Tecnicas en Histologia y Biologia Celular MONTUENGA 2e[Librosmedicospdf.net]

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2.a edición

www.medilibros.com L uis M ontuenga Badía ELSEV IER MASSON

Francisco J. E steban Ruiz A lfo nso C alvo González

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Técnicas en histología y biología celular

Página deliberadamente en blanco

Técnicas en histología y biología celular 2 .a edición Luis Montuenga Badía D epartamento de Histología y Anatomía Patológica; Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

Francisco J. Esteban Ruiz D epartamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén

Alfonso Calvo González D epartamento de Histología y Anatomía Patológica; Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona Coordinadora de recursos online

María José Sánchez de Miguel Servicio de Innovación Educativa; Universidad de Navarra, Pamplona Coordinadora de iconografía

Jackeline Agorreta Arrazubi Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

A m sterd am B arcelona Beijing Boston Filadelfia L ondres M a d rid M éx ico M ilá n M u n ich O rla n d o París R o m a Sidney T okio T o ro n to

A O IIfe ELSEVIER M ASSON

ELSEVIER MASSON

Prim era edición 2009 Segunda edición 2014 © 2014 Elsevier España, S.L. Es una publicación M A SSON Travessera de Grácia, 17-21.08021 Barcelona, España F o to co p iar es u n delito (A rt. 270, C . P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores, etc.). E l principal beneficiario de ese esfuerzo es el lector que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las circunstancias previstas p o r la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de nuevas ediciones. Además, a corto plazo, encarece el precio de las y a existentes. Este libro está legalmente protegido p o r los derechos de propiedad intelectual. C ualquier uso fuera de los límites establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproducción, fotocopia, traducción, grabación o cualquier otro sistema de recuperación de alm acenaje de información. ISB N (versión impresa): 978-84-458-2520-4 ISB N (versión electrónica): 978-84-458-2597-6 Depósito legal (versión impresa): B 11803-2014 Depósito legal (versión electrónica): B 11804-2014 Servicios editoriales: Gea C o n s u l to r ía E d it o r i a l , s .l.

A dvertencia La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad estándar, a m edida que aum enten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá que introducir cambios en los tratamientos y en los fármacos. E n consecuencia, se recomienda a los lectores que analicen los últimos datos aportados p o r los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar las dosis recomendadas, la vía y la duración de la administración, y las contraindicaciones. E s responsabilidad ineludible del médico determinar las dosis y el tratamiento m ás indicados para cada paciente, en función de su experiencia y del conocimiento de cada caso concreto. N i los editores ni los directores asumen responsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o propiedades com o consecuencia del contenido de esta obra. E l E d ito r

Jackeline Agorreta Arrazubi* Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

Laura Guembe Echarri Servicio de Morfología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

Jordi Alcaraz Casademunt Unitat de Biofísica i Bioenginyeria Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona

María Gutiérrez Pérez Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

Marta Aparicio Miguel Angiogenesis Core Facility, NCI, NIH, Bethesda, MD, EE. UU. María Elena Bodegas Frías Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra, Pamplona María Angela Burrell Bustos Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra, Pamplona María Calvo Adamuz Microscopía Óptica Avanzada; Centros Científicos y Tecnológicos; Universidad de Barcelona Alfonso Calvo González* Departamento de Histología y Anatomía Patológica; Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona Carlos de Andrea Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra, Pamplona Francisco José Esteban Ruiz Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén Carmen García Corchón Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra, Pamplona

Diana Llópiz Khatchikian Área de Terapia Génica y Hepatología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona María del Mar Malagón Poyato Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología; Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC)/Hospital Universitario Reina Sofía/Universidad de Córdoba; CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), Instituto de Salud Carlos III Alfredo Martínez Ramírez Unidad de Oncología, Centro de Investigación Biomédica de La Rioja (CIBIR) María C. Montoya Sánchez Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid Luis Montuenga Badía* Departamento de Histología y Anatomía Patológica; Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona Paul Alain Nguewa Tchinda Área de Oncología, CIMA; Departamento de Microbiología, Universidad de Navarra, Pamplona Alberto Orta Ruiz Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

*Forma parte de la Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (RTICC) del Instituto de Salud Carlos El.

Autores

María José Pajares Villandiego* Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona Juan Angel Pedrosa Raya Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén Beatriz Pelacho Samper Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona Alvaro Piera Fernández Leica Microsistemas Felipe Prosper Cardoso* Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona Luis Santamaría Solís Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid Pilar Sesma Egozcue Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra, Pamplona

Rafael Vázquez Martínez Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología; Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC)/Hospital Universitario Reina Sofía/Universidad de Córdoba; CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), Instituto de Salud Carlos III Ana Cristina Villaro Gumpert Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra, Pamplona Enrique Zudaire Ubani Tumor Angiogenesis Section; Mouse Cancer Genetics Program; National Cancer Institute, Frederick MD, EE. UU. Isabel Zudaire Ripa* Área de Oncología, CIMA; Universidad de Navarra, Pamplona

*Forma parte de la Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (RTICC) del Instituto de Salud Carlos HI.

La admiración por lo científico es uno de los rasgos culturales propios de la sociedad de principios del siglo xxi. En nuestra cultura, la afirmación de que un hecho está «científi­ camente demostrado» parece garantía de ve­ racidad. El adjetivo «científico» añade mucho peso a cualquier aseveración. Sin embargo, pocas veces nos preguntamos si en realidad tenemos una idea clara de qué queremos decir con ese adjetivo: ¿sabemos distinguir la cien­ cia de lo que no lo es? ¿Caemos realmente en la cuenta de qué es lo que diferencia a la cien­ cia de otros modos de conocer? La ciencia consiste en un tipo de conocimiento distinto al que normalmente se emplea para compren­ der la realidad en la vida ordinaria: cuando alguien nos relata una anécdota del trabajo, o describe una jugada de un partido de fútbol, no está haciendo afirmaciones científicas. El conocimiento científico es también diverso del conocimiento propio de los filósofos y los poetas. Estos humanistas comprenden y describen la realidad utilizando enfoques y perspectivas propias, que no tienen por qué ser menos verdaderas que la perspectiva científica, pero que se diferencian de ella en un aspecto fundamental. Nos preguntamos, por tanto, qué es lo que hace científico a lo científico. La respuesta a este interrogante es relativamente sencilla: la ciencia busca la verdad utilizando un método propio y es­ pecífico. El método científico nos permite un acceso muy peculiar a la realidad. Un acceso que está mediado por la reducción de lo real a unos parámetros que, generalmente, son susceptibles de cuantificación. El método de cualquier ciencia filtra el objeto de su estudio y establece una trama peculiar que facilita la comprensión de ese objeto; de este modo, la ciencia reduce la enorme complejidad de lo real a aspectos muy concretos, muy parciales y muy mensurables. Esta simplifi­

