Laboratorio 23 Leucemia aguda, Tinciones citoquímicas y Citometría de flujo

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L​ABORATORIO​ 23: L​EUCEMIA​ ​AGUDA​, T​INCIONES​ C​ ITOQUÍMICAS​ ​Y​ C​ITOMETRÍA​ ​DE FLUJO

Grupo encargado: ​6

​Fecha de la Clase:​ 3 de noviembre del 2020

​Profesor Encargado:​. MG

L​EUCEMIAS​ ​AGUDAS B​LASTOS

El porcentaje de blastos en MO es un parámetro fundamental para el diagnóstico de las leucemias agudas. Es además de suma importancia, su reconocimiento en sangre periférica y NO confundirlo o dejarlos pasar por otra célula. Las células con las que en ocasiones podemos confundir un blasto suelen ser: - Células plasmáticas - Linfocitos estimulados - Monocitos

C​ARACTERÍSTICAS Si bien es cierto como ya se vio en la teoría, existen diferentes tipos de blastos, dependiendo de la leucemia a la que pertenezcan. Principales características: - Cromatina laxa y ordenada - Citoplasma basófilo - Con frecuencia presentan sombra de nucleolos, aunque no siempre - Relación núcleo/citoplasma a favor núcleo - Normalmente​ no​ presentan granulación - Hay blastos grandes, con más citoplasma y núcleos grandes con cromatina muy laxa; y otros más pequeños con menos citoplasma y cromatina laxa pero en menor proporción Es importante aclarar que para llegar al diagnóstico certero del tipo exacto de leucemia aguda, se requiere de pruebas adicionales como ​citometría de flujo​ o como mínimo de ​citoquímica. La mayor parte del tiempo lo importante es la ​identificación del blasto​ como tal. Hay algunas condiciones en las que se pueden nombrar los blastos: - Mieloblasto​: si observamos cuerpos de auer - Mieloblasto tipo M3 o promielocito M3​: si se observa 3 o más cuerpos de auer en una misma célula - Blasto:​ si no posee cuerpos de auer solamente le podemos llamar blasto

H​AY​ ​QUE​ ​SABERLO​: ​ESQUEMA

Si se tiene un blasto en el que no se observan cuerpos de auer, y nos piden que identifiquemos la célula, solamente vamos a decir que es un blasto. Si nos pidieran el diagnóstico solo se puede asegurar que es una Leucemia Aguda porque no se puede descartar que se trate de una mieloide (a pesar de que no se observan los cuerpos de auer) y tampoco se puede asegurar que sea una linfoide. Si se tiene un blasto en el que sí ​se pueden identificar cuerpos de auer, debemos identificar la cantidad. - 1 o 2 ​cuerpos de auer: se puede decir que la célula es un mieloblasto y que el diagnostico seria una LMA. - 3 o más ​cuerpos de auer en empalizada​: Podemos decir que la celula es un mieloblasto tipo 3 y que el diagnóstico corresponde a una LMA tipo 3 1

E​JEMPLOS​:

1.

Se pueden observar blastos pequeños, prácticamente sin citoplasma y con nucleolos a penas visibles

3.

En este caso se observan 2 poblaciones de blastos, 1 más pequeño y otros 2 más grandes

5.

En esta leucemia, nos encontramos un blasto más grande, con más citoplasma que los anteriores y 2 sombras de nucleolos, 1 es más evidente que el otro

2.

En esta imagen, además de los blastos, la evidente trombocitopenia que se repite en las siguientes fotografías

4.

-

6.

Este blasto presenta un cuerpo de auer (señalado con la flecha). En este caso ​sí s​ e puede decir que es un mieloblasto

2

7.

Este blasto presenta un cuerpo de auer (señalado con la flecha). En este caso si se puede decir que es un mieloblasto

9.

Vemos en esta célula tipo M3, abundantes cuerpos de Auer en empalizada de forma muy evidente. Se debe estar conciente que con 3 o más cuerpos auer cuentan como empalizada que no siempre son tan fáciles de observar.

11. Esta es una muestra de blastos que son mucho más grandes, poseen una cromatina más laxa, con mayor cantidad de citoplasma, núcleos bastante evidentes y se observan células más maduras de la línea monocítica

8.

