Estudos referente ao tratamento de Vitiligo pelos princípios presentes na Pyrstegia venusta

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO – CÂMPUS DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS NATURAIS, HUMANAS E SOCIAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS

EFEITO ANTIMUTAGÊNICO DO EXTRATO DE Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers NANOESTRUTURADO EM LIPOSSOMA E NANOPARTÍCULA POLIMÉRICA

PATRÍCIA ZANCO

Sinop - MT 2018

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PATRÍCIA ZANCO

EFEITO ANTIMUTAGÊNICO DO EXTRATO DE Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers NANOESTRUTURADO EM LIPOSSOMA E NANOPARTÍCULA POLIMÉRICA

Orientadora: Profa. Dra. Marina Mariko Sugui Co-orientadora: Profa. Dra. Stela Regina Ferrarini

Dissertação apresentada ao PPGCAM como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. Área de concentração: Bioprospecção.

Sinop - MT 2018

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Ficha Catalográfica

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Sinopse: Avaliou-se o potencial quimioprotetor do extrato etanólico de Pyrostegia venusta nanoestruturado em lipossomas convencionais e nanopartículas poliméricas, bem como seus possíveis efeitos tóxicos in vivo. Palavras-chave: Cipó de São João, Nanotecnologia, Antimutagênico.

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Dedicatória

À minha família, Edelar, Neiva, Caroline e Maurício, sempre me apoiando em todos os meus momentos, por serem a minha base e alegria.

Ao

Kelvim

pelo

apoio

nos

momentos difíceis, pelo amor e paciência.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por tornar possível este sonho. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus de Sinop, juntamente com seus professores, colaboradores e cada amigo inesquecível que fiz na turma de 2016. A professora Dra. Marina Mariko Sugui, que aceitou ser minha orientadora. Por sua paciência e carinho sem limites. A professora Dra. Stela Regina Ferrarini pelo imenso apoio e confiança em minha jornada e pelas conversas e conselhos valiosos. A professora Dra. Valéria Dornelles Gindri Sinhorin, pela oportunidade de poder desenvolver parte da minha pesquisa no laboratório de Bioquímica/LIPEq e pela aluna e amiga Tatiane Cordeiro pela ajuda e amizade. Ao Rogério de Campos Bicudo, da EMBRAPA-Sinop pela colaboração com as análises fitoquímicas. Ao Prof. Gerardo Magela Vieira Júnior da Universidade Federal do Piauí pela disponibilização do extrato. Agradeço ao Wemerson Aparecido da Silva Ferreira, aluno do curso de Farmácia – UFMT/Câmpus Sinop, pela imensa colaboração durante os experimentos. Agradeço ao Cleberson Lira, técnico de laboratório– UFMT/Câmpus Sinop, pela imensa ajuda na etapa final do procedimento.

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“Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o que, com frequência, poderíamos ganhar, por simples medo de arriscar. ” William Shakespeare

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SUMÁRIO 1.

Introdução ..............................................................................................................11

2.

Material e Métodos ................................................................................................13 2.1

Sistema teste............................................................................................................... 13

2.2

Substância química ................................................................................................... 13

2.3

Obtenção do extrato etanólico de Pyrostegia venusta ............................................. 14

2.4

Desenvolvimento das nanoestruturas ...................................................................... 14

2.5

Caracterização físico-química das nanoestruturas ................................................ 15

2.6 Identificação de componentes fenólicos presentes no extrato de Pyrostegia venusta .................................................................................................................................... 15 2.7

Teste do Micronúcleo in vivo .................................................................................... 15

2.8

Delineamento Experimental ..................................................................................... 16

2.9

Análise bioquímica .................................................................................................... 17

2.10

Análise Estatística ..................................................................................................... 17

3.

Resultados ...............................................................................................................18

4.

Discussão .................................................................................................................21

5.

Conclusão ................................................................................................................24

Referências .....................................................................................................................25 ANEXOS ........................................................................................................................30

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CAPÍTULO I

EFEITO ANTIMUTAGÊNICO DO EXTRATO DE Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers NANOESTRUTURADO EM LIPOSSOMA E NANOPARTÍCULA POLIMÉRICA

Artigo a ser submetido à revista Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis

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Efeito antimutagênico do extrato de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers nanoestruturado em lipossoma e nanopartícula polimérica Patrícia Zancoa, Letícia Cruzb, Rogério de Campos Bicudoc, Gerardo Magela Vieira Júniord, Stela Regina Ferrarinie, Marina Mariko Suguia,e. a

Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais (PPGCAM), Instituto de Ciências Naturais, Humanas e Sociais (ICNHS), Universidade Federal de Mato Grosso, Sinop, Mato Grosso, Brasil. b Doutora em Ciências Farmacêuticas pela Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. c Laboratório de Análise de Água, Pesquisa e Desenvolvimento, EMBRAPA, Sinop, Mato Grosso, Brasil. d Departamento de Química, Universidade Federal do Piauí, Teresina, Piauí, Brasil. e Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso, Sinop, Mato Grosso, Brasil.