cación propia del método científico nos per­ mite ser muy eficaces a la hora de responder preguntas sobre la naturaleza; nos permite describir en detalle esa realidad compleja y compararla con otras realidades. Relevancia de la metodología en la ciencia Es lógico, por tanto, que el rigor en la me­ todología sea uno de los aspectos centrales a la hora de determinar la credibilidad de un trabajo científico. Un trabajo mal diseñado, pobremente analizado, o con errores en la cuantificación, no es un trabajo científico riguroso. Por contra, un trabajo cuidadoso desde el punto de vista metodológico, facili­ tará y propiciará una de las grandes ventajas del conocimiento científico: la posibilidad de interpretación de un mismo hecho por varios sujetos distintos. Los datos experi­ mentales generados en un trabajo científico llevado a cabo con rigor, y con una buena descripción de sus métodos, deberían poder ser reproducidos por cualquier especialista de la materia, con independencia del lugar y del tiempo. Y eso solo es posible si el autor del artículo original y quien intenta validarlo llevan a cabo exactamente el mismo método. Aunque, en último término, siempre queda un margen para la interpretación subjetiva de los resultados, mediante la rigurosa des­ cripción de los métodos, la ciencia posee un poderoso mecanismo de confirmación o autocorrección de sus afirmaciones. Estos mecanismos están basados, en definitiva, en los recursos metodológicos que ayudan a reducir el peso relativo de la subjetividad en el estudio de la realidad. Siguiendo los pasos sucesivos del método científico, la ciencia genera predicciones (hipótesis), que procura apoyar mediante comprobaciones experimen­ tales originales y sucesivas validaciones, que la van acercando a la verdad. La importancia vii

Introducción

de la metodología para el acceso a la verdad por parte de la ciencia justifica el hincapié que se hace en los aspectos metodológicos. Y esa relevancia se hace evidente, por ejem­ plo, cuando se evalúa la calidad de cualquier investigación científica. Precisamente por esto, en toda publicación científica se incluye siempre una sección de material y métodos en la que se describen las técnicas emplea­ das, de modo que sea sencillo conocer cómo se han generado los datos que se presentan en dicho trabajo. La lectura atenta de esa sección permite hacerse cargo de la calidad, las fortalezas y las limitaciones de cualquier trabajo científico. Entre los grandes retos que tiene el mundo de la investigación biológica y biomédica se encuentra promover la comprensión, la acce­ sibilidad y la reproducción eficiente de las técnicas experimentales entre unos laborato­ rios y otros. Hay que mejorar notablemente la colaboración entre grupos de investigación y el acceso compartido a la tecnología más sofisticada. El trabajo colaborativo, las redes nacionales e internacionales de investigado­ res y las plataformas tecnológicas comparti­ das facilitan de gran manera la transparencia y la reproducibilidad de los experimentos biológicos, y alivian el esfuerzo que exige aprender cada nueva técnica experimental. Son muchas las revistas científicas que in­ cluyen una sección dedicada a la publicación de metodologías, notas técnicas, protocolos, etc. relacionados con el tema de la revista. Es más, desde hace tiempo existen también revistas específicamente enfocadas a los avances técnicos de los distintos ámbitos del saber científico, en especial en inves­ tigación biológica y biomédica. Ejemplos de revistas técnicas multidisciplinares de buen impacto son Methods, Nature M et­ hods, Nature Protocols o Biotechniques; y de metodología en el área de la histología o la biología celular, Journal o f Microscopy, Microscopy and Analysis, Micron, Journal o f Electron Microscopy, Biotechnic and His­ tochemistry, Journal o f Histochemistry and Cytochemistry o The Histochemical Journal. Más recientemente, el mundo de los métodos en biología ha dado ocasión al nacimiento de una nueva forma de revista científica:

Journal o f Visualized Experiments (JoVE). Se trata de una revista online, en formato vídeo, dedicada exclusivamente a informar y describir los detalles, grandes y pequeños, de nuevos métodos y protocolos. Todos los artículos de JoVE son vídeos en que los au­ tores demuestran el modo de llevar a cabo una técnica específica, contando todos los detalles de manipulación, pequeños trucos prácticos, etc. Cualquier investigador en el ámbito de la biología sabe que poner a pun­ to, perfeccionar y aplicar una nueva técnica experimental puede llevar semanas e incluso meses. De hecho, muy buena parte del tiem­ po de un laboratorio transcurre aprendiendo y poniendo a punto nuevas metodologías. Y esto puede ser un proceso muy exigente, ya que cada año aparecen muchas tecnologías innovadoras relevantes. Objetivos y características de este libro El objetivo del presente libro de texto sobre técnicas en histología y biología celular es triple. En primer lugar, pretendemos resu­ mir y sintetizar los métodos principales de la biología celular y la histología. A la hora de obtener información sobre estos métodos es muy común tener que recurrir a diversas fuentes dispersas. Son muy escasos, es­ pecialmente en lengua castellana, los ma­ nuales que recogen el conjunto de todas estas metodologías en un mismo volumen. En segundo lugar, nuestro trabajo persigue presentar los aspectos básicos de estas metodologías a los estudiantes del ámbito de las ciencias biológicas y biosanitarias que deseen profundizar en estas técnicas, más allá de lo que se suele cubrir en los textos de biología celular o histología. En tercer lugar, hemos escrito nuestro manual también con la intención de acercar estas técnicas a las personas que se introducen por primera vez en el mundo de la inves­ tigación biosanitaria (técnicos de labo­ ratorio, clínicos, personal auxiliar, etc.). Estos profesionales con mucha frecuencia demandan un texto en el que informarse sobre los diversos métodos que se utilizan en nuestras disciplinas. Tanto en el título como en esta introduc­ ción mencionamos expresamente las dos