En esta leucemia M3 podemos observar los núcleos partidos en reloj de arena. Esta es una característica propia de este tipo de leucemia

10. Esto es una muestra de que la​ morfología no es suficiente​ para el diagnóstico de Leucemia aguda, pues acá tenemos una leucemia tipo M3 sin núcleos en reloj de arena ni cuerpos de auer en empalizada

12. Esta es una muestra de blastos que son mucho más grandes, poseen una cromatina más laxa, con mayor cantidad de citoplasma, nucleolos bastante evidentes y se observan células más maduras de la linea monociticaS

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L​INFOCITOS​ ​ESTIMULADOS

Si bien es cierto, ​nada tienen que ver los linfocitos estimulados con una leucemia aguda​, en algunos casos como ya mencionamos al inicio estas células se podrían confundir con un blasto. Recordar que no todos los linfocitos estimulados son iguales, los hay un poco más pequeños y con menos citoplasma.

Linfocito estimulado: -

presenta al igual que el blasto citoplasma basófilo y ​cromatina laxa (no tanta como en el blasto), es ​desordenada o con zonas de compactación más evidente ​y esta es la principal forma de diferenciar. Algunos pueden tener sombra de nucleolo Los linfocitos estimulados más grandes tienen más citoplasma y el núcleo es pleomórfico Es además de suma importancia tomar en cuenta los datos que nos da el hemograma para hacer el diagnóstico diferencial

Se presentan Linfocitos estimulados que en ocasiones se prestan para generar confusión:

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T​INCIONES​ ​CITOQUÍMICAS U​TILIDAD La utilidad de las tinciones citoquimicas se concentra en clasificar adecuadamente la LA: - Tipo de leucemia aguda - Estadio del clon maligno La muestras que se utilizan, pueden ser tanto de sangre periférica como de MO *Se van a presentar de forma ​resumida​ algunas tinciones, esto permite ​orientarse​ sobre que es lo que se debe leer en el libro de hematologia analitica tomo II*

M​IELOPEROXIDASA ● ● ●

Esta prueba es muy utilizada en los casos en que escasee la citometría de flujo. Es indispensable a nivel de citoquímica porque ​permite orientar​ de primera mano si es una línea mieloide o no. La mieloperoxidasa es una enzima presente en los ​gránulos de neutrófilos, monocitos, basófilos y eosinófilos​. Si da positiva, vamos a saber que se está hablando de línea mieloide

F​UNDAMENTO​ ​DE​ ​LA​ ​PRUEBA​: -

Se concentra en la actividad de la enzima MPO Se utilizan reactivos como la ​bencidina y peroxido de hidrógeno​, por acción de la mieloperoxidasa, se añaden iones hidrógeno para formar agua y bencidina oxidada. Esta bencidina oxidada precipita de color verde o azul.

I​NTERPRETACIÓN​: -

La prueba se considera positiva cuando ​más del 3% de los blastos se observan este precipitado. En este caso se va a decir con seguridad que se trata de una línea mieloide. Es muy útil para diferenciar LA con morfología similar ya sea mieloide o linfoide. Por ejemplo: LLA-L2 junto con la LMA-M1 Existen formas heredadas de deficiencias de la enzima (son raras), en este caso se va a observar ausente en neutrófilos y monocitos, mientras que en eosinófilos se mantienen normales → esto ayuda para diferenciar

A​CIDO​ P​ERYODICO​ ​DE​ S​CHIFF​ (PAS) En este caso el ácido peryódico lleva a cabo la ​oxidación de diferentes carbohidratos, el principal va a ser el ​glucógeno​. En la oxidación, se convierten a aldehídos, los cuales reaccionan con el reactivo de Schiff. Gracias a esta reacción se libera fucsina, la cual tiñe de rojo elementos celulares oxidables como los lípidos de membrana.

