9 Anticorpos como Ferramenta Analítica- FCMSCSP 2016

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OBJETIVOS DA AULA - Compreender que as proteínas são as moléculas efetoras de função no contexto da expressão gênica - Compreender que alterações fisiológicas e fisiopatológicas se dão como resultado de alterações da expressão gênica, portanto, de proteínas - Aprender métodos de análise de proteínas de forma isolada (purificada) ou em amostras complexas – análise qualitativa e quantitativa

ANTICORPOS COMO FERRAMENTA ANALÍTICA Prof. Dr. Wagner Montor [email protected] Departamento de Ciências Fisiológicas Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

MÉTODOS DISCUTIDOS

Estes métodos são utilizados em pesquisa e diagnóstico

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR REPLICAÇÃO

Obtenção de anticorpos monoclonais e policlonais

Genoma

Imunofluorescência (IF) direta e indireta

(Southern blot, sequenciamento, FISH...)

DNA

Tissue microarray TRANSCRIÇÃO

Imunoensaios tipo ELISA SDS-PAGE Western Blot (WB) Imunoblotting (IB)

Transcriptoma

RNA

(Northern blot, qPCR microarray de DNA)

TRADUÇÃO

Protein microarray Co-imunoprecipitação (CoIP)

Proteoma

EMSA (Gel Shift)

(Western blot, IF, IP, PAGE, ELISA....)

RESULTADOS DE UM PROJETO GENOMA

PROTEÍNA

príons

RESULTADOS DE UM PROJETO PROTEOMA

Listas de Genes com Expressão Potencial

AKT, hsp90, PP2A, PIP3, Bad, IKK, NFkB, caspase 9, PI3K, GHR, GH, FKHRL1, PIP2.....

Complexa rede de interações entre proteínas

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MOLECULARMENTE, O QUE É IMPORTANTE!

O PROTEOMA É DINÂMICO

ou

UM ÚNICO GENOMA PTM

MUITOS PROTEOMAS fase do desenvolvimento hepatócito

ambiente externo

estado nutricional

condição fisiopatológica

DNA

Proteína X RNA DADOS QUESTIONÁVEIS INUNDAM A LITERATURA RNA (vantagens da análise)

DURANTE ANOS OS ESTUDOS DE TRANSCRIPTOMA FORAM A BASE DOS ESTUDOS DE EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL, DEVIDO A LIMITAÇÕES TÉCNICAS DO ESTUDO DE PROTEÍNAS

- as técnicas funcionam do mesmo modo para qualquer sequência de RNA (propriedades físico-químicas muito conservadas) - material de trabalho passível de amplificação quando insuficiente PROTEÍNA (desvantagens da análise)

1 GENE

100 RNAm

100 proteínas

Ideal (70%)

- cada proteína diferentes

apresenta

características

físico-químicas

- algumas técnicas não funcionam com algumas proteínas e é difícil prever quando isso acontece 1 GENE

100 RNAm

NO ENTANTO (GRANDE VANTAGEM DAS PROTEÍNAS)

0 proteínas associações reais

1 GENE

100 RNAm

2000 proteínas

Anticorpos são Ferramenta Fundamental na Ánálise de Proteínas - Um anticorpo do tipo IgG Porção Fab Variável específica para cada antígeno

sua análise permite a identificação de modificações póstraducionais, localização subcelular e parceiros de interação

Tipos de Anticorpos utilizados como Ferramenta

ANTICORPOS MONOCLONAIS

ANTICORPOS POLICLONAIS

Porção Fc Igual para todos os IgG da mesma espécie se é igual, é fácil detectar

O antígeno é detectado pela região Fab. O anticorpo é detectado pelo pesquisador pela região Fc

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Produção de anticorpo policlonal (camundongo, coelho, ovelha, bode) Injeta-se o antígeno

Um antígeno = Diversos epítopos

coleta-se sangue

várias semanas depois

Resultado:

Separar soro do coágulo

O soro é uma mistura complexa de vários anticorpos diferentes, inclusive vários contra o antígeno de interesse, porém contra epítopos diferente

Produção de anticorpo monoclonal (camundongo)

Policlonal x Monoclonal: Vantagens e Desvantagens Proteína X = antígeno de interesse

Anticorpo policlonal (contra o antígeno X)

A H

H C

F

G

D

X

B X

F

D

C D

E

A Y

Os anticorpos podem ser usados também para detectar proteínas específicas em células e tecidos

C

G

E

A, B, C, D, E, F, G, H = regiões diferentes da mesma proteína (domínios)

Detecção Protéica baseada em Anticorpos

H

B

F

E

O grande trabalho é selecionar o hibridoma que produz o anticorpo de interesse. São utilizados métodos especiais de seleção clonal em cultura celular. Resultado: é possível ter uma preparação ultra pura de um único tipo de anticorpo.