Introducción

áreas de conocimiento: biología celular e histología. En nuestra opinión, las dos dis­ ciplinas tienen un grado de solapamiento tan importante, y una historia tan común, que esta distinción debería ser innecesaria. Sin embargo, tanto desde el punto de vista de la organización académica, como quizás en algunos aspectos de objeto y metodología, todavía se hace conveniente mencionar, al menos en el título, las dos áreas separa­ damente. Aunque en nuestro texto se incluyen la mayor parte de las técnicas básicas en bio­ logía celular, el lector puede echar en falta capítulos que aborden tecnologías propias de la biología molecular, de la fisiología o de la genética, que convergen en nuestras dis­ ciplinas. Somos conscientes de que la «zona gris» de frontera entre nuestra área y las que acabamos de mencionar cada vez es más difusa. En los trabajos de biología celular, la presencia de técnicas moleculares o genéticas es más que habitual. Y la interacción entre la histología y la fisiología es constante. El he­ cho de que existan ya disciplinas como la histofisiología, la patología molecular, etc. no hace más que confirmar la caída de estas ba­ rreras levantadas de forma bastante artificial en las instituciones académicas. Por razones de índole práctica, y para no hacer de este texto un extenso manual inmanejable, hemos establecido una cierta frontera — sin duda discutible y artificial— a la hora de incluir o no determinados temas en nuestra lista de capítulos. En particular, hemos dejado fuera de nuestro manual las técnicas de biología molecular, manejo de ácidos nucleicos y proteínas, etc., que ya se tratan de modo extensivo en los abundantes libros de texto del ámbito de la bioquímica. Hemos planteado el contenido de cada capítulo teniendo en cuenta los objetivos que acabamos de mencionar. Para evitar una obra enciclopédica, hemos procurado incluir en cada tema todo lo relevante y solo lo re­ levante. Es posible que el lector interesado en profundizar en un tema concreto eche en falta información más detallada sobre alguna de las materias. Los autores estamos conven­ cidos de que hemos incluido las cuestiones más significativas dentro de cada tema, las

técnicas más frecuentemente utilizadas y los conceptos más necesarios desde el punto de vista formativo. Para una descripción más exhaustiva de cada método, se remite al lector a las fuentes bibliográficas que se recogen al final de cada capítulo o en la sección corres­ pondiente del material online. En la obra que ahora presentamos, hemos procurado destilar la experiencia docente que existe sobre nues­ tra materia en diversos centros académicos universitarios. Los autores de los distintos capítulos son profesores universitarios o in­ vestigadores familiarizados con la docencia de cada uno de los aspectos que recoge este libro. Muchos de los temas forman parte de asignaturas metodológicas de varias universi­ dades españolas. Como acabamos de mencio­ nar, pretendemos que estos capítulos puedan ser útiles a nuestros alumnos de esas materias o de otras afines. Invitamos a todos los lec­ tores, y en especial a los profesores de nues­ tras áreas de conocimiento, a hacemos llegar cuantas sugerencias consideren oportunas para mejorar el contenido y las posibilida­ des didácticas del presente texto. Sin duda, agradeceremos mucho esa colaboración de colegas y lectores. Conviene, en fin, aclarar que este libro tampoco pretende ser un übro de protocolos. Cada laboratorio tiene los suyos. Por otro lado, la inclusión de protocolos y recetarios haría excesivamente prolija esta obra. Cree­ mos que, a la hora de diseñar el componente práctico de cada uno de los capítulos, es más conveniente que cada docente prepare los protocolos que se ajusten específica­ mente a su programa, al material disponible y a las posibilidades de su laboratorio. Los protocolos, las listas de reactivos, etc. son más propios de un cuaderno de prácticas que de un libro de texto. En todo caso, en la bibliografía de cada capítulo se hace referencia a textos y manuales que recogen abundantes protocolos que pueden utilizar­ se, junto con la información ampliamente disponible en Internet, para preparar cada una de las prácticas. Los autores estamos también a disposición del lector para in­ formar sobre los protocolos que usamos en nuestras prácticas y en el contexto de nuestra investigación.

Introducción

Por último, queremos reconocer expre­ samente a los auténticos inspiradores de este manual. Dedicamos esta obra a nuestros maes­ tros, a los técnicos de nuestros laboratorios y a nuestros alumnos. A los primeros porque, de un modo generoso y desinteresado, han sabido poner el «hombro de gigante» sobre el que nos hemos apoyado los que hemos venido detrás. A los técnicos, porque, pese a pasar tantas veces desapercibidos, su contribución es imprescindible para el éxito de cualquier trabajo científico. Y a los alumnos, porque son el motivo y la inspiración de nuestro trabajo docente. Tenemos la esperanza de que muy

pronto ellos tomen nuestro relevo para hacer ciencia con más empeño y calidad que noso­ tros. Deseamos que estas páginas contribuyan, en mayor o menor medida, a estimular a los más jóvenes a formar parte de nuevas genera­ ciones de científicos y técnicos cada vez más motivados con su tarea. Calidad y motivación en el trabajo son los ingredientes imprescindi­ bles para que estos científicos del futuro con­ tribuyan a construir una ciencia cada vez más enamorada de la verdad, y más comprometida en el servicio a todos los hombres. Los autores

