HISTOLOGIA Técnicas histológicas ao microscópio óptico e eletrônico 2017-2 pdf-1

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HISTOLOGIA Técnicas histológicas ao microscópio óptico e eletrônico Prof.ª Msc. Géssica Araújo 2017/2

Introdução

Introdução O Níveis de organização biológica dos organismos Sistemas Órgãos

Tecidos

Histologia

Células

Histos + Logos (tecido) (estudo)

Organelas Moléculas Átomos

Introdução Tecido Conjunto de células especializadas, iguais ou diferentes entre si, que apresentam a mesma função geral e origem embrionária. São mantidas juntas pela Matriz Extracelular. Tecido Sanguíneo

Introdução O Tipos de tecidos:

Tecido Epitelial

Tecido Conjuntivo Tecido Nervoso

Tecido Muscular

Introdução O Tipos de tecidos:

Tecido Epitelial

Tecido Conjuntivo Tecido Nervoso

Tecido Muscular

Tipo de célula Matriz extracelular (MEC)

Características principais dos quatro tipos básicos de tecidos Tecido

Célula

Matriz extra celular

Funções principais

Epitelial

Células justapostas Pequena quantidade

Protege as superfícies e reveste as cavidades corporais, os órgãos ocos e os ductos (tubos) além de formar as glândulas.

Conjuntivo

Vários tipos de células fixas e migratórias

Abundante

Protege e sustenta o corpo e seus órgãos, mantém unidos os órgãos, armazena energia em forma de gordura e oferece imunidade.

Muscular

Células alongadas contráteis

Quantidade moderada

Gera força necessária para movimentar as estruturas corporais.

Nervoso

Células com longos Nenhuma prolongamentos

Detecta e transmite as mudanças dentro e fora do corpo. Inicia e transmite os impulsos nervosos

Introdução HISTOLOGIA Estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas estruturas se organizam para constituir os órgãos

Introdução O Células  como estudá-las?

Introdução O Microscópio

Microscópio O Início (1600):

- Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos - Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização dos materiais biológicos

Microscópio O Estudo de capilares (1689) O Médicos rejeitaram a microscopia 

Inútil

“Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena, Interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso a nenhum médico” Marcello Malpighi (1628-1694)

Microscópio

Atualmente há microscópio de alta resolução associados a sistemas computadorizados de análise de imagem

Sistema de lentes combinadas colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto

Interação da luz com o espécime

Absorção

ou

Refração dos raios de luz

Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve

Microscópio O Importância para: • Química

• Fisiologia • Imunologia

• Microbiologia • Patologia

Fundamentais para um conhecimento adequado da biologia das células, dos tecidos e órgãos Ex.: Seus vários componentes Como interagem na saúde e na doença

Microscópio Câncer - Adenocarcinoma

Microscópio Interação patógeno-hospedeiro

Microscópio Interação patógeno-hospedeiro

Preparação do material

Preparação do material O Células e camadas podem ser observadas diretamente ao

microscópio  muito delgadas O É possível estudar essas estruturas sob diferentes condições

fisiológicas ou experimentais

Preparação do material Maioria dos tecido e órgãos são espessos Cortes histológicos Delgados

Preparação do material Maioria dos tecido e órgãos são espessos Cortes histológicos Delgados

Preparação do material O Micrótomos • Instrumentos de grande precisão no corte

* Lâmina de aço ou de vidro • Cortes de 1 a 10 micrômetros de espessura

Preparação do material O Micrótomos • Instrumentos de grande precisão no corte

* Lâmina de aço ou de vidro • Cortes de 1 a 10 micrômetros de espessura

1µm= 0.0001 cm

Preparação do material O Etapas de tratamento antes do corte: 1. 2. 3. 4.

Fixação Desidratação Inclusão Coloração

• •

Este processo pode demorar de 12 h a 2 dias Depende: do tamanho do tecido do fixador do meio de inclusão

Preparação do material 1.

Fixação

O Finalidades: • Evitar a digestão dos tecidos por enzimas existentes nas próprias

células (autólise) ou em bactérias • Endurecer os fragmentos • Preservar a estrutura e a composição molecular dos tecidos O Métodos: químicos (mais usado) ou físicos

Preparação do material 1.

Fixação

Método químico O Amostra é cortada em fragmentos menores *maior penetração e preservação O Imersa na solução fixadora * agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas (pontes com moléculas adjacentes)

*Ex.: formaldeído 4% e o glutaraldeído  Perfusão intravascular do fixador  Modo alternativo

*Alcança o interior dos tecidos rapidamente pelos vasos sanguíneos *Melhor fixação

Preparação do material 1.

