spp. • Endoftalmitis. Es la inflamación de los fluidos y tejidos intraoculares producida por microorganismos que pueden alcanzar el globo ocular por inoculación directa o por diseminación hematógena, que suele conducir a la pérdida total o parcial de la visión. • Uveítis o coriorretinitis. M. tuberculosis, T.pallidum y Borreliaburgdorferi pueden causar coriorretinitis, igual que otros virus como el VHS (virus herpes simple). • Blefaritis. Se trata de una infección del párpado que puede afectar al margen anterior o a las glándulas de Meibomio. Las bacterias que se aíslan incluyen S. aureus, S. epidermidis, Propionibacterium acnes y corinebacterias. También se han encontrado hongos, como Pityrosporum, y parásitos como Demodexfolliculorum.

Las infecciones oculares más frecuentes suelen ser de origen vírico.

Endocarditis La endocarditis es una infección de causa bacteriana, siendo su origen fúngico menos frecuente. Se localiza en el endocardio, especialmente en la superficie valvular. Existen distintas formas con características clínicas, etiológicas y pronósticas diferentes que incluyen endocarditis sobre válvula nativa, endocarditis sobre válvulas protésicas y endocarditis sobre electrodos de marcapasos y desfibriladores implantables. El agente etiológico más frecuente es S. aureus, seguido por otros como Streptococcus coagulasa negativos, S. viridans, S. bovisy Enterococcus. 975

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Patología infecciosa humana por aparatos

Mononucleosis infecciosa y síndromes similares La mononucleosis infecciosa es un síndrome causado en la mayoría de los casos por el virus de Epstein-Barr (VEB). Su contagio se produce por vía salival y coloniza primero las células de la orofaringe, que provoca un síndrome general al diseminarse por todo el cuerpo. La sintomatología más frecuente es la tríada clásica que incluye fiebre, que puede ser persistente (10-14 días), faringitis (faringe eritematosa con exudado pultáceo, muy dolorosa) y adenopatías cervicales posteriores, occipitales (más frecuentes) o retroauriculares de características inflamatorias (dolorosas a la presión y no adheridas). La sospecha debe ser clínica, aunque diversas pruebas de laboratorio pue den ayudar a confirmar el diagnóstico. El tratamiento en la mayoría de las ocasiones es simplemente sintomático. Indique la di ferencia entre artritis séptica y osteomielitis.

Sepsis La sepsis se define como la respuesta inflamatoria sistémica frente a la infección. La enfermedad y sus secuelas se manifiestan como estadios progresivos de un mismo proceso, en el que la respuesta sistémica a la infección da lugar a una reacción inflamatoria generalizada e induce disfunción multiorgánica. Para comprender este síndrome es necesario exponer una serie de conceptos básicos, que han sido establecidos en las Conferencias de Consenso (ACCM-SCCM), que incluyen:

• Infección. Proceso patológico consistente en la reacción inflamatoria del orga nismo, debido a la presencia de gérmenes patógenos. • Bacteriemia. Presencia de bacterias en la sangre. • Septicemia. Presencia de microorganismos o toxinas derivadas de ellos en la sangre. • Síndrome de la reacción inflamatoria sistémica (SRIS). Comprende dos condiciones o más de las cuatro siguientes: - Fiebre (temperatura oral > 38 OC ) o hipotermia (temperatura oral < 36 OC). - Taquicardia (> 90 latidos por minuto). - Taquipnea (> 24 respiraciones por minuto) o hiperventilación (presión parcial arterial de dióxido de carbono < 32 mm Hg) o necesidad de ventilación mecá ruca, - Leucocitosis (> 12.000/mm 3) , leucopenia «4.000/mm 3) o > 100/0 de formas juveniles en el recuento de leucocitos.

La sepsis es la respuesta inflamatoria sistémica frente a la infección.

• Sepsis. Forma de SRIS de etiología infecciosa. • Sepsis grave. Sepsis con disfunción de un órgano o sistema o más de uno. La sepsis puede estar causada prácticamente por cualquier microorganismo patógeno. En los últimos años han predominado los hallazgos de bacterias grampositivas. Las infecciones polimicrobianas, las producidas por gérmenes multirresistentes y las causadas por hongos también han adquirido gran protagonismo. Los virus y los parásitos ocasionan un pequeño porcentaje de los casos y en torno a un tercio de pacientes no se logra determinar el microorganismo responsable de la sepsis. En cuanto al origen anatómico, la gran mayoría de casos de sepsis son secundarios a infecciones pulmonares, abdominales o del aparato genitourinario.

e

MICROORGANISMOS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS

Estructura genética Si se atiende a la estructura genética de los agentes infecciosos, se puede distinguir entre organismos celulares y acelulares. Los organismos celulares se caracterizan por contar con una membrana plasmática y su material genético está constituido por 976

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Microbiología Clínica

cadenas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) simultáneamente; los organismos acelulares son parásitos obligados que precisan servirse de otras células para realizar sus funciones vitales, y su material genético está constituido por un único tipo de ácido nucleico (ADN o ARN). Entre los organismos celulares se pueden diferenciar: • Organismos eucariotas. Su estructura celular está constituida por la membrana citoplasmática (una bicapa lipídica, compuesta por proteínas, fosfolípidos y esteroles, que actúa como membrana Íimitante y como barrera osmótica), por el citoplasma (contiene organelas y dispone de estructura reticular o citoesqueleto) y por el núcleo (que contiene el material genético y está separado del citoplasma por la membrana nuclear; su ADN está organizado en un mínimo de dos cromosomas, compuestos por filamentos en doble hélice de ADN y cada cadena posee uniones proteicas y de histonas). • Organismos procariotas. Son estructuras celulares más simples, que no están divididas en compartimentos y no poseen núcleo verdadero. Constan de pared celular (que da forma a la célula y evita la lisis osmótica y la acción de agentes externos nocivos), membrana citoplasmática, citoplasma (sin organelas, donde se distinguen granulaciones submicroscópicas o ribosomas) y un nucleoide sin membrana que contiene el material hereditario (ADN cromosómico), que se conforma por un único cromosoma en cuyas cadenas no hay histonas. Además, inmerso en el citoplasma se encuentra ADN extracromosómico, enrollado en forma circular que contiene información genética para la síntesis de sustancias no indispensables.