Prefacio a la segunda edición

Cinco años después de la salida a la luz de nuestro libro de texto se presenta esta segunda edición. El hecho mismo de que exista esta nueva edición es una (buena) señal de que la primera versión ha sido útil para el público al que iba dirigida. En esta nueva entrega, hemos intentado corregir deficiencias, subsanar erro­ res y, sobre todo, introducir algunas mejoras y actualizaciones. Algunos cambios son fruto de la experiencia en la utilización del libro como manual de referencia en nuestras asignaturas. También hemos procurado seguir muchas de las sugerencias recibidas de colegas y alum­ nos, que agradecemos muy sinceramente. Asimismo, hemos adaptado el formato del libro a la nueva estructura de la colección de manuales de la editorial Elsevier, que acen­ túa más algunos aspectos didácticos online. Es de destacar el esfuerzo de todos nuestros coautores para preparar el material necesario para la plataforma online, que, a partir de esta edición, está asociada al texto. En lo que se re­ fiere al contenido, también hemos introducido actualizaciones, cambios y mejoras. El lector se encontrará en esta edición con un elemento nuevo: cada capítulo incluye ahora varios cuadros con mensajes o resúmenes de as­ pectos más relevantes del texto, para facilitar el estudio y la memorización. También hemos mejorado algunos esquemas e ilustraciones para hacerlos más didácticos, y clarificado expresiones y conceptos. El capítulo 2, sobre microscopía óptica, se ha ampliado en algu­ nos de sus apartados. También se ha añadido un breve capítulo de microscopía de fuerza atómica, que apenas se mencionaba en la pri­ mera edición y que ahora es una herramienta muy relevante para aplicaciones biológicas. El antiguo capítulo dedicado al procesamien­ to y a las tinciones se ha dividido en dos. En el tema de la microscopía confocal, hemos in­ troducido algunos párrafos sobre técnicas de

microscopía de superresolución, que ya son métodos bien establecidos. Asimismo, hemos actualizado las tablas de fluorocromos y mar­ cadores de orgánulos, que son herramientas de utilización cada vez más frecuente. En el capítulo sobre microscopía electrónica se han incluido nuevas ilustraciones y algunos pá­ rrafos sobre microscopía de barrido y trans­ misión (STEM) y de haz de iones focalizados. Hemos modificado notablemente el capítulo sobre técnicas de cultivos celulares añadien­ do algunos aspectos no contemplados en la primera edición, como los cultivos tisulares. También se ha modificado el capítulo sobre técnicas de patología tumoral actualizando el texto y añadiendo referencias a los marcado­ res de autofagia, así como unos párrafos es­ pecíficos acerca de la citometría. Finalmente, el capítulo relativo a las células madre y a las técnicas de ingeniería de tejidos ha sido completamente puesto al día, ya que, en estos últimos 5 años, se han producido notables avances en el campo, entre los que cabe des­ tacar el premio Nobel de Medicina otorgado al profesor Yamanaka, que derivó por primera vez células madre pluripotenciales inducidas. En definitiva, hemos puesto al día el texto, mejorado sus anteriores deficiencias y añadido nuevos aspectos para hacerlo más didáctico y útil. Esperamos haber acertado con estas modificaciones. Y seguimos con­ fiando en la benevolencia de los lectores y en sus sugerencias y comentarios, que han sido tan relevantes para preparar esta segunda edición. Agradecemos a todos los que han ayudado a prepararla, en especial a Roser Be­ cerra y Silvia Serra, de la editorial Elsevier, sin quienes este proyecto editorial hubiese sido totalmente imposible. Los autores Pamplona, febrero de 2014

Página deliberadamente en blanco

1 Introducción histórica a la biología celular y la histología 1

6 Técnicas inmunohistoquímicas

103

Laura Guembe Echarri

Luis Montuenga Badía, Pilar Sesma Egozcue, Alfonso Calvo González

Actividades* Autoevaluación*

Autoevaluación*

2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

21

Francisco José Esteban Ruiz, Juan Ángel Pedrosa Raya

Actividades* Autoevaluación*

3

Procesamiento de muestras para microscopía óptica: fijación, inclusión y microtomía 35 Luis Montuenga Badía, María Elena Bodegas Frías, Carlos de Andrea, Francisco José Esteban Ruiz

Actividades* Autoevaluación*

4 Técnicas de tinción en histología 61 Luis Montuenga Badía, María Elena Bodegas Frías, Carlos de Andrea, Francisco José Esteban Ruiz

Autoevaluación*

5 Técnicas citoquímicas e histoquímicas 85 Francisco José Esteban Ruiz, Alfonso Calvo González, Luis Montuenga Badía

Caso* Autoevaluación*

7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ 127 Luis Montuenga Badía, Carmen García Corchón, Isabel Zudaire Ripa, Alberto Orta Ruiz, Jackeline Agorreta Arrazubi

Actividades* Autoevaluación*

8 Microscopía confocal

155

María C. Montoya Sánchez, Alvaro Piera Fernández, María Calvo Adamuz

Actividades* Autoevaluación*

9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología 183 Ana Cristina Villaro Gumpert, Luis Montuenga Badía

Actividades* Autoevaluación*

10 Microscopio de fuerza atómica: fundamentos y aplicaciones en biología y biomedicina 215 Jordi Alcaraz Casademunt

Autoevaluación*

*Disponible online.

xiii

índice de capítulos

11 Análisis de imagen en histología 225

14 Proliferación, muerte celular y angiogénesis 277

Enrique Zudaire Ubani, Marta Aparicio Miguel, Francisco José Esteban Ruiz, Luis Montuenga Badía

Actividades* Autoevaluación*

Autoevaluación* Anexo Citometría de flujo*

12 Métodos estereológicos en histología y biología celular 251

15 Células madre e ingeniería de tejidos 303

Luis Santamaría Solís

Beatriz Pelacho Samper, María Gutiérrez Pérez, Felipe Prosper Cardoso

Actividades* Caso* Autoevaluación*

13 Técnicas de cultivo celular María Ángela Burrell Bustos, Rafael Vázquez Martínez, María del Mar Malagón Poyato, Francisco José Esteban Ruiz

Casos* Autoevaluación*

*Disponible online.