A

A

B

G

Anticorpo monoclonal (contra o domínio B)

C

O policlonal é mais sensível (sinal amplificado através de vários anticorpos diferentes) O monoclonal é mais específico....e caro, mas pode perder sensibilidade

Imunofluorescência Direta Células ou cortes de tecidos são fixados em uma lâmina, permeabilizados e incubados com anticorpos específicos, marcados com fluorescência para detecção de proteínas de interesse neste material

Imunofluorescência, direta e indireta (IF) Imunohistoquímica (IHC) Imunoquimioluminescência Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

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Imunofluorescência Indireta

Marcar o primário ou usar um secundário?

Em vez de marcar o anticorpo diretamente, é utilizado um anticorpo secundário, este sim marcado, e dirigido contra o primário

O resultado obtido é exatamente o mesmo, a única vantagem da utilização de um anticorpo secundário sendo a economia no laboratório. Marcar um anticorpo com fluorescência é caro e trabalhoso. Logo, se em um laboratório se trabalha com a detecção de várias proteínas diferentes, basta marcar UM ÚNICO secundário e utilizá-lo para detectar todos os primários, já que o método de detecção é via Fc de IgG, comum a todos

Resultado de uma Imunofluorescência

Resultado de uma Imunofluorescência Proteínas específicas da maquinaria mitótica foram marcadas nesta célula para que o fenômeno pudesse ser acompanhado com mais clareza

Cultura celular de neuroblastoma humano: O núcleo foi marcado em azul, com Hoechst dye; uma proteína citoplasmática (NF-H) foi marcado em vermelho e uma proteína nuclear (fibrilarina) foi marcada em verde

Aplicação de Imunofluorescência Tissue Microarray (TMA)

tratamento

Cilindros de tecido de vários pacientes ou várias regiões de uma lesão são emblocados em parafina e é montada uma lâmina que inclui estas várias amostras para processamento em paralelo, minimizando custo (reagentes), tempo de processamento e aumentando reprodutibilidade e potencial analítico

linhagem B

linhagem celular

linhagem A

solução salina

trastuzumab O uso deste método permitiu verificar a downregulation de Her-2 após tratamento com trastuzumab, como era esperado

Trastuzumab: bloqueador de Her-2 Verde: anti-Her-2 Azul: DAPI

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Anticorpos ligados a Enzimas (Imunoconjugados = conjugados)

Detecção Protéica baseada em Anticorpos e Enzimas substrato incolor

HRP (horseradish peroxidase): enzima extraída da raíz forte/rabanete silvestre. Raíz semelhante à utilizada para preparo do wasabi (raíz forte japônica) enzima reveladora A enzima é utilizada com substratos específicos para conversão em produtos detectáveis

produto colorido

anticorpo secundário (conjugado) anticorpo primário (específico)

Produtos Luz: imunoquimioluminescência

proteína de interesse

Precipitado colorido: imunohistoquímica, ELISA (DAB) Compostos fluorescentes: microarrays (TSA: tyramide signal amplification)

As enzimas ligadas ao secundário, como fosfatase alcalina e HRP (horseradish peroxidase) são muito usadas, pois geram produtos coloridos e insolúveis a partir de substratos solúveis e incolores

Imunohistoquímica (IHC) (muito usado para diagnóstico)

Imunoquimioluminescência O luminol, na presença de peróxido de hidrogênio, gera luz. São utilizadas reações em que o anticorpo conjugado (secundário), carrega uma enzima (geralmente HRP) que gera peróxido a partir de um substrato, ativando o luminol, gerando luz localmente, a qual pode impressionar um filme de raio-X ou detector específico.