Según la estructura genética de los agentes infecciosos se distingue entre organismos celu-

lares y acelulares.

Principales agentes infecciosos Como se expone de forma más exhaustiva en el capítulo 33, las características fundamentales de los principales agentes infecciosos son las siguientes:

Indique dos criterios para diagnosticar un SRIS.

• Bacterias. Microorganismos procariotas, unicelulares, de tamaño microscópico, con capacidad de reproducirse y que se caracterizan porque disponen en su estructura de dos ácidos nucleicos, una membrana celular, enzimas, proteínas complejas y estructuras especializadas. • Virus. Agentes infecciosos de estructura elemental, que se comportan como parásitos intracelulares estrictos y que se diferencian de bacterias y eucariotas porque no tienen una organización celular. Están compuestos por una sola molécula de ácido nucleico (ARN o ADN), que codifica la información genética para su replicación (suministra la información para programar, en la célula huésped, la síntesis de sus propios componentes). • Priones. Partículas proteicas sin ácidos nucleicos pero capaces de transmitirse y de transformar proteínas normales en patológicas. • Hongos. Microorganismos unicelulares o pluricelulares, de estructura celular eucariota, heterótropos, aclorófilos y de metabolismo absortivo. Tienen paredes celulares rígidas, su citoplasma contiene organelas y poseen un núcleo verdadero con varios pares de cromosomas, que transmiten su material genético en reproducción sexuada o asexuada. • Parásitos. Organismos unicelulares o pluricelulares que de manera temporal o permanente viven a expensas de otro organismo de distinta especie, el huésped, al que pueden producir daño y con el que tien en una dependencia unilateral.

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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

El diagnóstico microbiológico se puede definir como el conjunto de procedimientos y técnicas complementarias que se emp lean para establecer la etiología del

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~.

Capítulo '71

El conjunto de procedimientos y técnicas complementarias que se emplean para establecer la etiología del ag ente responsable de una enfermedad infecciosa se conoce como diagnóstico microbiológico.

Patología infecciosa humana por aparatos

agente responsable de una enfermedad infecciosa. Incluye técnicas para conseguir el aislamiento y la identificación de los microorganismos que causan la enfermedad y la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos, así como procedimientos encaminados a la detección de anticuerpos, antígenos y ácidos nucleicos en diversas muestras que faciliten el diagnóstico precoz. En general, se puede diferenciar entre métodos directos (implican la demostración del agente patógeno, sus metabolitos o alguno de sus componentes antigénicos en los fluidos orgánicos del paciente) y métodos indirectos (implican la demostración de la huella que el agente patógeno ha dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del paciente).

e

Elestudio microscópico en fresco y tras la tinción de una muestra permite apreciar las formas, la manera de agruparse, la estructura y el tamaño de las células, que proporciona una orientación diagnóstica.

estras

La obtención de la muestra clínica adecuada (esputo, sangre, heces, tejidos, etc.) constituye el primer paso del diagnóstico microbiológico y su elección depende de las sospechas clínicas. Para ello se siguen una serie de protocolos estandarizados de proce dimientos para la obtención de muestras que se deben cumplir correctamente, así como los imprescindibles requisitos de calidad (correcta identificación de la muestra, cantidad adecuada para el estudio que se solicita , condiciones apropiadas de transporte y conservación, etc.) que permitan el procesamiento óptimo.

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En los exámenes en fresco (Fig. 71-3) se pueden visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teñirlos y son especialmente relevantes en las infecciones parasitarias. En ocasiones, para diferenciar los microorganismos es necesario aumentar el contraste respecto al medio en que se encuentran. Para ello se utilizan tinciones, que pueden ser simples cuando emplean un solo colorante o diferenciales cuando se usa más de uno y se tiñen específicamente distintas estructuras bacterianas. Algunas de las.más importantes son:

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a 7 -3. Examen en fresco.

Tinción de Gram. Es una tinción diferencial que distingue entre bacterias con pared gruesa (grampositivas) y bacterias con pared fina y membrana externa (gramnegativas). Esta prueba utiliza violeta de genciana como colorante primario. Posteriormente, la aplicación de una mezcla de alcohol y acetona elimina el violeta , excepto en las bacterias con pared gruesa . Finalmente, el colorante secundario o de contraste, la safranina, tiñe de rojo las bacterias decoloradas, es decir, las de pared fina. Por lo tanto, las bacterias grampositivas quedan teñidas de violeta y las gramnegativas de rojo (Fig. 71-4). Tinción de ZieW-Neelsen. También se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es una tinción diferencial específica para micobacterias. La pared celular de las micobacterias no contiene peptidoglucanos sino ácidos micólicos y esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol. El colorante primario es la fuesina, que tiñe toda la preparación de rojo brillante. La solución decolorante elimina la fucsina, excepto en los bacilos ácido -alcohol resistentes y, finalmente, el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.

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s

Se denomina cultivo al proceso de laboratorio por el que se induce el crecimiento cuantitativo de agentes patógenos, que permite el aislamiento del microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos y, asimismo, facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación. Así, los microorganismos necesitan algunas sustancias imprescindi-

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Módulo VII

Microbiología Clínica

bIes para su crecimiento que incluyen agua, fuentes de energía, carbono, algunas sales y elementos y en ocasiones vitaminas o aminoácidos esenciales para cada especie. Además, precisan determinadas condiciones fisicoquímicas (temperatura, humedad, pH, etc.).

El proceso de laboratorio por el que se induce el crecimiento de los agentes patógenos se denom ina cultivo.

