Determinación de proteínas por el método del ácido bicinconínico-marca de agua

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) OBJETIVOS El alumno:

N

a) Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. b) Conocerá el efecto de sustancias no proteicas sobre el desarrollo de la reacción colorida.

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c) Determinará si existen diferencias estadísticamente significativas en la precisión y la exactitud, entre los métodos de Bradford y del BCA. d) Analizará las ventajas y desventajas del método del BCA, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas. Conceptos básicos: Proteína, método fotométrico, ley de Bouguer y Beer, media, desviación estándar, espectrofotómetro, coeficiente de variación, varianza, límites de confianza, prueba de t de Student, prueba de F, interferencias, regresión lineal, coeficiente de correlación (r), sensibilidad del método, diferencia estadísticamente significativa.

INTRODUCCIÓN

EN

Considerando la relevancia biológica de las proteínas, caracterizar y cuantificar estas biomoléculas se ha convertido en una de las principales tareas en el campo científico. En particular, basados en la ley de Bouguer y Beer, los métodos espectrofotométricos son quizá, la herramienta más utilizada en química clínica, química ambiental y bioquímica, por referir algunas áreas, para determinar la concentración de diferentes moléculas, incluidas las proteínas. En 1985, Smith y colaboradores desarrollaron un nuevo método para cuantificar la cantidad de proteína, basándose en el método tradicionalmente utilizado, que había sido propuesto por Lowry y colaboradores en la década de los cincuenta. En el nuevo método, la primera etapa se desarrolla en medio alcalino y consiste en la reducción del ion cúprico (Cu2+), después de reaccionar con la proteína presente en la muestra (reacción de biuret). Posteriormente, el ión cuproso (Cu+1) se hace reaccionar con el ácido bicinconínico (BCA), para formar un complejo colorido [Cu(BCA)2], cuya absorbancia puede leerse a 562 nm.

MATERIAL Y APARATOS 1. 2. 3. 4.

Dos gradillas Veintisiete tubos de ensaye de 13 X 100 mm Dos micropipetas de 100 – 1000 μL Puntas para micropipetas

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5. Una probeta de 50 mL 6. Una pipeta de 10 mL 7. Espectrofotómetro para la región visible 8. Veintisiete celdas para el espectrofotómetro 9. Un vaso de precipitados de 100 mL 10. Rollo de plástico autoadherente 11. Potenciómetro

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PROCEDIMIENTO I.CURVA DE CALIBRACIÓN

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Para hacer la curva de calibración, agregar los reactivos como se indica en la tabla 1, teniendo cuidado de mezclar después de agregar a la proteína el disolvente y el reactivo de BCA*. Para mezclar, cubrir los tubos con plástico autoadherente y agitar perfectamente por inversión. Posteriormente, incubar los tubos en el baño de agua a 60ºC durante 30 min, para permitir el desarrollo del color. Concluido el periodo de incubación, dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente y leer en el espectrofotómetro a 562 nm, ajustándolo previamente a 100 % T con el tubo 6. *NOTA: el reactivo de BCA se prepara al momento de usarse, mezclando 15 mL de reactivo A con 0.15 mL de reactivo B. TABLA 1. PREPARACIÓN DE LA CURVA TIPO PARA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL BCA

EN

Tubo No.

Solución de proteína (20 μg/mL) (μL) 100 200 300 400 500 0.0

1 y 1’ 2 y 2’ 3 y 3’ 4 y 4’ 5 y 5’ 6 y 6’

Agua destilada (μL)

Reactivo de BCA (μL)

400 300 200 100 0.0 500

500 500 500 500 500 500

II. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para realizar el análisis estadístico, preparar 10 tubos en las mismas condiciones que el tubo 3 de la curva de calibración, mezclar perfectamente e incubar a 60 ºC durante 30 min, para permitir el desarrollo del color. Finalmente, dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente y leer en el espectrofotómetro a 562 nm, ajustándolo previamente a 100 %T con el tubo 6 (Tabla 1).

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III. EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS QUE INTERFIEREN EN EL MÉTODO DEL BCA Para determinar del efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo de color, siguiendo el método del BCA, agregar los reactivos como se indica en la tabla 2. Mezclar perfectamente e incubar a 60 ºC durante 30 min, para permitir el desarrollo del color.