Resumo A Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers é uma planta comumente utilizada no tratamento de leucoderma ou vitiligo. O seu potencial biológico envolve a presença de compostos provenientes do seu metabolismo secundário, como os flavonóides que possuem potencial antioxidante, capazes de reduzir e/ou impedir danos celulares. A associação da nanotecnologia aos extratos vegetais visa a potencialização da atividade farmacológica de ativos oriundos de extratos de plantas. Neste contexto, desenvolveu-se lipossomas e nanopartículas poliméricas contendo extrato etanólico de P. venusta que foram caracterizados físico-quimicamente em relação ao diâmetro médio da partícula, índice de polidispersão, pH e potencial zeta (ξ). Foram identificados a presença dos flavonóides apigenina, luteolina, miricetina, quercetina-3-β-d-glicosídeo e rutina por LC-MS/MS. Avaliou-se o efeito quimioprotetor do extrato etanólico de folhas da P. venusta livres e nanoestruturados na concentração de 1.0 mg/mL (m/v) frente a danos induzidos quimicamente ao DNA através do Teste de Micronúcleo in vivo. Os camundongos Swiss machos foram tratados, via gavagem, com os extratos nanoestruturados, extrato bruto e nanoestruturas livres, por 15 dias consecutivos e foram tratados com N-etil-N-nitrosuréia (ENU, 50.0 mg/Kg), via intraperitoneal, no 15º dia do tratamento. Os resultados demonstraram que os extratos nanoestruturados (LPEPV e NPEPV) reduziram significativamente (p≤ 0.05) a frequência de micronúcleos em células de medula óssea quando comparado aos seus respectivos controles positivos e extrato livre (EPV), potencializando o efeito quimioprotetor da P. venusta. Análises bioquímicas para alterações de níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e creatinina (CR) foram realizadas nos animais tratados com P. venusta nanoestruturados e livre e não demonstraram alterações durante o tratamento. Assim, nas condições realizadas, o extrato etanólico de P. venusta apresentou um potencial biológico na prevenção da etapa de iniciação da carcinogênese. Palavras-chave: Pyrostegia venusta; Lipossomas convencionais; Nanopartículas poliméricas; Quimioprevenção; Plantas medicinais.

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Abstract Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers is a plant commonly used in the treatment of leucoderma or vitiligo. Its biological potential involves the presence of compounds from its secondary metabolism, such as flavonoids that have antioxidant potential, capable of reducing and/or preventing cellular damage. The association of nanotechnology with plant extracts aims at enhancing the pharmacological activity of plant extracts. In this context, liposomes and polymeric nanoparticles containing ethanolic extract of P. venusta were developed that were physicochemically characterized in relation to the average particle diameter, polydispersity index, pH and zeta potential (ξ). The presence of flavonoids apigenin, luteolin, myricetin, quercetin-3-β-d-glucoside and rutin by LCMS/MS were identified. The chemoprotective effect of ethanolic extract of free and nanostructured P. venusta leaves at the concentration of 1.0 mg/mL (m/v) against chemically induced damage to ADN was evaluated through the in vivo Micronucleus Test. The male Swiss mice were treated via gavage with the nanostructured extracts, crude extract and free nanostructures for 15 consecutive days and were treated with Nethyl-N-nitrosurea (ENU, 50.0 mg/kg) intraperitoneally at the 15th day of treatment. The results demonstrated that the nanostructured extracts (LPEPV and NPEPV) significantly reduced (p≤ 0.05) the frequency of micronuclei in bone marrow cells when compared to their respective positive controls and free extract (EPV), potentiating the chemoprotective effect of P. venusta. Biochemical analyzes for changes in serum levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and creatinine (CR) were performed in animals treated with P. venusta nanostructured and free and showed no changes during treatment. Thus, in the conditions performed, the ethanolic extract of P. venusta presented a biological potential in the prevention of the stage of initiation of carcinogenesis.

Keywords: Pyrostegia venusta; Liposomes; Polymeric nanoparticles; Chemoprevention; Medicinal plants.

1. Introdução Muitos componentes tóxicos possuem afinidade com o organismo e alta capacidade de reagir com o nosso material genético [1]. Quando as células são expostas a uma substância química potencialmente tóxica, é possível então, encontrar pequenas massas intracitoplasmáticas na cromatina das células. Essas massas apresentam aspecto de um pequeno núcleo no citoplasma e fora de seu núcleo maior, sendo denominados de micronúcleos. Estes micronúcleos são formados devido a quebras cromossômicas ou de cromossomos que se perdem durante a divisão celular [1]. As formações destes micronúcleos podem ser espontâneas, porém alguns compostos possuem a capacidade