Tipos de medía de cultivo Los medios de cultivo que se emplean en el labo ratorio se pueden clasificar mediante distintos criterios (Tabla 71-2):

• Según su estado: se distingue entre medios de cultivo líquidos y sólidos, su uso depende del tipo de muestra y del patógeno en estudio. Medios líquidos: las sustancias nutritivas se encuentran disueltas y el creci miento suele ser mayor porque la disponibilidad de nutrientes también lo es. Medios sólidos: sobre estos medios es posi ble el cultivo de colonias bacterianas. La base fundamental de los medios sólidos es el agar, polímero de origen vegetal que forma un gel al enfriarse, que contiene los elementos nutritivos y mantiene un nivel alto de humedad. -

11 de hematíes. • Hemoglobina corpuscular media (HCM). Informa sobre el valor medio del contenido hemoglobínico de los hematíes. No se mide directamente, sino a través del cálculo matemático: HCM = Hb/ri" de hematíes. • Concentración de Hb corpuscular media (CHCM). Es la media de las concentraciones de Hb de cada uno de los hematíes. Correlaciona el VCM y la HCM entre sí, por lo que sus variaciones son muy pequeñas, a excepción de ciertas situaciones clínicas con incrementos característicos de la CHCM, como esferocitosis, hemoglobinopatía C, hiperlipidemia o aglutinación eritrocitaria. Se considera normal una cifra entre 28 y 35 g/dL: se denomina normocromía. Se obtiene mediante un cálculo matemático: CHCM = Hb/Hto. En analizadores que usan tecnología Technicon", la CHCM también se cuantifica directamente por densidad óptica.

¿ Recuerda cuántos tipos de Hb humana existen?

Algunos autoanalizadores pueden ofrecer, además, otra serie de datos de interés clínico:

• Amplitud de distribución eritrocitaria (ADE; red blood celldistribution width, RDW): es el coeficiente de variación del histograma de volúmenes. Se considera normal un porcentaje menor o igual al 15%. • Amplitud de distribución de hemoglobina (ADH; hemoglobin distribution width, HDW): es la desviación de la concentración de Hb. La cifra normal se sitúa en 2,2-3,2 g/dL. Los valores normales de los índices eritrocitarios dependen sobre todo de la edad y, en menor medida, del sexo (Tabla 76 -1). Puesto que hematíes y plaquetas son las dos únicas células anucleadas, en algunos analizadores el recuento se realiza en un mismo canal y se las distingue por el tamaño: las plaquetas son más pequeñas (el volumen plaquetario medio suele ser < 11 fL). El límite de tamaño para que una célula sea contabilizada como plaqueta es de unos 20 fL; por eso, en caso de que las plaquetas sean grandes o macrotrombocitos, la cifra de plaquetas ofrecida por el analizador puede ser menor de la real, ya que las contabiliza como hematíes; y, al contrario, en caso de fragmentos eritrocitarios en anemias microangiopáticas, puede ofrecer una cifra alta de plaquetas falsa. Ambas situaciones se clarifican con la observación de la extensión al microscopio yel analizador, además, suele ofrecer también alarmas morfológicas.

•

ALTERACIONES MORFOLÓGICAS DE LOS HEMATíES

La anemia se define por la disminuc ión de la Hb. El voLumen corpuscuLar medio [VCM) es el índice eritrocitario con más valor clínico.

U~

La observación de la morfología eritrocitaria en el frotis sanguíneo tiene una importancia fundamental en el estudio de la anemia y, en efecto, en algunas patologías el

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::[~b~~;16~~1 ~:N~¡~fiec? nonmalés de iÓs;R~i nc'iR~i~>~ R~~á~,~tr~~ 'd~ ~;ni·~.;~~ja s~g¿r:i~'~O rg~';~,~~i~~~ -M~nd i~ l .'. o~~;~1j~~}~;~"~:z~~~~~~;~,a}~~ 7~ ?tA~~ ) , ., -~. " ~~. - '~x' >,~ ,< ;.', ' .-_:~"_~>" ~ ,~ ;-_~ 100 fL. Es típico en la anemia por déficit de factores madurativos (déficit de vitamina B12 y de ácido fólico o vita mina B9) ; también se observan en hepatopatías, síndromes mielodisplásicos y abuso de alcohol. Los reticulocitos suelen ser macrocitos.

Existen distintas alteraciones de la forma de los hematíes. Cuando se observan diferentes formas de hematíes en una misma extensión se den omina poiquilocitosis. Si se encuentran diferentes tamaños y formas, se habla de anisopoiquilocitosis.

l.

Esquistocitos. Son hematíes fragmentados y provienen de la estrangulación de los filamentos de fibrina (como en las microangiopatías) o por fragmentación mecánica (en prótesis cardíacas metálicas). En gen eral indican alteraciones de la microcirculación y hemólisis intravascular, como en el síndrome HELLP, complicación obstétrica grave que se con sidera una variedad de la pr eeclampsia; la abreviatura HELLP proviene del inglés: anemia hemolítica (hem olytic anemia), incremento de enzimas hepáticas (eleuated liver enzyme) y trombocitopenia (low platelet count). También se observan en el síndrome hemolítico urémico o la púrpura trombocitopénica trombótica, en adenocar cin omas mucosecretores, hemangiomas cavernosos, toxicidad por mitomicina, bleomicina y cicl osporina A, etcétera. )< . Dacriocitos o hematíes en lágrima (tear-drop cells). Son hematíes con una proyección elongada en un polo, que adquieren forma de pera o de lágrima al pasar por los poros del bazo. Son típicos de la metaplasia mieloide agnogénica (síndrom e mieloproliferativo); también se encuentran en la metastatización neoplásica medular yen la anemia megaloblástica. Esferocitos. Tienen forma redondeada, con gran contenido en Hb, por lo que desaparece el halo central. Característicamente se encuentran en elevada CHCM y