Paul Alain Nguewa Tchinda, Alfonso Calvo González, María José Pajares Villandiego, Diana Llópiz Khatchikian, Alfredo Martínez Ramírez

Casos* Autoevaluación*

265

índice alfabético

329

Introducción histórica a la biología celular y la histología Luis M ontuenga Badía, Pilar Sesma Egozcue, Alfonso Calvo G onzález

INTRODUCCIÓ N

INICIOS DE LA BIO LO GÍA CELULAR

Para llegar a un conocimiento profundo de cualquier materia es muy importante cono­ cer el origen histórico de los conceptos. La historia de los hallazgos y las vías por las que se han ido abriendo camino las ideas ayudan a comprender cada especialidad. El conocimiento de la historia de una especia­ lidad y, sobre todo, la atención selectiva a episodios o procesos especialmente impor­ tantes de su desarrollo, tienen el gran valor de mostrar cómo funciona el método de esa ciencia en la vida real. El relato sucesivo de determinados descubrimientos clave enseña, mucho mejor que cualquier descripción teó­ rica, que lo que en un momento determinado consideramos como verdad científica no es más que la sucesiva acumulación de mu­ chas contribuciones, errores, correcciones y debates. De ahí que, al acometer cualquier proyecto de investigación, sea tan recomen­ dable llevar a cabo una revisión bibliográ­ fica amplia y procurar llegar a los artículos clave, que configuraron las ideas iniciales del tema objeto de estudio. De este modo, conoceremos bien cuáles han sido los hitos históricos en el progresivo desarrollo de ese campo. En los próximos párrafos vamos a introducir algunos episodios históricos del desarrollo de la ciencia histológica y de la biología celular, y se mencionarán algunos de los momentos estelares que configuraron estas disciplinas.

La primera parte de la historia de la citolo­ gía y la histología se desarrolla en paralelo a la del microscopio. En la frontera entre los siglos xvi y xvii, Zacharias Jansen y Hans Lippershey, fabricantes de lentes de la ciudad holandesa de Middelburg, diseñaron y ensamblaron los primeros microscopios compuestos. Se trataba de instrumentos muy rudimentarios: dos lentes de vidrio montadas en un cilindro. Estos pioneros de la micros­ copía seguramente no sospechaban que, con su nueva herramienta, estaban abriendo la puerta a una apasionante e inacabable aventu­ ra, que ocupa cada día a un número creciente de científicos. Los pioneros de esa la nueva disciplina estaban explorando una dimensión totalmente desconocida del mundo natu­ ral: la dimensión microscópica. El propio Galileo, a comienzos del siglo xvii, usó uno de estos microscopios elementales como he­ rramienta para observar los ojos compues­ tos de los insectos. En 1665, Robert Hooke, encargado de instrumentos de la Royal So­ ciety de Londres, examinó con un micros­ copio una fina lámina de corcho preparada previamente con una navaja (fig. 1-1). En su comunicación a la Royal Society de 1667 escribió: «... Pude darme cuenta con toda claridad de que estaba perforada y llena de poros como un panal». Posteriormente deci­ dió examinar fragmentos de otros vegetales y descubrió que «en la médula del saúco, o

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1

Técnicas en histología y biología celular

FIG U RA 1-1 R o b e rt H o oke, en 1665, acuñó por prim era vez la p alabra «célula» al o bservar u na fina lámina de corcho al m icroscopio (dibujo original de su obra Micrographia, de 1667).

de casi todos los árboles, en la pulpa interna o en la médula de diversas plantas como el hinojo, la bardana, el cardo y ciertas cañas» existía la misma estructura porosa. Por su similitud con las estructuras análogas de los panales, denominó a estos pequeños com­ partimentos con el nombre latino cellulae (celdillas, células). La observación de Hooke, recogida en el capítulo X VIH de su obra Micrographia, corresponde a lo que hoy describimos como paredes celulares vegetales. En ese texto, Hooke utilizó por primera vez el término «célula» y acuñó un concepto que se ha convertido en universal y permanente. Des­ de entonces, el término «célula» se sigue utilizando para designar el elemento básico de los seres vivos. Poco después, en 1672, el también británico Nehemiah Grew envió a la Royal Society un trabajo titulado The ana­ tomy o f vegetables begun, en el que incluía una serie de dibujos sobre la estructura de

las plantas. Su interpretación de la estructura del tejido vegetal se centra en que el mismo está formado por una compleja red de fibras individuales1. Por otro lado, en sus apasio­ nantes estudios de anatomía de las plantas publicados también en Londres en 1675 y 1679, el gran científico boloñés Marcello Malpighi (fig. 1-2A) también distinguió las células y las llamó utrículos. Como los cien­ tíficos anteriores, Malpighi no dio con una interpretación adecuada de estas estructuras ni se dio cuenta de que todos los seres vivos están, en realidad, compuestos de células. Si Malpighi hubiese dado con la clave, quizás ahora estudiaríamos «utriculogía» en vez de citología... Antoni van Leeuwenhoek (fig. 1-2B), un comerciante de paños de Delft, aficionado a la construcción de microscopios, realizó descripciones de gran interés biológico y de precisión extraordinaria. Leeuwenhoek des­ cubrió, por ejemplo, la existencia de células libres y publicó dibujos excepcionales de algunas de ellas, tales como espermatozoi­ des y determinadas células sanguíneas. Ob­ servó, asimismo, microorganismos. Hooke, Malpighi y Leeuwenhoek fueron, de hecho, los primeros científicos que se adentraron en el inexplorado mundo de la organización celular animal. Malpighi, en su Exercitatio de omento, refiere que observó al microscopio lo que denominó «pinguedinis globuli» y «adiposi globuli». Parece que no hay duda de que lo que tenía ante sus ojos eran adipocitos. Leeuwenhoek también identificó glóbulos en sus primeras observaciones microscópicas de material biológico animal. Por ejemplo, en 1674 refiere a la Royal Society sus es­ tudios sobre la estructura microscópica de un pelo: «Vi un pelo de alce y encontré que todo él consistía en un conglomerado ' Las descripciones de G rew, y su com paración de la estructura microscópica de los vegetales con el encaje de bolillos, tuvieron una profunda influencia, que en cierto m odo perm anece todavía cuando utilizam os términos com o «tejido» o «histología». L a inicial idea d e los «tejidos» que componían el ser vivo n o tenía nada que ver con nuestra idea actual, sino que durante muchas décadas (hasta alrededor d e 1830) se entendió como algo parecido al entramado textil.