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I​NTERPRETACIÓN Se debe recordar que como con lo que se está reaccionando es con ​glucógeno y este es un elemento presente en toda la línea celular hematopoyética, se va a tener diferentes reacciones según la línea Línea granulocítica -Citoplasma del neutrófilo se tiñe de rosado a rojo intenso -Precursores inmaduros NO se tiñen

Línea monocitoide -TInción rosa ​difusa

Línea megacariocítica -Megacariocitos se tiñen difusos. -Plaquetas se tiñen​ intensamente

Estas diferencias se deben a la presencia de distintos ​elementos oxidables​ en cada línea (aparte del glucógeno) que se tiñen con la fucsina. ➢ PAS y leucemias agudas: -Usualmente positivo en ​LLA-L1 y L2 -En LMA el resultado es muy variable, dependiendo de la subclasificación -Se utiliza para ​apoyar ​el resto de resultados de citoquímica; NUNCA se hace como prueba única.

S​UDÁN​ N​EGRO​ B (SNB) ➔ Muy similar a mieloperoxidasa, de hecho sirve de ​apoyo​ para esta prueba en casos de LMA que son MPO negativa ➔ Positiva ​en ​LÍNEA MIELOIDE, ​en gránulos de neutrófilos, monocitos y eosinófilos.

F​UNDAMENTO​ ​DE​ ​LA​ ​PRUEBA​:

Tiñe diferentes lípidos, principalmente ​fosfolípidos de membranas​ tanto intercelulares como las de los gránulos.

I​NTERPRETACIÓN​: ➔ Línea mieloide: ​positivo ➔ Línea linfoide: negativo

F​OSFATASA​ Á​CIDA Enzima presente en ​lisosomas​ de prácticamente ​todas las células sanguíneas.

F​UNDAMENTO​ ​DE​ ​LA​ ​PRUEBA​:

Realiza una​ hidrólisis​, a un pH ácido, de diferentes ​ésteres de fosfato​, de manera que liberan ​naftoles​ insolubles que reaccionan con sales de diazonio añadidas a la reacción, formando un​ precipitado coloreado​.

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I​NTERPRETACIÓN​: Precipitado rojo granular en todas las células sanguíneas

U​TILIDAD​: ➔ Para identificar Linfocitos T: LLA-T:​ gránulo único, de localización centrosómica. LLA-B:​ actividad dispersa en el citoplasma ➔ Para identificar células ​peludas​ (en tricoleucemia): Actividad muy intensa y dispersa en el citoplasma

E​STERASAS Son enzimas hidrolíticas que utilizan ésteres como sustrato para la formación de diferentes ácidos y alcoholes.

F​UNDAMENTO​ ​DE​ ​LA​ ​PRUEBA​:

En las pruebas de citoquímica de ​LA​ se utilizan ​ésteres sintéticos (de naftaleno)​, que son transformados en ​naftol/naftil​ por los esterasas leucocitarias​. Estos se unen a las sales de diazonio para formar un precipitado coloreado.

Existen diferentes tipos de esterasas (no se detalla más allá de lo que se incluye en la diapositiva):

❖ ANAE (alfa naftil-acetato esterasa) -Esterasa más importante a determinar -Sustrato: alfa naftil-acetato -En ​línea monocítica 7

F​OSFATASA​ A​LCALINA​ L​EUCOCITARIA​ (FAL) Se utiliza para ​diferenciar​ la​ leucemia granulocítica crónica​ de la reacción leucemoide y de los otros síndromes linfoproliferativos crónicos.

F​UNDAMENTO​ ​DE​ ​LA​ ​PRUEBA​:

El sustrato, ​naftol AS-bifosfato​, es hidrolizado por la FAL, formando fosfato y ​acil naftolamida​; esta última reacciona con las sales de diazonio para formar un ​colorante insoluble​ que se observa tanto en ​neutrófilos ​como en ​bandas​. En leucemia granulocítica crónica (LGC) el resultado de esta prueba va a estar disminuido (puntaje menor a 13).

En la imagen, la célula central tiene 4+ de FAL, mientras las periféricas tienen 2+. Es una prueba muy subjetiva, por eso ahora el Dx para LGC se apoya más en la detección del cromosoma Filadelfia.

C​ITOMETRIA​ ​DE​ ​FLUJO F​UNDAMENTO La citometría de flujo utiliza anticuerpos monoclonales, adosados con fluorocromos, que van dirigidos a reconocer proteínas (antígenos) expresados a nivel de membrana celular o intracitoplasmáticos. La señal luminosa emitida por los fluorocromos se convierte en una señal electrónica por el equipo, que a su vez es desplegada en un diagrama de puntos para su posterior interpretación.