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de intensificar a ocorrência de lesões e para as células isso pode caracterizar um evento mutagênico e possível evasão da apoptose [2]. Sendo assim, a quimioprevenção baseia-se no uso de agentes químicos naturais ou sintéticos para reverter, prevenir ou suprimir a progressão carcinogênica [3]. Assim, compostos com atividade quimioprotetora presentes na natureza, que sejam de fácil obtenção, são de grande relevância para a saúde pública e uma alternativa para a redução das taxas de neoplasia [4]. Neste contexto, a identificação de agentes quimioprotetores é relevante como uma possível estratégia na prevenção do câncer. Algumas plantas têm demonstrado efeitos quimiopreventivos e antineoplásicos importantes a partir de seu uso, mas cuja utilização ainda deve ser bastante criteriosa, pois muitas delas também possuem efeitos colaterais [1,2]. Assim, o desenvolvimento de estudos que proporcione um melhor entendimento do uso desses agentes e sua possível ação farmacológica, quer seja do ponto de vista fisiológico ou molecular, pode elucidar uma melhor análise do risco/benefício e sua seleção contra doenças relacionadas a eventos genotóxicos [1,2,3]. Dessa forma, conhecer seus efeitos farmacológicos, bem como a comprovação de sua eficácia tornase de extrema importância [5,6]. Uma espécie ainda pouco estudada é a Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers, pertencente à família Bignoneaceae, também conhecida como Pyrostegia ígnea, de nomes populares Cipó ou Flor de São-João. Estudos mostram que o extrato alcoólico de flores e folhas são utilizados na medicina popular para tratar manchas brancas no corpo conhecidas como leucoderma ou vitiligo [7]. A Pyrostegia venusta apresenta ser uma importante fonte natural de antioxidantes, pois contém quantidades significativas de metabólitos secundários, como os compostos fenólicos, que podem servir como inibidores ou eliminadores de radicais livres [8,9,10,11]. Assim, associado ao uso de plantas medicinais com potencial antioxidante relevante tem-se a nanotecnologia, uma ciência que desenvolve produtos tecnológicos em nível nanométrico. Essa associação busca otimizar as doses terapêuticas dos compostos vegetais em estrutura físico-química estável e com afinidade biológica. Observa-se também o aumento do índice terapêutico, melhora de estabilidade, proteção contra a degradação física e química e manutenção do nível sérico dos compostos nanoestrututados [12,13]. As matrizes de extratos de plantas são complexas e a solubilidade e biocompatibilidade com o tecido podem ser dificultosas. Dessa forma, a

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administração destes nanossistemas é uma alternativa eficaz para reverter esses fatores [14]. Dentre estes nanossistemas coloidais, os lipossomas e as nanopartículas poliméricas são importantes tipos de vetores utilizados para fins de pesquisas. Os lipossomas apresentam ampla faixa de tamanho variando de nanômetros a micrômetros. São constituídos por uma ou mais bicamadas fosfolipídicas concêntricas de características anfifílicas dispersas [11,15]. As nanopartículas poliméricas são compostas, em sua maioria, de polímeros sintéticos biodegradáveis e biocompatíveis, como é o caso do poli – Ɛ (caprolactona) (PCL) [16]. Neste contexto, o presente trabalho identificou a presença de flavonóides no extrato de folhas de P. venusta, avaliou o efeito quimioprotetor do extrato nanocarreados em lipossomas e nanopartículas poliméricas frente a danos induzidos ao DNA in vivo, bem como verificou o possível efeito hepatotóxico e nefrotóxico através de dosagens de transaminases hepáticas (AST e ALT) e creatinina (CR), respectivamente. 2. Material e Métodos 2.1 Sistema teste Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) – UFMT/Câmpus de Cuiabá - MT pelo número de protocolo 23108.720740/2016-39. Foram utilizados camundongos Swiss machos com 6 semanas de idade e peso aproximado de 25 g, adquiridos no Biotério Central da mesma universidade. Durante o período experimental, os animais foram mantidos em gaiolas coletivas no Biotério da UFMT/Câmpus de Sinop - MT sob condições controladas de temperatura (22 ± 2º C), umidade relativa (55 ± 10 %), ciclo de luz (12 horas claro/escuro), exaustão e recebendo ração comercial peletizada e água filtrada ad libitum. 2.2 Substâncias químicas Foram utilizados extrato hidroalcoólico de P. venusta, N-etil-N-nitrosuréia (ENU, Sigma Aldrich, Saint Louis, USA), polissorbato 80 da (Delaware, Porto Alegre, Brasil), poli – Ɛ (caprolactona) de peso molecular (Mn) = 80.000 g / mol (PCL,) e monostearato de sorbitano (Sigma-Aldrich, Lesquin, França), Lipoid S75 (Sanbio

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Científica, São Paulo, Brasil) e triglicerídeo caprílico/caprico (Brasquim, São Paulo, Brasil). 2.3 Obtenção do extrato etanólico de Pyrostegia venusta A Pyrostegia venusta foi coletada no município de Sinop/MT nas coordenadas geográficas 11º52'12.8"S/55°31'18.4"W em novembro de 2014, identificada e armazenada no Herbário Centro-Norte Mato-Grossense da UFMT/Sinop. O extrato de P. venusta, foi obtido através das folhas, onde estas foram secas e trituradas até a obtenção de massa final de 2,39 Kg. Este material passou por processo de maceração com 21,5 L de etanol por aproximadamente 7 dias, após esse período o extrato obtido foi filtrado e concentrado através de rotaevaporação. O extrato etanólico das folhas apresentou rendimento de 5,67% sendo que a massa obtida foi de 135,7 g. 2.4 Desenvolvimento das nanoestruturas