Capítulo | 1 Introducción histórica a la biología celular y la histología

FIGURA 1 -2

publicación MASSON. Fotocopiar:

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3

A) M arcello M alpighi (1628-1694). B) Antoni Van L eeuwenhoek (1632-1723).

de glóbulos que, gracias a mi microscopio, se me aparecían tan claros como si pudiera cogerlos con la mano». A partir de estas primeras descripciones de material globular, muchos otros autores identificaron glóbulos al observar los organismos animales al microscopio. A partir de los trabajos de Wolff, Fontana, Oken o Dutrochet, se construyó una de las ideas precursoras de la teoría celular: la teoría globularista, que se puede resumir en la idea de Dutrochet: «Todos los órganos de los animales están compuestos por conglomerados de corpúsculos globu­ lares». Aunque muchas de las descripciones de los globularistas fueron auténticamente revolucionarias, otras fueron simplemente interpretaciones erróneas debidas a las abe­ rraciones asociadas a sus microscopios, en especial a la aberración esférica de las lentes. Por eso, en 1827, se dio un paso hacia delante muy importante, gracias a la reducción de las aberraciones esféricas puesta a punto por Lister. Entonces se cayó en la cuenta de que un buen número de los «glóbulos» que habían visto los primeros microscopistas no eran sino imágenes de pequeñas partículas

rodeadas por un halo de aberración esférica. En un gran estudio sobre la teoría celular, J. R. Baker señala que aunque la teoría globu­ larista es ciertamente precursora de la teoría celular, no hay que confundirla con su au­ téntica fundamentación. Si no se profundiza suficientemente en los escritos originales, podría parecer que el conocimiento de esos autores acerca de las células era mayor del que de hecho tenían. Algunos «glóbulos» que describieron eran células y, en este sentido, estaban en el camino del progreso. Lo difícil para los historiadores es distinguir las ocasio­ nes en las que dichos autores realmente veían células de aquellas en las que observaban algo distinto. Antes de seguir, conviene subrayar que las observaciones de estos pioneros de la biología microscópica son especialmente meritorias si se tienen en cuenta las condi­ ciones en que se desarrolló su trabajo. Como señala Víctor Host, «utilizaban microscopios simples, es decir, lupas con lentes de distan­ cia focal muy pequeña, pero de campo muy reducido, o bien microscopios compuestos con objetivos y elementos oculares bastante

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rudimentarios; en el primer caso, la explora­ ción del objeto requería enorme paciencia; en el segundo, el problema eran las aberraciones capaces de deformar totalmente la imagen del objeto estudiado. Los dibujos y las figuras eran de una precisión extraordinaria: fueron los inventores del dibujo naturalista, que tu­ vo una importancia capital en biología hasta 1950: un dibujo de este tipo exigía a menudo 10 h de trabajo, pues constantemente había que desplazar la preparación por lo reducido del campo de visión...». Cualquiera que se interese por los orígenes históricos de la citología y la histología caerá en la cuenta de la extraordinaria importancia que ha tenido para la fundamentación de nuestra disciplina la capacidad de observación detallada y de descripción minuciosa, así como la fidelidad y el esmero en la confección de los dibujos de los que han hecho gala estos pioneros de la biología celular. De modo paralelo, en la pequeña historia de aprendizaje personal de cualquiera que se interese por la biología celu­ lar o la histología, se repite a pequeña escala el mismo proceso: el desarrollo progresivo de los hábitos de observación, descripción y registro minucioso de los datos, que deben estar pre­ sentes en los objetivos de cualquier disciplina relacionada con esta área del conocimiento. También hay que subrayar cómo los avances de estas primeras etapas de nuestra disciplina estuvieron enormemente condi­ cionados por el perfeccionamiento de las técnicas de observación y preparación de las muestras. De hecho, a pesar de una etapa de florecimiento inicial con científicos como Hooke, Grew, Leeuwenhoek o Malpighi, la anatomía microscópica sufrió un estanca­ miento durante la mayor parte del siglo xvm. Los problemas asociados a la aberración de los instrumentos, que eran de construcción artesanal, hacían difícilmente reproducibles y generalizables las observaciones de los microscopistas. Las características técnicas de cada microscopio eran extremadamente variables, y la interpretación subjetiva del observador jugaba un papel más que decisivo. Los espermatozoides descritos por Leeuwen­ hoek eran glóbulos provistos de cola; los de Joblot (1776) parecían dotados de perilla; Gerber (1820) observa la presencia de ano y