D​IAGNÓSTICO Debe conocerse qué es lo normal. Para leucemias agudas, se deben cumplir ciertos objetivos:

1. Identificar: Se debe conocer, por su fenotipo, ​cómo distinguir los diferentes tejidos a estudiar. Por ejemplo: MO vs. Sangre periférica. En MO es normal ver células inmaduras, mientras en sangre periférica no.

O​BJ​ G​ENERALES Para poder realizar un diagnóstico en citometría para las leucemias agudas lo primero que se debe de saber es como luce un tejido normal para poder identificar y diferenciar una célula normal de una célula patológica, y esto se logra cumpliendo con 3 objetivos generales. 1. Identificar 2. Cuantificar 3. Caracterizar 8

I​DENTIFICAR Primero hay que saber distinguir por fenotipo los distintos tipos de tejidos, por ejemplo en una muestra de médula ósea es normal ver células inmaduras, en cambio en sangre periférica no es normal ver células inmaduras. En médula ósea podemos observar precursores de la línea granulocítica y eritroblastos, en sangre periférica no los vamos a observar, estos y otra serie de características con la implementación de anticuerpos que nos ayudan a saber el tipo de tejido que estamos analizando. Podemos estudiar médula ósea, sangre periférica, ganglios, líquido cefalorraquídeo, derrames pleurales, entre otros. Saber de qué tejido estamos hablando es ​Identificar En esta CD45r: ● ● ● ●

imagen de médula ósea normal se puede observa para el anticuerpo Marcado con un cuadrado los eritroblastos que son CD45 negativos A su derecha precursores llamados CD45 débil, que expresan CD34+ Se observan Linfocitos, Monocitos, Granulocitos y Eosinófilos Hay que aprender para cada uno de los anticuerpos como se ve una distribución normal

C​UANTIFICAR Al igual que en un Hemograma hay que aprenderse todos los parámetros normales de todas las líneas celulares para saber si el incremento de una precursor mieloide o de una célula que no se ha diferenciado es por una respuesta reactiva porque el fenotipo es normal o es un aumento con un fenotipo patológico y está respondiendo al inicio de un proceso neoplásico como una Leucemia Aguda o Síndrome Mielodisplásico.

C​ARACTERIZAR Después de haber identificado y cuantificado vamos al cuerpo de la citometría, es el cuerpo porque hay una gran cantidad de estudios de las características celulares para establecer los patrones normales de maduración que son los que nos llevan a determinar si a etapas muy inmaduras de la célula esa célula se está regenerando normalmente. Ejemplo de la diferenciación de las células B para diferentes anticuerpos:

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Cada color va a reperesentar uana célula B en ditinto estadío madurativo Más inmaduras color rosado, y el más maduro de color azul, el verde son estadios intermedios Para el marcador CD45 se observa que a como va madurando va a adquiriendo más intensidad

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El CD34 es un marcador de inmadurez, lo expresan las células madre Se nota más marcado en las células inmaduras y no tanto en las células maduras

Con los marcadores CD10 y CD20 se logra establecer un camino normal de maduración de las células Cuando las células inmaduras expresan CD10 Conforme van madurando lo van perdiendo y adquiriendo CD20 En etapas maduras las células expresan fuertemente CD20

Los marcadores CD34 y CD38 también me generan un patrón Los estadíos inmaduros van a presentar un doble positivo para los dos marcadores Conforme van madurando pierden el CD34 y mantienen el CD38 Las células maduras dejan de expresar el CD38

Una vez que se logran establecer estos patrones con distintos marcadores y sé cuáles son los marcadores que me van a ayudar a estudiar la diferenciación normal para todas las líneas se aborda el estudio de una patología y se realiza una práctica llamada la búsqueda de las ventanas vacías, En las imágenes de marcó con un círculo donde se buscan a los blastos de la línea linfoide. Si se observan células que se salen del patrón normal de maduración (sobreexpresan un marcador o lo dejan de expresar) lo más probable es que sean células patológicas.