Os lipossomas foram desenvolvidos pelo método de evaporação em fase reversa [17]. Foram preparadas a fase aquosa contendo 1 mg/mL (m/v) de extrato etanólico de P. venusta e 0.25 % (w/v) de polissorbato 80 em tampão fosfato salino pH 7,4 e a fase orgânica contendo fosfatidilcolina de soja (1.2 g) e colesterol (0.06 g) em 40 mL de clorofórmio. Uma alíquota da solução aquosa (4 mL) foi vertida na fase orgânica e sonicada por 5 min obtendo então uma dispersão de micelas invertidas. Com o auxílio do evaporador rotatório, o solvente orgânico foi removido a 25 ºC, resultando no organogel. Posteriormente o restante da solução aquosa (96 mL) foi adicionada mantendo sob agitação por 30 minutos. As vesículas sofreram extrusão em membrana 0.22 µm. Além dos lipossomas contendo o extrato etanólico de Pyrostegia venusta (LPEPV), também foram desenvolvidos lipossomas sem ativo (LPBr), tal como descrito acima. As nanopartículas poliméricas foram desenvolvidas através do método de emulsificação/evaporação de solvente descrito por Quintanar-Guerrero et al. [15] e Bitencourt et al. [18].

Extrato etanólico das folhas de Pyrostegia venusta na

concentração de 1mg/mL (m/v) foi dissolvido na fase aquosa contendo 1 % (m/v) de polissorbato 80. A fase orgânica (acetato de etila) foi preparada contendo 1 % (m/v) de PCL e 1 % (m/v) de monooleato de sorbitano. Ambas as fases foram submetidas separadamente a agitação moderada a 40º C. Após percorrido 60 min, a fase aquosa foi

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adicionada na fase orgânica, formando a emulsão primária. Esta emulsão foi mantida sob forte agitação magnética por 20 minutos e, em seguida, uma segunda fase aquosa contendo 2 % (m/v) de polissorbato 80 foi adicionada a primeira emulsão e transferida no misturador de elevado cisalhamento (mini homogeneizador, TECNAL, modelo TE103) em 6000 rpm durante 10 min. Por fim, o solvente foi eliminado com auxílio do evaporador rotatório, formando a formulação denominada (NPEPV). Para fins de comparação, foram preparadas nanopartículas brancas (NPBl). Todas as formulações foram preparadas em triplicata e mantidas à 8o C, em geladeira ao abrigo da luz. 2.5 Caracterização físico-química das nanoestruturas As nanoestruturas foram caracterizadas macroscopicamente quanto a sua homogeneidade, cor e aparência. Microscopicamente, as formulações foram avaliadas quanto ao diâmetro médio de esfera equivalente (d4.3) e distribuição de tamanho de partícula (Span) por difração de laser empregando o equipamento Malvern Mastersizer ® 3000, confirmado com a determinação do diâmetro cumulante médio (Z-average) e do índice de polidispersão (PDI) por análise de espectroscopia de correlação de fótons (Nanosizer® Nanoseries, Malvern Intruments, Reino Unido) a 25° C. A determinação do pH foi realizada em pHmetro (Gehaka, PGH2000) previamente calibrado com padrões pH 4.0 e 7.0 diretamente nas suspensões coloidais. O potencial zeta (ξ) foi determinado através de mobilidade eletroforética da amostra (Zetasizer® Nano-ZS modelo ZEN 3600, Malvern Intruments, Reino Unido). Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados representados por média de três determinações. 2.6 Identificação de flavonóides presentes no extrato de Pyrostegia venusta A identificação dos flavonóides presentes no extrato etanólico das folhas de P. venusta foi desenvolvida segundo Duan, et al. [19] com modificações. Para a sua caracterização destes flavonóides foi realizado um comparativo do tempo de retenção da amostra em análise com os padrões externos autênticos preparados em metanol. Os padrões utilizados foram: Amentoflavona, Apigenina, Canferol, Luteolina, Miricetina, Quercetina, Quercetina-3-β-d-glicosídeo, Rutina e Taxifolina (Sigma-Aldrich). A análise procedeu-se em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) sendo realizada em equipamento

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UPLC Agilent 1290 Infinity (Agilent Technologies, USA). Coluna Agilent Eclipse AAA (4.6 x 150 mm, 3.5μm) a 25º C com um volume de injeção de 20 μL. Fase móvel gradiente com água acidificada com ácido fórmico 0.1 % (m/v) e acetonitrila em condições 05:95 a 95:05 (H2O: ACN). Tempo de corrida de 33 minutos com fluxo de 0.5 mL/min. A detecção foi obtida por espectrometria de massas realizada num Agilent 6460 Triple Quad com uma fonte de ionização por eletrospray, utilizando gás nitrogênio, nas seguintes condições: temperatura do gás de 300º C; fluxo 5 L/ min; pressão do nebulizador 45 psi; temperatura do gás da bainha 250º C; fluxo 11 L/min; tensão capilar -3500 V e intervalo de varredura de m/z 120-900 unidades.