orificio genital en los espermios. A los pro­ blemas derivados de la instrumentación había que añadir el hecho de que las técnicas de fijación, preservación y tinción (v. capítulos 3 y 4) no habían sido todavía desarrolladas, lo que limitó muy notablemente el progreso de la microscopía. En definitiva, el desarrollo de nuestra ciencia durante esas décadas del siglo xvin fue frenado, fundamentalmente, por la falta de innovación tecnológica. El primer microscopio acromático fue construido en 1791. Benjamin Martin, de Amsterdam, aplicó para la fabricación de un microscopio los mismos principios utilizados en la construcción del primer telescopio acro­ mático. Los primeros microscopios con lentes acromáticas fueron comercializados en 1825. Como hemos mencionado antes, Joseph Lister más tarde realizó un descubrimiento decisivo: la aberración esférica de las lentes acromáticas varía con el eje. Este autor, junto a Hodgkin, publicó Notice o f some Microscopic Observa­ tions o f the Blood and Animal Tissue. Hacia 1840, la mejora de la calidad de las lentes hizo posible que se consiguiera un aumento muy notable del poder de resolución de los micros­ copios: así, un poder separador de aproximada­ mente 1 |xm era ya lo normal para un micros­ copio ordinario de laboratorio de mediados del siglo xix (v. capítulo 2). Además, en el ámbito cultural del si­ glo xix aumentó el interés por las ciencias naturales, especialmente en Europa central, donde se produjo un nuevo florecimiento de la microscopía. De las escuelas de los científicos Johannes E. Purkinje y Johannes Müller surgió una importante promoción de histólogos que pusieron los fundamentos a la naciente anatomía microscópica. Uno de los frutos más importantes de esa escuela es, precisamente, la generalización del uso del microscopio, que se materializó en la acumulación de nuevas descripciones de es­ tructuras histológicas, muchas de las cuales mantienen desde entonces el nombre de los que las descubrieron (p. ej., Purkinje, Henle o Schwann). En esa época, asimismo, se fue perfilando el contenido de la teoría celular, que, como veremos a continuación, fue pro­ puesta formalmente por Theodor Schwann, en colaboración con Mathias Schleiden. Una

Capítulo | 1 Introducción histórica a la biología celular y la histología

indicación del clima de efervescencia de esta disciplina la encontramos en la introducción en 1840 de la anatomía microscópica como asignatura universitaria en las universidades de Londres y Edimburgo.

TEORÍA CELULAR Aunque la existencia de células se conocía des­ de finales del siglo xvn, hasta más de 100 años después no se llegó al convencimiento de que la célula era la unidad fundamental de los seres vivos. Antes de llegar a esta generalización fue preciso demostrar que no solo los vegetales sino también los animales estaban compuestos por células. Los primeros microscopistas hab­ ían atisbado esta realidad y los globularistas la generalizaron. Sin embargo, los científicos tar­ daron años en darse cuenta de que el «enrejado» de «utrículos» descrito en los vegetales era equivalente al conglomerado de «glóbulos» de los animales. Henri Dutrochet (1824), Johannes Müller (1835) y Pierre Jean Francois Turpin (1826) dieron pasos muy decisivos para la llegada de la teoría celular al caer en la cuenta de que la estructura microscópica de determina­ dos organismos vegetales y animales era muy similar. Turpin entendía la célula como un ser vivo, con autonomía propia, que, asociado a otras células idénticas, formaba el cuerpo de los orga­ nismos, de modo análogo a como el conjunto de individuos constituye la sociedad humana. Las ideas de Turpin tuvieron gran aco­ gida en los medios científicos europeos, especialmente en Alemania, desde donde aportaron nuevos y decisivos datos en apoyo de aquellas. De todas partes afluían pruebas: los zoólogos Meyen, Schultze y Haeckel las apoyaron, por ejemplo, al dar a conocer la biología de los protozoos. Du­ trochet, Mohl y Schleiden sugirieron que todos los elementos de las plantas, aun los que presentan diferenciaciones morfológicas mayores (fibras, tubos, etc.) no eran más que variaciones en tomo al mismo patrón único: la célula. Purkinje (1838) se acercó un poco más hacia la generalización final de que las células eran los elementos fundamentales de todos los seres vivos, plantas y animales. Las intuiciones de estos investigadores, compa­ rando animales y vegetales, y considerando

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la célula como elemento básico de muchos organismos vivos, fueron el germen de la teoría celular, de la que Cajal llegó a afirmar que iba a ser «la más alta y filosófica de las generalizaciones biológicas». Theodor Schwann (1810-1882; fig. 1-3A) fue uno de los más brillantes biólogos teóri­ cos y experimentales del siglo xix. Alumno de J. Müller, realizó estudios fisiológicos sobre la actividad muscular, estudió los fenómenos de la respiración y la fermenta­ ción, fue el descubridor de la pepsina, etc. Fueron muchas sus aportaciones científicas, pero Schwann ha pasado a la historia de la biología por ser quien, en 1839, propuso for­ malmente la teoría celular, después de man­ tener una notable entrevista con el histólogo vegetal Mathias Schleiden (fig. 1-3B). Una vez más el encuentro interdisciplinar entre colegas produjo un decisivo enriquecimiento mutuo de ideas, una «colisión productiva» que, en este caso, cristalizó en una de las más fecundas teorías de la historia de la ciencia. Schwann comparó sus hallazgos en cortes histológicos de notocorda y de cartílagos branquiales de renacuajo con los de tejidos vegetales preparados por Schleiden y observó una serie de características análogas. Reco­ giendo las ideas de Turpin y aplicando a la esfera animal la hipótesis de Schleiden sobre la generación blastemática de las células ve­ getales, concluyó la teoría celular y subrayó el papel de la célula como unidad elemental del organismo vivo. Inicialmente, la teoría celular propuesta por Schwann se refería a dos aspectos: al origen de cada célula y a la célula como unidad estructural de organiza­ ción de los seres vivos. En cuanto al origen de la célula, propuso para los organismos animales algo similar a lo que Schleiden había formulado para las células vegetales: el origen de las células a partir de una masa desestructurada llamada «citoblastema», mediante un mecanismo similar a la forma­ ción de los cristales. El tiempo demostró que esta primera propuesta era completamente errónea. Sin embargo, lo que hoy conocemos como «teoría celular» fue su afirmación de que la célula es la unidad estructural básica del organismo vivo. Muchos autores con­ tribuyeron a definir, demostrar y reformular

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A

B

FIGURA 1 -3 A) Theodor Schwann (1810-1882). B) M athias Schleiden (1804-1881). las teorías de Schwann y Schleiden respecto a esta cuestión. Por ejemplo, medio siglo des­ pués (1910), Santiago Ramón y Cajal, en su Manual de anatomía general, esquematizó la teoría celular en cinco propuestas. Más

tarde, en 1948, John R. Baker, en uno de los trabajos más completos y rigurosos de los que se dispone sobre la génesis y el desarrollo de la teoría celular, reformuló la teoría en siete proposiciones. El cuadro 1-1 ofrece una