'l . 1046

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son típicos de la esferocitosis hereditaria, de la incom patibilidad en el embarazo o isoinmunización ABO y de la anemia hemolítica autoinmune (AHAI); también se observan en quemaduras graves y mordeduras de serpiente. Eliptocitos. Tienen forma de elipse. Se observan en la eliptocitosis hereditaria, pero también se pueden encontrar en la ferropenia y la anemia megaloblástica. y . Drepanocitos o hematíes falciformes (sickle-cells). Son muy largos y -estrechos y adquieren forma de hoz en situaciones de baja presión de oxígeno (por fiebre, deshidratación, altura, etc.), Contienen una Hb estructural anómala, la HbS, y adquieren esta disposición porque, al desoxigenarse, la HbS pierde su estructura y forma cuerpos tactoides, que son irregulares e irreversibles. También se pueden apreciar en la hemoglobinopatía SC. X· Dianocitos o codocitos (hematíes en diana, target-cells). Tienen una superficie aumentada, y en el centro se observa una zona con mayor contenido de Hb, lo que les confiere el aspecto de diana. Son típicos en la ~-talasemia y en la hemoglobinopatía C; también pueden verse en las hepatopatías que cursan con ictericia obstructiva, en la anemia ferropénica grave y en la hemoglobinopatía S. }, . Estomatocitos. En su región central muestran una hendidura parecida a una boca. Pueden verse en la estomatocitosis hereditaria, pero también son muy típicos en las hepatopatías alcohólicas, las cirrosis e incluso en la esferocitosis. X · Hematíes espiculados. Presentan proyecciones en punta, en espículas. Si se trata de unas pocas espículas cortas se denominan equinocitos (burr-cells), que se observan en la uremia, el déficit de piruvatocinasa o el abuso de alcohol; si tienen un perfil dentellado y espinoso se trata de acantocitos, y pueden verse en hepatopatías, anemias graves o malabsorción lipídica.

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Las alteraciones en la forma y el color de los eritrocitos indican el tipo de enfermedad relacionada.

Las alteraciones del color se pueden clasificar como sigue:

• Anisocromía. Se produce cuando coexisten hematíes de distinta coloración. Se tiene en cuenta la Hb como un aumento de la ADH. Es un signo dismórfico importante que indica un trastorno en la eritropoyesis, como ocurre en los síndromes mielodisplásicos. También puede observarse en anemias ferropénicas con crisis reticulocitarias o tras una transfusión. • Hipocromía. Los hematíes se tiñen débilmente, el contenido en Hb es bajo y el halo central aparece aumentado de tamaño; en ocasiones graves se aprecia solamente un ribete periférico (anulocito). Se observa en las anemias ferropénicas y siempre indica un trastorno en el aprovechamiento del hierro. • Hipercromía. Los hematíes contienen gran cantidad de Hb y pierden el halo central. Se observa en las anemias megaloblásticas. '>(. Excentrocitos (hemighosts). La Hb se polariza, se distribuye hacia un extremo del hematíe. Son típicos en el déficit de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH). • Policromasia. Se trata de hematíes jóvenes que mantienen el material basófilo del eritroblasto y suelen corresponder a reticulocitos, por lo que se observa en las anemias hemolíticas. También es importante descubrir inclusiones eritrocitarias, como:

• Punteado basófilo. Son ribosomas parcialmente degradados que se integran en pequeños agregados. Es muy típico del saturnismo o intoxicación por plomo, pero se suele observar en ~-talasemias, anemias hemolíticas y déficit de pirimidina5-nucleotidasa. • Cuerpos de Howell-Jolly. Son corpúsculos redondos que provienen de la degradación de núcleos de eritroblastos. Se aprecian tras una esplenectomía, en la atrofia esplénica y en anemias graves. • Anillos de Cabot. Son restos de membrana nuclear eritroblástica y advierten un trastorno profundo de la eritropoyesis. Pueden verse junto a los cuerpos de HowellJolly.

Cualquiera de las alteraciones intrínsecas de los hematíes, como membranopatías, enzimopatías o hemoglobinopatías, protege frente a la parasitacián por Plasmodium.

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• Parásitos. El diagnóstico de malaria o paludismo se basa en la observación de Plasmodium en una extensión de sangre periférica (Fig. 76- 2A); como resultado de la fagocitosis de los hematíes previamente parasitados, también es posible visualizar pigmento malárico o hemozoína en monocitos (Fig. 76-2B) o neutrófilos. Es más rara la observación en la parasitación por Babesia. ... Figura 76-2. Parasitación por Plasmodium falciparum. A:formas anilladas intraeritrocitarias; B: pigmento malárico (hemozoínal en monocitos.

La anem ia debe considerarse un signo, no una enfermedad en sí.

e J

ANEMIAS: CONCEPTO. CLASIFICACiÓN MORFOLÓGICA Y ETIOPATOGÉNICA

Los hematíes tienen una vida media de 100-120 días; ell%, aproximadamente, se destruye y se reemplaza a diario. Cuando los hematíes envejecen, los macrófagos del bazo, el hígado y la médula ósea los eliminan. La anemia se define como la disminución de la concentración de Hb, lo que conlleva una reducción en la capacidad para transportar O 2 a las células. Su intervalo de normalidad depende sobre todo de la edad y el sexo (Tabla 76-1 ) y también de algunos estados fisiológicos, como el embarazo (anemia dilucional). Se estima que más de 2.000 millones de personas tienen anemia en todo el mundo y se calcula que el 500/0 se debe a ferropenia. La prevalencia de la anemia es mayor en niños, mujeres jóvenes y ancianos, y probablemente es más frecuente de lo que se sospecha. La anemia debe considerarse un signo, no una enfermedad en sí. Cuando se acompaña de la disminución de otra serie celular se habla de bicitopenia o pancitopenia y, en ese caso, el enfoque diagnóstico debe ser diferente. La anemia puede producirse por nutrición deficiente, pérdidas sanguíneas, hemólisis o enfermedad crónica (30-70% de pacientes con hepatopatía, 27% con artritis reumatoide , 28-550/0 con el virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]). Una vez se detecta anem ia, es necesario iniciar la búsqueda de la causa y su tratamiento. Las cifras más altas de mortalidad se dan en pacientes con anemia, incluso se considera un factor predictivo de muerte en pacientes con insuficiencia cardíaca o tras intervenciones de cirugía general. Por otro lado, la anemia también influye sobre la morbilidad: empeora de form a significativa la calidad de vida del paciente ( 100 fL) • • • • • • •

Anem ias megaloblásti cas Alcoholism o Insufici encia hepática Síndromes mielodisplá sicos Reticulocitosis Hipotiroidi smo Aplasia medular [en alguno s casos]

VCM : volume n corpus cular med io.