2.7 Teste do Micronúcleo in vivo A obtenção e preparo das lâminas de eritrócitos de medula óssea para avaliação da frequência de micronúcleo (MN) seguiram a metodologia proposta por MacGregor et al. [20]. Foram analisadas 1000 células por animal em microscópio de luz, com aumento de 1000 vezes (imersão) em lâminas preparadas e decodificadas em teste cego em duplicata para cada animal. A porcentagem de redução na frequência de MN foi calculada de acordo com Manoharan e Banerjee [21] e Water et al. [22], através da equação abaixo:

Onde A corresponde ao grupo tratado com ENU (controle positivo), B corresponde ao grupo tratado com P. venusta mais ENU e C corresponde ao grupo tratado com NaCl 0.9 % (controle negativo).

2.8 Delineamento Experimental

17

0

15º

16º dia

Grupos 1

S

2

S

3

S

4

S

5

S

6

S

7

S

8

S

9

S

9

Lipossoma sem extrato Nanocápsula polimérica sem extrato

NaCl 0,9% ENU 50 mg/Kg p.c.

Lipossoma com P. venusta a 1 mg/mL Nanocápsula polimérica com P. venusta a 1 mg/mL

S = Sacrifício

Extrato puro a 1 mg/mL

N = 6 animais/grupo

Fig. 1: Protocolo experimental para avaliação do efeito antimutagênico e mutagênico do extrato etanólico de P. venusta nanoestruturados.

O delineamento experimental seguiu para todos os grupos com a administração de 0.3 mL (soluções de 1mg/mL e sem extrato (nanossistemas livres)) das soluções via gavagem durante 15 dias consecutivos. Após os animais receberam injeção intraperitoneal dos compostos ENU e NaCl 0.9% e no dia seguinte (16º dia), os animais foram sacrificados por decapitação. Durante o tratamento houve pesagem da ração consumida e dos animais, para fins de comparação. 2.9 Análise bioquímica Os níveis séricos das atividades hepáticas das enzimas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), bem como as análises de creatinina (CR) para avaliar a atividade renal foram mensurados por meio do aparelho Cobas Integra 400 Plus da Roche, através do método de quimioluminescência. 2.10

Análise Estatística

18

A frequência de células micronucleadas nos diferentes grupos experimentais foi comparada pelo teste do qui-quadrado [23]. Para as análises bioquímicas foi utilizado o teste de Tukey, onde p < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo, através do programa estatístico SISVAR - Sistema de Análise de Variância para Dados Balanceados. 3. Resultados As suspensões de nanossistemas (LPEPV e NPEPV) apresentaram aparência macroscópica homogênea, aspecto leitoso, opalescente e levemente esverdeado, característica esperada pela presença de extrato de P. venusta. As formulações (LPBl e NPBl) apresentaram coloração esbranquiçada. Todas as formulações apresentaram reflexo azulado, resultante do movimento browniano dos nanossistemas em suspensão. A Tabela 1 apresenta os valores referentes ao diâmetro médio, polidispersão, pH e potencial zeta obtidos para as análises da média e seu respectivo desvio padrão das nanocápsulas poliméricas e lipossomas convencionais desenvolvidos. Nota-se que as amostras apresentaram baixa polidispersão e seu diâmetro com tamanho manométrico. O pH de LPBl e LPEPV demonstraram caráter neutro e para NPBl e NPEPV mais ácidas. O potencial zeta demonstrou a presença do potencial de carga das superfícies dos nanossistemas por mobilidade eletroforética, pelo impedimento estéricos das nanoestruturas, onde nota-se ξ próximos de zero em módulo.

Tabela 1. Caracterização das nanoestruturas ao longo dos 30 dias de estudo. pH

Potencial Zeta(ζ) (mV)

0.9700.00

7.28  0.03

-16.9 0.37

0.3600.00

0.7100.107

7.25  0.05

-16.5 0.26

NPBl

0.3500.01

0.9700.106

5.68  0.17

-5.960.25

NPEPV

0.3400.00

0.9000.00

4.95  0.14

-11.9 0.21

Formulação

d4.3 (µm)

Span

LPBl

0.2900.00

LPEPV

LPBl - Lipossoma branco; LPEPV – Lipossoma contendo extrato; NCBr – Nacocápsula Polimérica branca; NCEPV – Nanocápsula Polimérica contendo extrato.

No extrato etanólico de P. venusta, foram identificados, por LC-MS/MS, cinco flavonóides, sendo eles a apigenina, luteolina, miricetina quercetina 3-β-d-glicosídeo e a rutina. Conforme demonstrado na Tabela 2 a seguir.