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F​ENOTIPOS​ ​ABERRANTES

Características que presentan las células malignas, se pueden englobar en 4 categorías ● Cruce de línea ○ Un linfocito B que expresa un marcador de línea mieloide. Muy raro, pero puede pasar en un Blasto ● Asincronismo ○ Una célula en etapa muy inmadura que expresa un marcador de madurez. ○ Una célula B recién producida expresando CD20, un Blasto puede expresar esto ● Sobreexpresión o Disminución de un marcador ○ Sucede mucho, sobre todo la sobreexpresión ○ Muy característico de un Blasto ● Anormalidad en tamaño o complejidad ○ Células muy grandes o pequeñas ○ Fácilmente identificable por los parámetros de identificación física forward scatter

A​PLICACIONES​ C​LÍNICAS La citometría de Flujo en la Hematología, Oncología, Inmunología y Patología es parte inherente a lo que es el diagnóstico. Las Leucemias Agudas fueron las que le permitieron pasar a la citometría de flujo de la parte investigativa a la aplicación clínica.

H​EMATOLOGÍA 1.

Diagnóstico Es muy útil es primordial saber lo que es normal para diferenciarlo de lo maligno. 2. Clasificación de las Hemopatías a. Asignación de línea b. Estadio de diferenciación 3. Evaluación de la efectividad del tratamiento a. Detección de enfermedad mínima residual (EMR) b. EMR - estratificación de grupos de riesgo (reducción o intensificación del tratamiento) a.

D​IAGNÓSTICO ● ● ●

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Hay una sospecha clínica Se responde la pregunta ¿Es una leucemia? ¿De qué línea?​ determinando el fenotipo El diagrama de flujo en la imagen para el diagnóstico por fenotipo de todas las neoplasias hematológicas nos va a indicar que anticuerpos utilizar para llegar al diagnóstico. ALOT (Tubo Orientativo de Leucemia Aguda) contiene los anticuerpos ideales para decir si es una leucemia y si es de estirpe B, T o Mieloide, para después en un segundo paso colocar los anticuerpos de esas líneas celulares. 11

ALOT (A​CUTE​ L​EUKEMIA​ O​RIENTATION​ T​UBE​) Contiene los siguientes marcadores

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CD34 y CD45 son marcadores de inmadurez, su positividad me permite reconocer células inmaduras Marcadores de línea ○ Mieloperoxidasa cyMPO es un marcador de la línea granulocítica ○ CD 19 y cyCD79a y ya no expresan CD45 me permite reconocer que son blastos de la línea linfoide B ○ CD3 en el citoplasma y CD7 leucemia de estirpe T

Con la utilización de esta simple combinación se contestan esas dos preguntas y se sabe diferenciar cuando llega una sospecha clínica si se trata de Leucemia Linfoide B, Leucemia Mieloide Aguda o Leucemia Linfoide T, por la positividad o negatividad de los distintos marcadores.

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Una vez que se identifica de qué línea es una leucemia se monta el panel completo por citometría, que es el que me brinda la clasificación inmunofenotípica Este es el panel completo para la línea linfoide B, son aproximadamente 30 marcadores en los que se tienen marcadores de: ○ Identificación ​(encerrados en rectángulos rojos en imagen: CD19, CD34, cyCD79a, CD45)​: ​tanto de madurez (señala CD34) como de linaje (en este caso B, señala CD19 y cyCD79a) ○ Maduración ​(rectángulos azules: CD20, CD10, IgM)​: porque hay una clasificación fenotípica, por lo que hay marcadores como el CD20, el CD10 que me van a decir este aunque es un blasto, que se sabe que es inmaduro, se detuvo en esta etapa y recibe un nombre ○ Seguimiento ​(rectángulos amarillos: CD58, CD123, CD24, CD21, CD66c, CD33)​: ​recordar que por citometría de flujo se puede hacer estudios de Enfermedad Mínima Residual, y estos marcadores son primordiales para en estudios subsecuentes identificar los blastos que se vieron al diagnóstico 12

○

Genética (rectángulos morados: NG2, CD9, CD15/CD65, CD81)​: me predicen genéticamente qué alteración fenotípica pueden tener estos blastos, lo cual es importantísimo porque hoy en día muchos de los pronósticos van dados por esa alteración genética