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e

PRUEBAS DE LABORATORIO UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE LAANEMIA

Para el diagnóstico diferencial de una anemia en el laboratorio, es fundamental conocer una serie mínima de datos de la historia clínica del paciente. A continuación se detallan las características que se verifican en el laboratorio de las anemias más frecuentes y, con ello , la utilidad de las pruebas de las que se dispone.

Anemia ferropénica La anemia ferropénica se debe a una eritropoyesis deficiente, por falta o disminución de hierro en el organismo. Se ún la o:Ms se considera un roblema de salud pública, pues se relaciona con malnutrición y pobreza. En España su prevalencia en l~ y preescolares es del 7-12 %, en hombres adultos y escolares es inferior al 1% yen mujeres adultas alcanza e14O¡o. El hie~g;~a~[ org~nismo exclusivamente con la alimentación. El hierro de origen animal (carne de vaca , pollo, pescado, vísceras, embutidos con sangre animal, yema de huevo, moluscos) es soluble y se absorbe muy fácilmente. El hierro no hemínico, de origen vegetal (verch"tras, hortalizas Jegumb-r-e¡-Ze~eales, pan y fruto;5ecos :-se ;bso~e_ ~n forma fe~osa y en menor proporción. Además, sustancias como el calcioy ~l fósforo (que contienen los productos lácteos), los tanatos (té, café), las bebidas carbonat~das y ciertos fármacos (antiácidos, levodopa, t~trac~iinas) disminuyen la absorción de h ierro :-Por er co n trario, la yitamina y los amino~cidos fa_vorecen s~_abs9r~ión. . - El hierro es necesario en las reacciones enzimáticas, el metabolismo oxidativo y el crecimiento celular. Es absorbido por los enterocitos duodenales, se transporta en sangre p or la transferrina, se deposita en los tejidos en forma de ferritina y se libera a las células para la formación de Hb, mioglobina, citocromos, etcétera. .L a causa más frecuente de ferropenia en el adulto son las p.érdidas crónicas de pequeñas cantidades de san re. El origen suele ser digestivo: por hemorroides, esofagitis por reflujo, úlcera péptica, neoplasias (carcino~a de colon, de intestino delgado, carcinoma gástrico), parásitos intestinales, varices esofágicas secundarias a cirrosis, pólipos, divertículos, tumoraciones vasculares (angiodisplasias, enfermedad de RenduOsler), lesiones de la mucosa gástrica por uso crónico de antiinflamatorios o hernia'de hiato. En mu'eres, las érdidas menstruales excesivas son la causa más importante. En el mundo menos desarrollado la causa fundamental es la falta de aporte nutricional, las dietas insuficientes en hierro y la abundante ingesta de té o leche (quelantes del hierro). Otras causas son la ér~i~~_yatrogénica por analíticas en pacientes hospitalizados ( 100 fL y puede preceder en meses a la anemia. Si se acompaña de anemia, suele deberse casi siempre a déficit de vitamina B 12 o ácido fólico. En estos casos, el C M suele ser> 110 fL. Además, suele afectarse toda la hematopoyesis, con una intensa anisocitosis, cuerpos de Howell-Jolly, anillos de Cabot, punteado basófilo e hipersegm entación d e granulocitos, en particular de pleocariocitos (Fig. 76-4). ~n macrocitosis de otras ~tiol,?gías no suele haber anemia y el YCM es ligeram en te > 100 fL. La macrocitosis puede verse enmascarada si coexiste un ~s tado de ferropenia' o t aÍasem ia y, en ese caso, puede presentar normocitosis~ ~~e haber trombopenia o Íeucopenia que se confunda con una aplasia medular o leucemia. El recu~!2to de reticulocitos puede ser normal o bajo, aunque si predomina la hemólisis puede haber rericulocitosis. . • Datos bioquímicos. A causa de una eritropoyesis ineficaz, pueden observarse signos biológicos de hemólisis, como hiperbilirrubinemia indirecta, aumento de lactato-desh id rogen asa (LD H ) y disminución de haptoglobina. • Determinación sérica de vitamina B 12 y ácido fólico. E fundamental}?ara co cretar la deficiencia de una u otra vitamina. Debe hacerse en ayunas o antes de un,

Rutina REC LEU: HEM : HGB : HCT: VCM: HCM: CHCM: MHCH: HC: IDH: IDHb: PLQ: VPM:

L L L H H

H H

6,03 2,36 10,90 31,40 133,20 46 ,20 34,70 35,50 47,00 18,30 3,21 249 ,00 6,90

x10 3/IJL x106/IJL g/dL % fL pg g/dL g/dL pg % g/dL x10 3/IJL fL

ICRO: MACRO: +++

HIPO:

HIPER: + ANSIO: ++ VAReH: DESV.IZD : SLAST'OS: TIPS: HEMN: GI: PLQ GRANDES: PLQAGREGADAS: oe¡:MPO: FRAG. HEM: ESPECTROS HCM:

.. Figura 76-4. Hallazgos en anemia me-

galoblástica : anisocitosis de predominio macrocítico, neutrófilo hipersegmentado y datos del hemograma.

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transfusión ~ ~iem~re se deben realizar .arnb as determinacione . Si el valor de la cobala~ina es < 200 f2g/dL o el de folato < 5 }-lg/L, el diagnós~ico es indudable. Sin embargo, existe una gran variabilidad intraindividual en la determinación de la vitamina B 12 sérica, 120r lo que entre 200 ~ 300 Rg/m L es un resultado border-line el déficit es posib e. • Determinación de homocisteína y ácido metilmalónic . El aumento de estos metabolitos, que dependen de la vitamina B 12 , la mayoría de las veces indica un déficit funcional tisular de cobalamina: el 980/0 de los pacientes con carencia de vitamina demostrada que responden al tratamiento muestran un aumento de ácido metilmalónico y un 96 O/o también el de homocisteína; es decir, su determinació parece ser más sensible para el diagnóstico. Si existe la sospecha clínica o analítica de un déficit de vitamina B 12 y su dosificació n se ajusta a cantidades "normales, "e incluso con dosis altas, las estimaciones de ácido metilmalónico y homocisteína determinan conjuntamente, casi en el 1000/0 de los casos, si realmente se trata cÍe un déficit vitamínico. La hiperhomocisteinemia también puede indicar un déficit de ácido fólico; no ~curre así con el ácido metilmalónico, puesto que el folato no participa en su metabolismo. Además, el ácido metilmalónico no está disponible en todos los laboratorios. Por lo tanto, según los experto_s, por motivos de seguridad y coste, se recomienda iniciar el estudio de un posible déficit de vitamina B 12 o de ácido fólico con la determinación de la homocisteína. ~~ encu~n!ra aume!!~a~, entonces se procede adererminar jos "y-ªlores_viJa1)1ínico_? Cabe destacar que la hiperhomocisteinernia es un factor de riesgo c~diovascular que se relac~o~a directamente con los trastornos tromboembólicos.