19

Tabela 2. Parâmetros de LC-MS/MS dos cinco flavonóides identificados no extrato bruto etanólico de P. venusta. Composto

[M – H]-

T.R. (min)

Transição MRM

Fórmula Molecular

1

Apigenina

269.4

16.6

269.24 116.80

C15H10O5

2

Luteolina

285.24

14.9

285.24133.00

C15H10O6

3

Miricetina

217.24

9.5

217.24137.00

C15H10O8

4

Quercetina-3-β-d-glicosídeo

463.38

10.8

463.38300.00

C6H11O5

5

Rutina

609.27

10.4

609.27300.20

C27H30O16

[M – H]- - Íon molecular; T.R. (min) – tempo de retenção; Transição MRM – Monitoramento de reações múltiplas.

A Tabela 3 apresenta a frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (PCEMNs) após o pré-tratamento com o extrato etanólico de P. venusta nanoestruturados e livre. Os resultados mostram uma redução na frequência de PCEMNs de 183 % do grupo LPEPV + ENU (p< 0.001) e de 114 % do grupo NPEPV + ENU (p< 0.001) quando comparados aos seus respectivos controles positivos LPBl + ENU e NPBl + ENU, demonstrando significativa atividade antimutagênica do extrato nanoestruturado, além de não apresentar aumento significativo de PCEMNs quando comparados com os controles negativos (LPBl + NaCl 0.9% e NPBl + NaCl 0.9%). Tabela 3. Frequência de PCEMNs de medula óssea de camundongos após prétratamento com o extrato etanólico de Pyrostegia venusta. Tratamento LPBl + NaCl 0.9% a NPBl + NaCl 0.9%

a

Número de PCEs analisados

PCEMNs No. %

6000

234

2.34

6000

% de redução

229

2.29

b

5000

c

371

3.71

NPBl + ENU (50 mg/Kg) b

6000

411

4.11

LPEPV + ENU (50 mg/Kg)

6000

120*

1.20

183

NPEPV + ENU (50 mg/Kg)

6000

204*

2.04

114

LPEPV + NaCl 0.9%

6000

161

1.61

NPEPV + NaCl 0.9%

6000

241

2.41

LPBl + ENU (50 mg/Kg)

EPV + ENU 6000 266 2.66 a Controle negativo; b Controle positivo; c morreu 1 animal; * p< 0.001 para o Teste do qui-quadrado.

A Tabela 4 apresenta o consumo de ração (g/semana/grupo) e peso corpóreo (g) durante o período de tratamento dos animais. Os resultados sugerem que os tratamentos

20

não apresentaram toxicidade para os animais, pois não houve interferência na alimentação e ganho de peso.

Tabela 4. Consumo médio de ração (g/semana/grupo) e peso corpóreo (g) de camundongos tratados durante 15 dias com o extrato etanólico de Pyrostegia venusta. Tratamento

Número de animais

Consumo médio de ração (g/semana/grupo)

Peso corpóreo (g)

LPBl + NaCl 0.9% a

6

33.74 d

35.80 d

NPBl + NaCl 0.9% a

6

37.93 d

36.35 d

LPBl + ENU (50 mg/Kg) b

5c

35.29 d

33.79 d

NPBl + ENU (50 mg/Kg) b

6

35.83 d

32.36 d

LPEPV + ENU (50 mg/Kg)

6

32.08 d

33.41 d

NPEPV + ENU (50 mg/Kg)

6

35.65 d

34.10 d

LPEPV + NaCl 0.9%

6

38.40 d

34.68 d

NPEPV + NaCl 0.9%

6

33.93 d

35.21d

EPV + ENU (50 mg/Kg) C.V. (%)

6

35.49 d

32.99 d

-

9.72

8.30

Fc

0.23 0.14 NS d Controle negativo; Controle positivo; morreu 1 animal; Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey (α= 5%); NS Não significativo; C.V. = coeficiente de variância; Fc = fator de correção. a

NS

b

c

A Tabela 5 apresenta dosagens de transaminases (AST e ALT) e creatinina referentes à possível toxicidade na administração do extrato etanólico de P. venusta durante o período experimental. Os resultados mostram que não houve diferença significativa entre os grupos tratados, demonstrando que não houve danos hepáticos e renais em relação à administração da P. venusta.

Tabela 5. Análise bioquímica da atividade hepática (AST e ALT) e renal (CRE) dos grupos controles e grupos tratados com o extrato etanólicos de folhas de Pyrostegia venusta durante 15 dias. Grupos AST ALT CRE LPBl + NaCl 0.9% 67.78 a 288.80 a 0.21 a a a NPBl + NaCl 0.9% 77.06 316.08 0.28 a LPBl + ENU (50 mg/Kg) 60.80 a 275.07 a 0.19 a NPBl + ENU (50 mg/Kg) 62.00 a 327.58 a 0.29 a a a LPEPV + ENU (50 mg/Kg) 50.67 249.82 0.20 a a a NPEPV + ENU (50 mg/Kg) 53.83 199.30 0.20 a a a LPEPV + NaCl 0.9% 66.92 259.52 0.21 a a a NPEPV + NaCl 0.9% 66.65 279.65 0.20 a a a EPV + ENU (50 mg/Kg) 65.87 223.73 0.31 a C.V. (%) 21.15 25.35 52.30 Fc 1.42NS 1.17NS 0.69NS a NS Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si, pelo teste de tukey (α= 5%); Não significativo; C.V. = coeficiente de variância; Fc = fator de correção.