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Resumiendo, dependiendo de los marcadores que presenten, la clasificación inmunofenotípica (para la línea B en este caso) sería: ○ Pro-B ○ B común ○ Pre- B​ (o Pre-B tardía) ○ B madura​ (que generalmente se trata de Linfoma de Burkitt)

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Saber cuáles son los marcadores que se expresan, sobreexpresan o se dejan de expresar, es lo que marca el fenotipo para cada uno de los estadios madurativos. También hay otro patrón fenotípico (en la presentación venía la imagen de abajo, que es igual a la anterior, pero el profe aclara que era diferente) que puede predecir las alteraciones citogenéticas que se puedan tener. O sea, se tienen dos tipos: 1. una marcación fenotípica para establecer la clasificación, y aparte de esto se puede tener dentro de ese conjunto de fenotipos 2. la predicción, por la expresión de ciertos marcadores, de qué alteración 13

citogenética puede tener. Por ejemplo, en una Leucemia Linfoide B se puede predecir por fenotipo cuando va a tener una translocación t(12;21), t(4;11), t(1;19), etc., lo cual es importantísimo para el pronóstico de la leucemia

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EJEMPLO DE ANÁLISIS

El ​primer tubo (1)​ se llama ALOT, tiene los acs mieloperoxidasa, CD79, CD34, CD7, CD19, CD3 de membrana y de citoplasma,y CD45.

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Este es el Forward scatter, llama mucho la atención que sólo vemos pocos gránulos y la mayoría de la población se ubica en la región circulada en rojo, que es donde normalmente se observan los linfocitos.

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Para la identificación de una célula inmadura recordar que se va a utilizar la presencia de los marcadores CD45 y CD34. Generalmente los blastos se ubican en la posición marcada con morado, sin embargo en este caso no se observan, por lo cual este marcador (CD45) en este caso no está ayudando.

Al observar el marcador CD34 se observan unas células que se consideran positivas (encerradas). Estas células representan el 30% de la celularidad total.

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Una célula inmadura normal NUNCA tiene esa ubicación (marcada en rojo) para CD45. Esto quiere decir que ha perdido el marcador, por lo que es un fenotipo aberrante, donde hay ausencia del marcador. Además hay incremento de células inmaduras. Una MO no va a ser normal si: se ve un 30% de células que expresan el CD34. Además se ven células que han perdido el CD45. A partir de esas características se sabe que se está ante la presencia de blastos.

Para saber el linaje de esos blastos se debe usar el ​marcador de línea: mieloperoxidasa. Las células encerradas en verde corresponden al control interno. Son granulocitos normales. Las células desplazadas a la izquierda (marcadas en rojo) son negativas para la mieloperoxidasa. A partir de este resultado NO se puede descartar que sea una leucemia mieloide, debido a qu​e hay M0 y M1, ​(con la misma maduración), que pueden no expresar la mieloperoxidasa, por lo que todavía no se descarta la opción.

ALGUNOS MARCADORES DE LÍNEA T Cy CD3: ● El​ CD3 de citoplasma​ es un marcador de línea T. ● En este caso es​ negativo​ (están desplazadas a la izquierda)

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CD7: ● ●

Otro marcador de línea T es el ​CD7 En este caso también es ​negativo​ (células desplazadas a la izquierda)

ALGUNOS MARCADORES DE LÍNEA B CD19: ●

En este caso se encuentra ​positivo ( desplazado hacia la derecha)

CD79 alfa: ● En este caso se encuentra ​parcialmente positivo

Conclusiones: ● Gracias a la combinación de anticuerpos realizada en estos casos y los resultados obtenidos (marcadores T negativos y B positivos), se sabe que la siguiente combinación de anticuerpos a montar va a ir dirigida a la línea​ linfoide B. ● Al haber utilizado los marcadores mencionados, además de los marcadores de inmadurez (CD34 y CD45) se sabe que es una leucemia. 17

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A partir de los resultados obtenidos con los marcadores se puede iniciar un tratamiento clínico, que es lo esencial. Luego se puede realizar una clasificación específica, para saber a cuál de los 4 grupos ya mencionados pertenece (pro B, B común, Pre B - tardía, B madura) y también se puede hacer la predicción genética que es muy importante. *Para consultas: [email protected]*

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