Anemias hemolíticas congénitas

Membranopatías - Esferocitosis hereditaria - Eliptocitosis congénita - Trastornos de la permeabilidad iónica - Abetalipoproteinemia - Déficit de leciti ncolesterolaci ntra nsferasa (LCAT) - Síndrome Rho - Fenotipo Mcleod Enzimopatías - Déficit de glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa (G6PDH) - Déficit de piruvatocinasa Hemoglobinopatías - Hemoglobinopatías estructurales - Talasemias Anemias hemolíticas adquiridas

• Anemias hemolíticas inmunitarias - Anemia hemolítica autoinmune (AHAI)

Anemia hemolítica .La hemólisis o «destrucción de la sangre» (etimológicamente: hemo, sangre; lisis, destrucción) se define como la disminución de la supervivencia eritrocitaria en la circulación. Como consecuencia de la menor cantidad de Hb se produce el estímulo de la eritropoyesis secundaria, de forma que la imp ortancia de la anemia varía según el grado de hemólisis y de la 'respuesta eritropoyética: si ésta es suficiente para mantener una cifra de Hb normal, Euede darse un estado de compensación sin anemia (hemólisis compensada). Las causas de hemólisis pueden ser muy diversas y para su estudio se suelen clasificar como corpusculares (intrínsecas o debidas a un defecto eritrocitario metabólico o estructural) y extracorpusculares (extrínsecas o secundarias a alteraciones del medio que rodea a los hematíes). Con excepción de la hemoglobinuria paroxística nocturna, todas las hemólisis corpusculares son de origen congénito, mientras que las extracorpusculares siempre son adquiridas (Tabla 76-4). Desde el punto de vista fisiopatológico, la hemólisis también puede clasificarse como extravascular, cuando la destrucción eritrocitaria se realiza preferentemente en el sistema mononuclear fagocítico o como intrava scular, cuando o·curre en el terntono vascular. La anemia hernolítica agud se inicia de manera brusca y cursa con fiebre, malestar general, dolor abdominal o lumbar, palidez gener al, ictericia, taquicardia y, en ocasiones, con orinas oscuras por hemoglobinuria cuando la hemólisis es intravascular (en este último caso puede haber insuficiencia renal y, si es muy intensa, puede llegar a provocar un fallo multiorgánico). La anemia hem olítica crónic es de inicio lento, por lo que el organismo se ada E a la situación y las principales complicaciones se deben a hi oxia (retraso del desarrollo pondoestatural y gonadal, úlceras maleolares) y al exceso de actividad eritro ~yética (deformaciones craneofaciales, hiperconsumo de ácido fólico o hemocromatosis). En los casos de hemólisis moderada las principales complicaciones se deben a hipercatabolismo hemoglobínico con litiasis biliar y a hiperesplenia con leucopenia, trombocitopenia o crisis hemolíticas. También pueden producirse crisis de aplasia o eritroblastopenia po r parvovirus B 19. Los principales datos Rara el diagnóstico de hemólisis en el laboratorio son el aumento de bilirrubina indirecta de LDH: la disminución de haptoglobina (que se -

-

y

- .-.

o Por anticuerpos fríos o Por anticuerpos calientes o Por anticuerpos de DonaldLandsteiner

- "Anemia hemolítica por incompatilidad ltransíusionall - Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) - Anemia hemolítica por medicamentos - Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) • Anemias hemolíticas mecánicas - Microangiopáticas o Síndrome hemolítico urémico (SHU) o Púrpura trombopénica trombopática (PTT)

- Prótesis valvulares - Traumáticas (hemoglobinuria de la marcha) • Anemias hemolíticas infecciosas - Por parásitos (paludismo, toxoplasma, Leishmania, Babesia) - Por bacterias (Bartonella, Clostridium, cólera) • Anemias hemolíticas por agentes físicos o químicos -

Agentes oxidantes Sustancias químicas Hemodiálisis Venenos

• Anemias hemolíticas metabólicas - Hepatopatía [síndrome de Zievel - Insuficiencia renal (uremia) - Hipofosfatemia

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une a la Hb libre para eliminarla) y ~l . aumento, de reticulocito . Si la hemólisis es intravascular, se produce hernoglobinuria . Ante estos datos de hemólisis, los siguientes pasos que se deben seguir son la realización de la prueba de antiglobulina directa o prueba de Coombs directa y la revisión de la morfología eritrocitaria que, en muchos casos, conduce a un diagnóstico certero. Los cuadros más importantes de este trastorno son la AHAI y la anemia hemolítica congénita.

Anemia hemolítica autoinmune En la anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos fríos se producen anticuerpos del tipo

IgM.