Fixação

Método químico O No Microscópio eletrônico e necessário maior cuidado na fixação

* preservar detalhes da ultraestrutura das células e da matriz O Fixação dupla: 1ª glutaraldeído tamponado + 2ª tetróxido de ósmio

(preserva e fornece contraste aos lipídios e proteínas)

Preparação do material 2.

Desidratação

O O fragmento passa por soluções de concentrações crescentes de

etanol (etanol 70% em água até etanol 100%)  água é extraída O Após a desidratação, o etanol é substituído por uma substância

intermediária (geralmente um solvente orgânico) Ex.: Parafina  xilol e o toluol O Fragmentos embebidos no solvente orgânico ficam transparentes

(clareamento)

Preparação do material 3.

Inclusão

O O fragmento é infiltrado com uma substância que lhe dá uma

consistência rígida (obter secções delgadas com o micrótomo) O Ex.: Parafina derretida (56 a 60ºC)

*O calor causa a evaporação do solvente orgânico *Os espaços são preenchidos com parafina O Parafina solidifica e ele se torna rígido O O bloco de parafina com a amostra é levado ao micrótomo O Os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície de

água aquecida e corados em lâminas de vidro

Preparação do material 1.

Fixação

Método Físico por congelamento (menos usado) O Submete os tecidos a um congelamento rápido  tornando-se

rígidos  seccionados

O Criostato ou criomicrótomo

* micrótomo para tecidos congelados O Preparação rápida (não passa pela desidratação e inclusão)

O Utilizado em: - Hospitais para analisar espécimes obtidos durante cirurgias - Estudo histoquímico de enzimas (não inativa e mantém em suas

conformações naturais e em seus locais originais) - Estudo de lipídios (solventes como xilol dissolve essas substâncias)

Preparação do material 4.

Coloração

O Tecidos são incolores O Tornam evidentes os componentes dos tecidos, células e da MEC O Tipos:

Corante básico  afinidade por basófilos (ex.: ácidos nucleicos) Ex.: azul de toluidina, o azul de metileno e hematoxilina Corante ácido  afinidade por acidófilos (ex.: mitocôndrias) Ex.: orange G, eosina e fucsina ácida O Hematoxilina (núcleo) + eosina (HE) (citoplasma)  mais utilizada O Uma maneira de evidenciar componentes de células e tecidos 

impregnação por metais (prata e ouro) tecido nervoso

Citoplasma = corante ácido Eosina

Núcleo = corante básico Hematoxilina

Células renais de carcinoma humano

Classificação dos Microscópios em função do número de sistemas de lentes O Microscópio simples ou Lupa – apenas possui uma

lente ou um sistema de lentes centradas

O Microscópio composto – possui dois sistemas de

lentes centradas (ocular e objectiva) para produzir uma imagem ampliada

Classificação dos Microscópios compostos em função do princípio de iluminação que utiliza O Fotônico – o responsável pela transmissão de

imagem é um feixe de fótons (luz visível, ultravioleta ou infra-vermelho) O Eletrônico – emprega um feixe de elétrons para

produzir imagens ampliadas.

Microscópio de luz O = Microscópio óptico ou fotônico O A imagem se forma a partir dos raios luminosos de um feixe de

luz que atravessa a amostra

Imagem II Image mI

objeto F

F

C Fonte de luz

condensadora

F

C objetiva

C

ocular

Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular

Microscópio de luz O Composto de partes mecânicas e ópticas O Componente óptico: • Condensador: concentra a luz de uma lâmpada e projeta um

feixe luminoso sobre o espécime • Objetivas: recebem a luz que atravessou o espécime e projetam uma imagem aumentada do espécime em direção à ocular • Oculares: ampliam a imagem e a projetam na retina, numa tela, ou em uma câmera fotográfica Imagens projetadas na retina Ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objetiva pelo aumento da ocular

Microscópio de luz O Resolução

Menor distância entre duas partículas ou entre duas linhas Distância essa que possibilita que elas sejam vistas como dois objetos separados. Fator crítico para uma imagem aumentada e com muitos detalhes • Resolução máxima do M. de luz: aproximadamente 0,2 µm •

EX.: Objetos menores que 0,2 µm (ex.: membrana) não são distinguidos Dois objetos (ex.: 2 mitocôndrias) serão vistos como um só objeto se estiverem separados por menos de 0,2 µm.

Microscópio de luz O Resolução

O que determina a riqueza de detalhes da imagem é o limite de resolução de um sistema óptico e não seu poder de aumento.