Igual a imunofluorescência, porém em vez de usar marcação fluorescente, se usa marcação química, geralmente um anticorpo secundário conjugado a uma peroxidase, que torna o DAB (diaminobenzidina), originalmente solúvel e incolor, em um precipitado marrom que impregna as células Vantagem: não necessita de um leitor de fluorescência; a marcação é permanente e não apenas momentânea como na fluorescência Desvantagem: menos sensível do que a imunofluorescência, não dá pra fazer co-marcação, como se faz com os vários fluoróforos diferentes da imunofluorescência

Linfoma humano, marcado com anticorpo anti ciclina D1, usando DAB como substrato da HRP

Imunomarcação radioativa

luminol

CD – Cluster of Differentiation

SPECT (single photon emission computed tomography) usando um anticorpo marcado com Indio radioativo, contra Her-2 [111In-DTPA-pertuzumab])

Além de ter função diagnóstica, anticorpos podem ser transportadores de agentes quimioterápicos antineoplásicos para sítios específicos, minimizando efeitos adversos

A e C foram tratados com salina; B e D com trastuzumab, para resolver implante tumoral mamário Her-2+ em membro posterior direito

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CD – Cluster of Differentiation

FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting

FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting

Detecção Protéica baseada em Anticorpos

Podemos fazer ensaios em placas de 96 wells (poços) imobilizando antígenos ou anticorpos, para a busca de anticorpos ou antígenos, respectivamente

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Protein Microarrays

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoadsorção Conectado a Enzima) anticorpo secundário

Resultado

substrato anticorpo primário

anticorpo de captura visual e quantificável por colorimetria (espectrofotômetro de placa)

Há vários tipos de ELISA e aqui está descrito o “ELISA sanduíche”, em que é feito um “sanduíche” de proteína (como se os anticorpos fossem o pão)

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Estrutura do HIV

Genoma do HIV-1

Gênero Lentiviridae, Família Retroviridae (Retrovírus) Duas cópias de RNA cadeia simples encapsuladas por um núcleo-capsídeo protéico Envelope externo formado por bicamada fosfolipídica

Estruturalmente o genoma é formado pelos genes gag, pol e env, mais regiões regulatórias (vif e vpr). Os genes estruturais codificam para diferentes proteínas como as do core e nucleocapsídeo, enzimas e do envelope

Classificação Filogenética do HIV-1 baseada na sequência nucleotídica

Marcadores da Infecção no Tempo

Há diferenças moleculares entre os tipos, grupos, subtipos e sub-subtipos e isto deve ser levado em conta para o desenvolvimento de métodos diagnósticos, para evitar falso-negativos. (RF = forma recombinante, gerada em co-infecção [1 vírus com sequência de 2 subtipos]; M: major)

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(Teste ELISA para HIV – 1º Geração)

(Teste ELISA para HIV – 1º Geração)

Antígenos originados de um lisado viral de HIV, obtido in vitro (cultura de células) e purificado. Críticas: não reconhece IgM, contem proteínas humanas além de HIV e não mantém as proteínas de HIV na proporção natural, por degradação

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ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(Teste ELISA para HIV – 2º Geração)

(Teste ELISA para HIV – 3º Geração)

O teste é exatamente igual ao de 1º Geração, em relação à estratégia (ELISA indireto, para detecção de anticorpos no soro humano, utilizando anti-Fc de IgG humana), mas os antígenos imobilizados na placa são recombinantes ou sintéticos, logo são mais específicos e a sensibilidade é aumentada aumentando-se a concentração destes.

Os antígenos imobilizados, sintéticos ou recombinantes, permitem que apenas um lado do Fab se ligue a eles, o outro ficando livre (Fab é bivalente) para se ligar ao antígeno solúvel marcado. Este método permite detecção de IgG, IgM ou qualquer outra classe, antecipando a detecção para fases mais iniciais

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(Teste ELISA para HIV – 3º Geração)

(Teste ELISA para HIV – 4º Geração)

Na placa são imobilizados antigenos recombinantes ou sintéticos (gp41, gp120/160 mais o anticorpo anti-p24. Detecta IgG e IgM como o de 3º Geração, mais p24 livre do plasma dos pacientes, pois os reveladores são os mesmos antígenos imobilizados porém solúveis e marcados mais anti-p24 marcado.

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(Teste ELISA para HIV – 4º Geração)

LIMITAÇÕES O único resultado observável é se o poço mudou de cor ou não e em que intensidade (quantificação da intensidade de cor por espectrofotometria), porém, nunca é possível saber qual foi o antígeno detectado por anticorpos do paciente.

Pode ter sido detectado um único antígeno ou vários

Este único antígeno detectado de HIV pode ter sido detectado por um anticorpo gerado pelo paciente contra outro vírus qualquer, nem relacionado ao HIV (reação cruzada), gerando um resultado falso-positivo.