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4. Discussão As formulações desenvolvidas apresentaram aspecto macroscópico homogêneo e de cor esbranquiçada quando formulado sem a presença do extrato etanólico da P. venusta (LPBl e NPBl), resultado coerente com Külkamp et al. [24]. Já as demais formulações adquiriram aspecto esverdeado leitoso após incorporação (LPEPV e NPEPV) e a mesma apresentou cheiro de folha verde fresca, característico de clorofila, sendo que essas características estão de acordo com os resultados de Lapenda et al. [25] para ambas formulações que usou os mesmos nanossistemas. O diâmetro médio das nanoestruturas mostraram em torno de 0.290 nm para os LPBl, de 0.360 nm nos LPEPV, 0.350 nm nos NPBl e 0.340 nm nos NPEPV, sendos estes diâmetros médios condizente com o esperado, diâmetros menores que 1 nm [26]. Sabese que diâmetro de partícula em torno de 200 nm potencializa a ação do ativo, pois são capazes de escapar de armadilhas como do parênquima hepático e se manterem por mais tempo em circulação [27]. O span indica a polidispersão das partículas e está relacionado com seu tamanho, sendo que quanto menor seu tamanho, menor a capacidade de aglomeração. [28]. O pH dos lipossomas assumiram um caráter mais neutro por conter um grupo catiônico decorrente da fosfatidilcolina presente na formulação [29]. Já o pH das suspensões nanoparticuladas encontraram-se de acordo com os valores obtidos por Ribeiro et al. [30] sendo estas descritas pelos autores em torno de pH 5.44. Essa característica das NPs deve-se a presença do polímero biodegradável (PCL) que apresenta grupos de ácido carboxílico terminal e reduzindo assim o pH [30]. O ζ produz uma repulsão eletrostática entre seus coloides vizinhos, sendo de extrema importância já que evitam a aglomeração [29]. Pode-se então afirmar que, as nanoestruturas se enquadram entre os estudos propostos por pesquisadores, conferindo assim sua eficiência e estabilidade de ação farmacológica [26,28,30]. Os compostos bioativos, presentes nos extratos vegetais, apresentam dificuldade de absorção intestinal devido à baixa solubilidade em lipídios, sendo assim o uso de nanossistemas melhoram essa absorção via oral (v.o.) e estabilidade [31] quando comparadas com o uso do extrato livre. Segundo Dong e Mumper [32], estes tipos de carreadores intensificam e otimizam a capacidade de compostos como os flavonóides a adentrar e acumular dentro dos tecidos tumorais, melhorando o efeito de permeabilidade e manutenção sérica

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otimizada. Os flavonóides possuem a capacidade de interagir com nosso organismo e causar alterações funcionais pela sua capacidade antioxidante [1]. Sabe-se que compostos fitoquímicos possuem uma baixa solubilidade o que dificulta sua absorção no sistema digestivo quando administrado via oral e também grande suscetibilidade a alterações metabólicas [33]. Segundo Rai [12] e Ourique et al. [13], o uso de extrato nanoestruturado torna possível o melhoramento das ações na prevenção de danos genéticos, pois doses terapêuticas de compostos extraídos a partir de plantas se intensificam através de mudanças em sua estrutura para melhor afinidade ao alvo desejado do organismo. Codevilla et al. [5], demonstraram as vantagens de fazer uso de componentes bioativos extraídos de plantas com nanoestruturas, pois atuam na prevenção ou na promoção da saúde da população, gerando uma maior qualidade e segurança em seu uso. Os resultados apresentados mostram que o uso de nanossistemas sugere uma melhora significativa na biodisponibilidade dos componentes presentes no extrato das folhas da P. venusta e também demonstram uma melhor ação biológica. Observou-se uma significativa redução na frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos em animais tratados com extrato de P. venusta nanoestruturados em ambos nanossistemas utilizados. A maior potencialização do efeito antimutagênico da P. venusta ocorreu quando carreado em lipossomas, pois se acredita que os nanocarreadores melhoram a absorção no sistema digestivo, assim como melhor estabilidade na corrente sanguínea e metabolismo deste extrato [32]. Por outro lado, há ausência de estudos com a P. venusta em relação ao efeito protetor contra agentes genotóxicos com o uso de nanocápsulas poliméricas, o que faz do presente estudo um trabalho inédito na identificação do efeito protetor de P. venusta nanoestruturado na prevenção do câncer, sugerindo uma eficaz ação antioxidante dos flavonóides presentes na espécie. Ambos os nanossistemas, lipossoma quanto nanopartícula polimérica, protegem os compostos fitoquímicos de obstáculos como degradação física e química, processos de biotransformação, resistindo assim à degradação inesperada e abrupta [34]. A vantagem no uso dos lipossomas ocorre principalmente pela sua característica de bicamada fosfolipídica que melhora as possíveis limitações da baixa biodisponibilidade dos flavonóides, por exemplo. Tornando sua capacidade de evasão da degradação uma perspectiva para sua utilização na terapia anticâncer [35]. Além disso, sua eficaz