Oculares

Ampliam a imagem fornecida pelo sistema de objectivas

Canhão ou tubo

Serve de suporte ao sistema ocular

Braço

Serve de suporte à platina e ao revólver

Revólver

Serve de suporte às objectivas e permite a sua mudança

Objectivas

Amplia a imagem do objecto que está a ser observado.

Platina Serve de suporte à preparação Tem uma abertura na pane central (janela da platina)

Condensador

Distribui regularmente no campo da preparação a luz que atravessa o diafragma

Diafragma Regula a intensidade da luz captada pelo espelho e que incide na preparação

Fonte de Luz

Parafusos Macrométrico e Micrométrico

Permite movimentos (de maior ou menor amplitude) de aproximação ou afastamento entre a preparação e as objectivas

Base ou pé Constitui a base de suporte de todos os elementos do microscópio

Microscópio de contraste de fase e de contraste diferencial de interferência O Possibilitam a observação de células e cortes não corados O O 1º usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de

objetos quase transparentes O O 2º produz uma imagem aparentemente tridimensional O Imagens são sempre vistas em preto, branco e tons de cinza

Microscópio de fluorescência Fluorescência Quando substâncias são irradiadas por luz de um determinado comprimento de onda e emitem luz com um comprimento de onda mais longo. O As secções são iluminadas por uma fonte de luz de mercúrio sob

alta pressão O Filtros especiais permitem selecionar o comprimento de onda dos

raios luminosos que alcançam o espécime O As substâncias fluorescentes são observadas como objetos

brilhantes e coloridos

Microscópio de fluorescência O Substâncias fluorescentes que tenham afinidade por moléculas

encontradas nas células ou na matriz extracelular podem ser usadas como corantes fluorescentes EX.: alaranjado de acridina  DNA e o RNA DNA+alaranjado de acridina  fluorescência de cor verde-amarelada RNA+alaranjado de acridina  fluorescência vermelho-alaranjada

Marca com substâncias fluorescentes (fluorocromos) → emitem brilho contra fundo escuro

DNA - verde

Alaranjado de acridina (fluorocromo)

RNA - vermelho

Microscópio confocal O Focaliza um plano muito fino do espécime O Fundamentos : • O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito 

Só a imagem originada do plano focalizado alcança o detector (imagens de outros planos são bloqueadas) • A definição do objeto focalizado é melhor e a localização de

componentes é mais precisa que ao microscópio de luz • o componente do espécime que é de interesse deve ser marcado com uma molécula fluorescente • os microscópios confocaís dependem de grande capacidade de computação

Microscópio eletrônico O Dois tipos: transmissão e de varredura O Baseiam na interação entre elétrons e componentes dos tecidos  Microscopia eletrônica de transmissão • Altíssima resolução (3 nm) (ampliação de 400 mil vezes)

• Usado para analisar partículas ou moléculas isoladas • Configuração:

Lente condensadora  focaliza o feixe de elétrons no espécime - Lente objetiva forma uma imagem aumentada do objeto, a qual é projetada nas outras lentes que aumentam a imagem ainda mais - Nossa retina não é sensível a elétrons necessário que os elétrons sejam captados por um detector para se observar uma imagem em preto e branco -

Microscópio eletrônico O Dois tipos: transmissão e de varredura O Baseiam na interação entre elétrons e componentes dos tecidos  Microscopia eletrônica de varredura • Imagens pseudotridimensionais

• Um feixe de elétrons de diâmetro muito pequeno é focalizado

sobre o espécime, percorrendo sequencialmente (i. e., varrendo) sua superfície • Os elétrons não atravessam o espécime  eles varrem uma fina camada de metal aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal  são capturados pelo detector • Imagem em preto e branco

Principais diferenças

Microscópio de luz (ML)

Microscópio eletrônico de transmissão (MET)

Fonte

Luz (porção inferior)

Elétrons (porção superior)

Lentes

Vidro

Eletromagnéticas

Lentes de aumento (principal)

Objetivas e oculares

Eletromagnéticas

Suporte para amostra

Lâmina de vidro

Grade de metal (telinha) Cobre ou níquel

Limite de resolução

0,2 µ

0,0002 µ

Formação da imagem

Transparência e coloração

Variações de densidade e contrastação

Técnicas que utilizam o microscópio O Cultura de células e tecidos • Células mantidas vivas e estudadas fora do corpo • Utilidade: efeito isolado de moléculas, fármacos, patógeno, ciclo

celular e etc. • Cultivadas em soluções de composição conhecida sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro O Histoquímica e citoquímica • Métodos que identificam e localizam substâncias (células ou

tecidos) Ex.: DNA, proteínas, íons e etc.