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Array de Proteínas proteínas

resultado soro

Detecção Protéica baseada em Anticorpos

mapa slide

zoom

c

Os anticorpos podem ser usados também para detectar proteínas específicas em misturas complexas de proteínas, e não apenas em células e tecidos. Os métodos de revelação, no entando, são os mesmos vistos até agora c

Western Blot Imunoblotting

O ideal seria poder fazer um array de proteínas, com diversos antígenos diferentes imobilizados em uma superfície de acordo com um mapa, mas esta técnica é muito cara e elaborada, estando restrita a pesquisa por enquanto

Separação de Proteínas por Eletroforese

SDS-PAGE Coloração com Coomassie Brilliant Blue 250R

Quando a mistura de proteínas é complexa, a primeira coisa a ser feita é diminuir esta complexidade, utilizando técnicas de separação, como eletroforese e cromatografias

Na eletroforese em gel de poliacrilamida e SDS (SDS-PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis with sodium dodecyl sulfate), também conhecida como eletroforese unidimensional, as proteínas são separadas exclusivamente pela sua massa molecular

Western Blot – passo a passo carimbo da eletroforese na membrana

resultado da eletroforese

Cora apenas proteínas e permite comparar a abundância de uma proteína entre amostras diferentes Rudimentar, geralmente complementado com Western blot

Western Blot – detecção específica

blotting

- bloqueio da membrana - adição primário - lavagem - secundário?

revelação e detecção

primário se liga à proteína específica

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Western Blot (PAGE) – Busca de proteínas específicas

Dot Blotting (Variação de Western blot)

SDS-PAGE Western-blot

Por que usar actina no western blot?

Em vez de fracionar as proteínas no gel, uma amostra de proteína pura (geralmente recombinante) é imobilizada na membrana (nitrocelulose) e continua como se fosse Western. A vantagem é a rapidez, a desvantagem é a chance de falso-positivo.

Western Blotting (WB) para HIV

Western Blotting (WB) para HIV

(Teste Complementar, Confirmatório)

(Teste Complementar, Confirmatório, continuação...)

Antigenos recombinantes ou sintéticos são fracionados em gel (WB) ou aplicados diretamente na membrana de nitrocelulose (IB) e portanto, há individualidade de antígenos por banda, podendo-se identificar contra qual/quais antigenos há resposta

Western Blotting (WB) para HIV

Diagnóstico da infecção pelo HIV – início da Epidemia ELISA: antígeno recombinante imobilizado em placa é exposto a soro do paciente

(Teste Complementar, Confirmatório, continuação...) ELISA simples

IFI: célula infectada apresentando antígeno é exposta ao soro do paciente Imunoblot: dotblot com antígeno recombinante é exposto ao soro do paciente WB: prot recomb é fracionada e exposta ao soro do paciente

WB é mais caro que ELISA, analisa-se menos amostras por vez e está sujeito a interpretação visual subjetiva

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Diagnóstico da infecção pelo HIV – atualmente

Teste Rápido HIV Bio-Manguinhos/Fiocruz Imunocromatografia (fluxo lateral)

vários fluxogramas possíveis

Combinações de testes imunológicos e moleculares (qPCR [carga viral])

O sangue do paciente é aplicado em S e sobre ele um tampão, que força a migração lateral do sangue através da membrana (capilaridade). Há na região S, ouro coloidal (detectável) conjugado a anti-Fc humano. Na região T existem antígenos de HIV. Quando anticorpos do paciente ligados a anti-Fc humano e ouro passam pela região T, contendo antígenos de HIV, se depositam e aparece a banda indicando positividade. Se não há anticorpos anti-HIV no sangue, o anti-Fc conjugado com ouro passa direto de T e chega em C, onde irá se precipitar de qualquer forma (controle do teste). C tem que aparecer pra mostrar que houve fluxo lateral do ouro coloidal e anti-Fc em toda a superfície

Co-Imunoprecipitação (CoIP)

EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)/Gel Shift

(Detecção de interação Proteína-Proteína) - PESQUISA

(Detecção de interação DNA-Proteína) - PESQUISA

mistura complexa de proteínas

incubação com anticorpo específico e bead

resultado

A pergunta a ser respondida é: Tenho interesse na proteína vermelha e quero saber com quem ela interage. Utilizo um anticorpo anti-proteína vermelha, sendo que este anticorpo está conjugado a uma “bead” densa. Ao centrifugar, tudo que estiver ligado a esta bead densa, desce para o fundo do tubo, inclusive os parceiros de interação da proteína vermelha, no caso, a azul.

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