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proteção também está relacionada à capacidade dos lipossomas serem capturados pelos macrófagos que aumentam sua concentração no fígado, baço e medula óssea [36]. De acordo com Ferreira [37], a atividade quimioprotetora ao DNA pode estar associada aos flavonóides, que agem como potentes agentes antimutagênicos, devido sua ação antioxidante. Neste contexto, foram identificados no extrato etanólico de folhas de P. venusta os flavonóides: apigenina, luteolina, miricetina, quercetina-3-β-dglicosídeo e rutina. A quercetina também foi identificada por Roy et al [9] em flores e raízes da P. venusta e por Veggi, Cavalcanti e Meireles [38] nas folhas. Pereira et al [39] encontraram nas flores de P. venuta a presença da rutina. A luteolina e apigenina foram encontrados em outra espécie da família Bignoneaceae, entretanto esse é o primeiro relato de sua presença na P. venusta [40]. A rutina parece ser muito encontrada em espécies cultivadas no cerrado segundo Blatt, Santos e Salatino [41], que identificaram a presença deste flavonóide em folhas da P. venusta. A identificação da miricetina na família Bignoneaceae também se mostrou inédita [39]. A atividade antioxidante de folhas de P. venusta já foi observada em testes in vitro por Altoé et al. [10]. Pereira et al. [11], verificaram atividade antioxidante de compostos fenólicos de extratos livre de flores de P. venusta. Khan, Afaq e Mukhtar [42] relatam que para a prevenção do câncer, agentes com capacidade de intervir em mais de um ponto crítico no processo da carcinogênese podem atuar no impedimento da fixação de um dano ao DNA, apresentando vantagem sobre agentes de único-alvo. Sabe-se que a quercetina tem ação na regulação do ciclo celular e apresenta capacidade de induzir a apoptose das células tumorais, além de inibir a atividade da tirosina quinase [43,44]. Apigenina e quercetina em associação possuem ação preventiva do câncer através do mecanismo de inibição do proteossoma de forma seletiva ao câncer e não sobre células normais, contribuindo para efeitos preventivos da doença [45]. A luteolina apresenta ação somatória aos demais flavonóides ao induzir a apoptose das células tumorais, por gerar uma parada no ciclo celular na fase G0/G1 que pode ser o mecanismo pelo qual a luteolina reduz a viabilidade celular de células danificadas [46]. A apigenina possui por sua vez uma capacidade de dissipação de energia absorvida, o que aumenta os níveis de sua ação como defesa antioxidante [47]. Assim, sugere-se que o efeito antimutagênico observado pelo extrato etanólico de folhas de P. venusta pode ser resultado da ação sinérgica entre os constituintes da planta, cujo mecanismo de ação ainda não foi elucidado.

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Em relação à avaliação genotóxica, os nanossistemas (LPEPV, NPEPV, LPBl, NPBl) e EPV não apresentaram efeito mutagênico. Magalhães et al. [7], em estudo com extrato de flores de P. venusta livre avaliaram os efeitos clastogênicos de diferentes concentrações (50, 100 e 200 mg/Kg p.c) em camundongos Swiss pelo teste do micronúcleo e não verificaram um aumento significativo no número médio de células com micronúcleos ou aberrações cromossômicas. A administração do extrato de P. venusta livre ou nanoestruturado também não apresentou sinais físicos de toxicidade nos animais durante o período experimental, tais como, perda de peso, falta de ingestão de água ou perda de apetite. Os dados mostram que houve uma evolução considerada normal de ganho de peso durante o tratamento [48]. Além disso, não foram observados efeitos hepatotóxicos e nefrotóxicos através das dosagens de AST, ALT, e CR respectivamente. O uso dos nanocarreadores de característica inerte contendo extrato de P. venusta não demonstrou possíveis danos hepáticos, confirmando a capacidade das nanoestruturas de proteção frente a interações não desejadas [35,48,49]. Assim, de acordo com Roy et al. [9] e Mostafa et al. [8], a P. venusta apresenta compostos com grande potencial de uso na medicina popular e na descoberta de novos produtos com potenciais farmacológicos. 5. Conclusão Conclui-se que as nanoestruturas desenvolvidas apresentaram tamanho nanométricos com característica monomodal e estabilidade físico-química. Identificouse a presença de cinco flavonóides com potencial antioxidante no extrato etanólico de folhas de P. venusta, mostrando que esse extrato possui potencial protetor aos danos induzidos ao DNA in vivo. Houve potencialização da ação antimutagênica do extrato de P. venusta carreado em lipossomas e nanopartículas poliméricas, ou seja, houve melhora na sua ação em comparação com sua forma livre, sem apresentar efeitos maléficos ao organismo. Além disso, o extrato etanólico de folhas de P. venusta nanoestruturado, nanoestruturas brancas e o extrato livre não apresentaram efeito mutagênico, hepatotóxico e nefrotóxico, nas condições experimentais realizadas, possuindo assim um grande potencial farmacológico na quimioprevenção do câncer.

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ANEXOS