N

Por último, dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente y leer en el espectrofotómetro a 562 nm, ajustándolo previamente a 100 % T con el tubo 6 preparado para la curva de calibración (Tabla 1). TABLA 2. EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS EN EL MÉTODO DEL BCA Solución de proteína (20 μg/mL) (μL) 300 300 300 300 300

Sustancia no proteínica (100 μL)

Reactivo de BCA (μL)

100 100 100 100 100

500 500 500 500 500

C BIP

Tubo No.

Agua destilada (μL)

1 2 3 4 5

Fenol al 0.2 % Detergente comercial al 0.2 % SDS al 0.2 % Mercaptoetanol al 0.002 % EDTA 6 mM

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

I. ELABORACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

EN

Complete la tabla 3 y con los datos obtenidos por duplicado, haga un gráfico en el que se muestren los puntos experimentales y la recta ajustada por regresión lineal, colocando en el eje de las ordenadas la absorbancia a 562 nm y en el de las abscisas la cantidad de proteína en µg.

TABLA 3. CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA O HEMOGLOBINA MÉTODO DEL BCA.

Tubo No.

Concentración de proteína (µg/mL)

A562 Serie a

Serie b

1 2 3 4 5

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A partir de los datos obtenidos por regresión lineal y su curva de calibración: a. Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación. Diga cómo se interpretan estas variables matemáticas en la curva de calibración del método espectrofotométrico.

N

b. ¿Cumple su curva la Ley de Bouger y Beer? ¿Entre qué límites de cantidad de proteína? Explique brevemente su respuesta. c. A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína.

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II. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Utilizando la expresión matemática obtenida en el inciso c del punto anterior, calcule la concentración de proteína, en µg/mL, de cada uno de los 10 tubos preparados para el análisis estadístico, y repórtela en la tabla 4. A partir de la concentración de proteína determinada en cada tubo:

a. Calcule la media o promedio ( ), la desviación estándar (s), la varianza (s2), el porciento del coeficiente de variación (% CV) y el intervalo de confianza de la media poblacional (IC de µ), con una confiabilidad del 95 % (Tabla 5). Asimismo, realice una estimación de la precisión y la exactitud del método del BCA.

TABLA 4. RÉPLICAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO

EN

Tubo No.

A562

Concentración de proteína (µg/mL)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

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TABLA 5. RESULTADOS DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO

s

S2

IC de μ

% C.V.

N

Precisión: Exactitud:

C BIP

b. Utilizando los datos de la determinación de proteínas por los métodos de Bradford y del BCA, plantee las hipótesis adecuadas y aplique las pruebas t de Student y de F de Fisher, para determinar con una confiabilidad del 95 % si existe diferencia significativa entre estos métodos. III. EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS EN EL MÉTODO DEL BCA Con los resultados obtenidos en el efecto de sustancias no proteínicascas sobre el desarrollo de la reacción colorida, utilizando el método del BCA, complete la tabla 6. TABLA 6. EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS EN EL MÉTODO DEL BCA Sustancia

A562

Concentración de proteína (μg/mL)

Tipo de interferencia generada

Fenol al 0.2 % Detergente comercial al 0.2 % SDS al 0.2 % Mercaptoetanol al 0.002 % EDTA 6 mM

EN

Tubo No . 1 2 3 4 5

Interprete sus resultados y cuando aplique dé una explicación de la posible causa de la interferencia.

IV. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS UTILIZADOS PARA CUANTIFICAR PROTEÍNAS En una tabla resuma las ventajas y desventajas de los siguientes métodos empleados para determinar proteínas: biuret, Bradford, Lowry, absorbancia a 280 nm, BCA.

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C BIP

N

DISCUSIÓN

EN

CONCLUSIONES

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

EN

C BIP

N

1. Christian, G. 2009. Capítulo 16. Métodos Espectroquímicos. En: Química Analítica. 6ta ed, McGrawHill, México. 2. Nelson, D.L. and Cox, M.M. 2000. Chapter 7. Protein Function. In: Lehninger Principles of Bichemistry. 3rd ed, Worth Publishers, New York, USA. 3. Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., Crouch, S.R. 2005. Capítulo 26. Espectrometría de absorción molecular. En: Fundamentos de Química Analítica. 8va ed, Thomson, México. 4. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mollia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C. 1985. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal Biochem. 150:76 – 85. 5. Stryer, L., Berg, J.M., Tymoczko. 2004. Capítulo 3. Estructura y función de las proteínas. En: Bioquímica. 5ta ed. Reverté SA, Barcelona, España. 6. Thermo Scientific. Instructions PierceTM BCA Protein Assay Kit (in Product 23225).

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