Es la ~~~~.~~_~_~~_frecuente de anemia hemolítica adquirida. Se produce por autoanticuerpos dirigidos contra antígenos de la propia membrana eritrocitaria. 1 as manifestaciones clínicas dependen del tipo de autoanticuerpo, de su concentración _y de su capacidad para fijar el complemento, así como de la temperatura a la que es activo. La ABAI por anticuerpos calientes es la más frecuente (75 % de los casos) y en la mitad de estos casos es secundaria a enfermedades autoinmunes, síndromes linfoproliferativos, neo Qlasias, infeccione~ V~cirrosis biliar primaria o síndromes mielodisplásicos. La detección de autoantic~erpos no significa necesariamente la aparición de AHAI. Suelen ser de tiRo IgG con actividad hernolítica exclusivamente a '27 ~C : el 30 -400/0 de los casos son de tipo IgG, cl40-500/0 de tipo IgG-complemento y el l G') de tipo complemento. En el frotis se observan esferocitosis, policromasia esquistocitos y ocasionales eritroblastos circulantes (Fig. 76-5). En el síndrome de Evans, junto a la AHAI, se asocia una trombopenia inmunitaria. La prueba de antiglobulina indirecta puede detectar autoanticuerpos libres en el suero, que dificultan las pruebas de compatibilidad porque se comportan como anticuerpos que reaccionan con todos los hematíes del panel. La AHAI por anticuerpos fríos o crioaglutininas se produce por autoanticuerpos tip IgM, )Q},ue también se fijan a la membrana del hematíe pero realizan su acción me ian te el complemento, aunque la hemólisis suele ser extravascular, Sólo son.3ctivos a temperaturas bajas (4-20 OC ), por lo que pueden manifestarse en las zonas acras del I

Rutina REC LEU: - HEM: - HGB : - HCT: ~ VC M: HCM : CHC M: MH CH: HC: IOH: IOHb: PLQ : VPM :

H L L L H H

H H H L

13,94 1,98 7,00 21,00 105,80 35,3 0 33,40 36,20 37,30 19,40 6,31 617 ,00 7,00

Alarmas morfologia

x10 3/IJL x 106/ IJL g/dL

% fL pg g/dL g/dL pg

% g/dL x 10 3/IJL fL

v/eH HEM

Volumen HEM

[]K]

MICRO: MACRO: +++ HIPO: +++ HIPER: +++ ANSIO: ++ VARCH: +++ DESV.IZDA: BLASTOS: ATIPS: HEMN: + GI: PLQGRANDES: PLQAGREGADAS: DEFMPO: FRAG. HEM: ESPECTROS HEM:

La

O

Matriz HEM CH < 28 1935 9,4 %

CH = 28-41 2388 11,6%

CH > 41

v = 60-1 20

682 3,3 %

10479 50 ,7 %

5073 24, 5 %

V > 120

5 0,0 %

66 0,3 %

36 0,2 %

v > 120

~

Figura 76-5. Hallazgos en anem ia he-

molítica autoinmune: esferocitosis, policromasia, esquistocitos y eritroblastos circulantes y datos del hemograma.

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O 0,0 %

·

Técnicas de análisis hematológico

-

Módulo VIII

cuerpo (nariz, orejas, manos y pies). La síntesis de estos autoanticuerpos puede ser idi~pá'tica o secundaria, asociada' a síndromes linfoproliferativos crónicos, con IgM monoclonal o a infecciones (mononucleosis infeccios " neumonía por Mycoplasma pneumoniae, el virus de la gripe A listeriosis) en las que la IgM es policlonal. Pueden encontrarse crioaglutininas en personas sanas en bajas 'concentraciones sin que se demuestre hemólisis. La AHAI por hemolisina bifásica de Donath-Landsteiner (hemoglobinuria paroxística afrigore) es rara y se ha observado en niños tras un proceso vírico o bacteriano. Se inicia tras la exposición al frío o tras ingerir bebidas muy frías y consiste en un cuadro muy agudo y autolimitado con fiebre, dolor abdominal y lumbar, cefalea o calambres musculares (por hemólisis intravascular), con hemoglobinuria. El autoanticuerpo responsable es una IgG de especificidad anti-P l' que fija los dos primeros componentes del complemento a bajas temperaturas y se completa la cascada a los 37 °C (de ahí su nombre) .

,

. ~ _ _ ~'

¿Recuerda los tipos de anemia hemolítica autoinmune?

Anemias hemoLíticas congénitas Cualquier membranopatía, enzimopatía o he moglobinopatía dificulta la entrada y la multiplicación del parásito Plasmodium; por esta razón, la mayor frecuencia de estas alteraciones se produce en zonas endémicas de malaria, como consecuencia de la presión positiva en la selección natural. Las membranopatías son alteraciones en las proteínas de membrana y del citoesqueleto en las que se produce una disminución de la cohesión de membrana o de su estabilidad mecánica, lo que provoca una pérdida de su área de superficie y una disminución de la vida del hematíe: • La esferocitosis hereditaria es la anemia hemolítica hereditaria más frecuente en personas de raza blanca. Se debe a la deficiencia de cualquiera de las roteínas implicadas en las interacciones verticales que anclan el es ueleto de membrana a la bicapa lipídica (anquirina, espectrina, banda 3, proteína 4 .2). Su clínica es muy variada y abarca desde individuos portadores asinromáticos hasta los que sufren una anemia intensa de requiere t~ansfusiones para salvar la vida, El cuadro típico se caracteriza por hemólisis crónica con anemia, reticulocitosis, ictericia litiasis biliar, esplenomegalia y la determinación de esferocitos en sang re periférica El VCM puede estar disminuido y es típico el aumento de la CHCM > 35 g/dL. Los analizadores que ofrecen la distribución de hematíes muestran más de un 2% de hematíes hipercrómicos, con una CHCM >41 g/dL. Las pruebas de fragilidad osmótica ponen de manifiesto la escasa resistencia q ue oponen los esferocitos a la en trada d e agua, de forma que se hemolizan precozmente si se someten a medios hipotónicos; la prueba que más se usa es la resistencia globular osmótica. Según se ha publicado en las últimas guías clínicas, una historia familiar de esíerocitosis, junto con datos de hemólisis y la observación de esferocitos en el frotis, es suficiente para el diagnóstico. • Laeliptocitosis -hereditaria se caracteriza po r el hallazgo de hematíes de for a alargada en el frotis. También se debe a cgfl~~ en la 12roteín a de membrana (espectrina, proteína 1). Del mismo modo que en la esferocitosis, sus características clínicas son muy heterogéneas, aunque la'!payor parte de los casos que se detectan son portadores asintomáticos y la anemia moderada o grave se produce sólo en un 10% de los pacientes. • La estomatocitosis hereditaria es más raJ:a y se produce un aumento del flujo de cationes en la membrana celular. Se caracteriza Ror una importante sobrecarga férrica que puede hacer necesaria la(quelación del hierro para evitar las complicaciones por hemosiderosis. El froti muestra un número variable de estomatocitos, hematíes con una hendidura o estoma (Fig. 76-6). Las enzimopatías son el conjunto de anemias hemolíticas que se producen como consecuencia de la alteración de cualquiera de las enzimas que intervienen en el meta-

La esferocitosis es la anemia hemolítica más frecue nte personas de raza blanca.

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... Figura 76-6. Membranopatías heredi tarias. A: esferocitosis ; B: eliptocitosis; C: estomatocitosis.

1055

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,

Capítulo 76

Aplicación de técnicas de análisis hematológico al estudio de la serie roja

El déficit de G6PDH cursa con crisis hemolíticas graves por la ingesta de habas líavismol. de algunos fármacos o por infecciones.

Las talasemias y las hemoglobinopatías estructurales en heterocigotos suelen ser asintomáticas, pero son muy graves en homocigotos.

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I

.A Figura 76-7. Déficit de glucosa-6fosfatodeshidrogenasa. A: aspecto del suero en u na crisis hemolítica; B: excentrocitos o hemighosts [flechas).

bolismo energético del eritrocito, que se desarrolla mediante tres grandes vías: la glucólisis anaerobia (vía de Embden-Meyerhof), el metabolismo oxidorreductor y el metabolismo nucleotídico. Estos mecanismos son imprescindibles para mantener el aporte de energía y la defensa frente a agentes oxidantes:

• Déficit de G6PDH. Es la enzimopatía más frecuente y se encuentra en todos los grupos étnicos, pero sobre todo en personas de raza negra y caucasiana, mediterránea y asiática. Su déficit sobreviene por herencia ligada al cromosoma X; los hombres hemicigotos padecen la enfermedad, pero las mujeres pueden ser homocigotas (en porcentajes similares a los de hombres afectados) o heterocigotas (son portadoras, con concentraciones de G6PDH normales o ligeramente menores). Se dividen en varias categorías, pero en general las manifestaciones clínicas se producen sólo ~uando los hematíes se ven afectados por agentes oxidantes y consisten en ü-na anemia hemolítica intensa de inicio brusco, con fiebre, cefal~a, ictericia y orinas oscuras a l~24-48 hora;¿e 1; ~posición 'al agente (habas [favismo] o ciertos fármacos}. Otros factores que desencadenan el déficit son las infecciones bacterianas, hepatitis, cetoacidosis diabética, infarto de miocardio Q ejercicio extremo. Si la hemoglobinuria es muy intensa puede provocar insuficiencia renal. Una vez ha pasado la crisis y si ha se ha conseguido evitar el contacto con el agente desencadenante, la recuperación de la Hb comienza a los 2-4 días. El diagnóstjco requiere la medición de la actividad enzimática, Es importante tener en cuenta el recuento de reticulocitos, que s'e concreta en una gran actividad de G6PDH y puede enmascarar el resultado (falso negativo); en ese caso, debe confirmarse la medición una vez ha pasado el episodio agudo. Durante la crisis la morfología eritrocitaria muestra poiguilocitosis, punteado basófilo , macrocitosis policromasia; además, en las fases iniciales se detectan excentrocitos (hemighosts) , hematíes con desplazamiento hemoglobínico hacia la periferia celular, que desaparecen poco después del inicio de la crisis (Fig. 76-7). Es de gran valor diagnóstico la aparición in vitro de cue rpos de Heinz, inclusiones globulosas de color azul oscuro que se constituyen por precipitación de Hb desnaturalizada y que se detectan con la tinción de azul cresil. En las pruebas bioquímicas se destacan signo~ claros de hemólisis. • Déficit de piruvatocinasa. Los portadores heterocigotos suelen ser asintomáticos, aunque hay casos con antecedentes de hemólisis neonatal o esporádica en el curso de infecciones, alteraciones metabólicas o embarazo. Los portadores homocigotos suelen presentar anemia hemolítica crónica moderada, que se detecta desde el período neonatal. Las características son similares a la esferocitosis, pero sin esferocitos y con una fragilidad osmótica normal. En tre las anemias hemolíticas congénitas, se encuentran las talasemias. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades que se deben a alteraciones en la síntesis de las cadenas a y ~ de la globina, lo que provoca un desequilibrio entre ambas y la acumulación intraeritrocitaria de la cadena que se encuentra en exceso. Cada tipo de talasemia recibe el nombre de la cadena que deja de sintetizarse. Son frecuentes en el área mediterránea, así como en la población africana, la India y el Sudeste asiático. Su expresividad clínica es muy variable; depende de la alteración molecular (heterocigota u homocigota) y puede variar desde una nula expresividad clínica hasta la muerte intrauterina por hydrops fetal. En general, las consecuencias que se observan son: microcitosis e hipocromía, debidas a una menor concentración de Hb intraeritrocitaria; eritropoyesis ineficaz por la precipitación en el interior de los eritroblastos de la globina en exceso y su posterior hemólisis; disminución de la vida media eritrocitaria por hemólisis de los hematíes alterados; hiperplasia eritroide secundaria al aumento de la eritropoyetina como compensación a la hemólisis y también sobrecarga férrica a causa de la hemólisis clínica, que se agrava con las transfusiones.

• a- talasemia. Se debe a la falta de síntesis total (o'') o parcial (o;') de cadenas a . Su .síntesis se rige por dos pares de genes que están situados en el cromosoma 16, por lo

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que la dotación genética normal es aa/aa. El principal mecanismo por el que se produce es la deleción o la pérdida de parte del material genético del gen. Es la más frecuente en España, el área mediterránea y la población de raza negra, en la que afecta a 3,7 kb de su ADN. La deleción de 4,2 kb es más propia del Sudeste asiático. Las deleciones de uno o dos genes producen un a leve microcitosis, con o sin anemia, con un discreto aumento en la cifra de hematíes. La deleción de tres genes produce la enfermedad por HbH y cursa con anemia intensa o Hb normal, que puede estar acomp añada de microcitosis e hipocromía, así como de hemólisis e ictericia moderada. La deleción de cuatro genes es incompatible con la vida, produce hydrops fetal y no se ha descrito nunca en España. La tinción con azul cresil brillante puede poner de manifiesto algunos hematíes con inclusiones de HbH (