Cuadro 1-1 Contenido básico de la teoría celular Inicialmente propuesta p or Schwann y Schleiden (1839), y actualizada y perfeccionada posteriormente p or numerosos autores

La mayoría de los organismos vivos con­ tienen o consisten en un gran número de cuerpos microscópicos, llamados «células», que en los tejidos menos dife­ renciados tienen forma poliédrica o casi esférica. Todos los tejidos (vascular, nervioso, mus­ cular, etc.) están formados por células. Las células son las partes vivas de los orga­ nismos, es decir, la parte en la que ocurre síntesis de nuevo material. El cuerpo de los seres vivos está compuesto de células, células modificadas y material producido por las células. Las células tienen una serie de caracterís­ ticas definidas: a) tienen esencialmente

la misma naturaleza; b) están dotadas de membrana, citoplasma, y núcleo, y c) son auténticas unidades estructurales. Las células siempre surgen, directa o indi­ rectamente, de otras preexistentes, general­ mente por división binaria (en contra de lo que propusieron originalmente Schwann y Schleiden en 1839). Cada célula de un organismo multicelular tiene cierta semejanza estructural con un ser vivo unicelular y, en este sentido, cierta individualidad; esta es de distinto grado a la de todo el organismo, en el que la ac­ tividad, la funcionalidad y la distribución espaciotemporal de las células están alta­ mente sincronizadas.

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síntesis de los conceptos básicos que fue­ ron decantándose en lo que en la actualidad conocemos como «teoría celular» e incluye algunas de las formulaciones de los dos resúmenes que acabamos de mencionar. La teoría celular supuso una puerta abierta y un muy eficiente catalizador para el avance de la fisiología y de la patología, de eficacia difícilmente comparable a la de otras grandes teorías científicas. La teoría celular reúne todas las características para ser considerada una auténtica teoría científica: surgió como consecuencia de numerosas ob­ servaciones; se convirtió en fuente de múlti­ ples inferencias que posteriormente fueron objeto de experimentación, se confirmó con observaciones procedentes de diversas es­ pecialidades científicas y ha ido ganando coherencia a base de eliminar los errores asociados a sus formulaciones iniciales. Por último, es indudable que, como es propio de las grandes generalizaciones teóricas del ámbito científico, la teoría celular ha es­ timulado muy decisivamente el posterior desarrollo de la investigación en las ciencias biomédicas.

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publicación MASSON. Fotocopiar:

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DESARROLLO DE LA BIO LO G ÍA CELULAR GRACIAS AL PROGRESO DE LAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS En los años sucesivos a su formulación, la teoría celular, en lo que se refería a la organización de los seres vivos, fue objeto de aceptación casi generalizada. A pesar de su éxito en ámbitos científicos, la incorporación de la doctrina de la teoría celular a la enseñanza universitaria tendría que es­ perar un tiempo. Son paradigmáticas las dificultades de Lereboullet, que tradujo la obra de Schwann al francés en 1842. Es­ te profesor de Estrasburgo quiso intercalar una serie de lecciones de histología en su curso de zoología y, a pesar del gran éxito del mismo entre los alumnos, fue advertido por las autoridades académicas de que estaba sobrepasando el contenido de su programa, El sabio profesor, bien adaptado al sistema de enseñanza universitaria centralizada, tuvo que aceptar la advertencia y limitarse a cul­ tivar la histología en su despacho.

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El desarrollo de la teoría celular se ace­ leró a lo largo de todo el siglo xix gracias al perfeccionamiento de numerosos aspectos técnicos histológicos. En la segunda mitad de la centuria, el poder de resolución del mi­ croscopio llegó prácticamente al límite de sus posibilidades. En 1876, Ernst Abbe propuso los fundamentos teóricos que llevaron a la fa­ bricación de objetivos apocromáticos, en los que la aberración cromática residual, propia de las lentes acromáticas, es totalmente co­ rregida (v. capítulo 2). En 1878, J. W. Ste­ phenson introdujo el objetivo de inmersión. En el mismo período, las técnicas de preparación del material objeto de observación micros­ cópica (v. capítulo 3) también experimentan notables progresos. Como es conocido, en la calidad de una imagen microscópica influyen no solo el poder de resolución del micros­ copio y la ausencia de aberración óptica, sino también el espesor del corte y el contraste del tejido. En los inicios de la histología, las ob­ servaciones de tejidos vegetales fueron de mayor calidad y precisión que las de tejidos animales, debido a la mayor facilidad de conseguir tejidos vegetales en condiciones óptimas para ser observados al microscopio. Poco o nada se conocía sobre la alterabili­ dad de las estructuras vivas y con mucha frecuencia se estudiaba material necrosado o macerado, o, en el mejor de los casos, ex­ tensiones finas de material no perfectamente preservado. Algunos estudios de material obtenido por desgaste (como los del proceso de osificación a cargo de Müller) obtuvieron resultados interesantes, pero la mayoría de estos trabajos proporcionaron información de escasa entidad. Aunque las amas de casa o los profesores de anatomía utilizaban lí­ quidos conservantes (alcohol, ácido acético, formol), poco se sabía sobre sus mecanis­ mos de acción sobre los tejidos. De ahí que cuando en 1883 J. Jacobson propuso tratar con una mezcla de ácido crómico las piezas que iban a ser observadas, con el objeto de preservarlas y endurecerlas, facilitando así su posterior corte a mano, se verificó uno de los grandes avances técnicos que con­ tribuyeron al ulterior desarrollo de la his­ tología. Eran los primeros pasos de la técnica

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de fijación histológica. Posteriorm ente, A. Hannover utilizó el método del ácido crómico para endurecer el ojo y los nervios, lo que supuso el primero de una gran serie de trabajos de varios grupos que aplicaron protocolos similares para estudiar de modo exhaustivo el sistema nervioso central. Más adelante se emplearon otros fijadores, como el alcohol, el bicromato de potasio, la mezcla de ácido acético y alcohol (fijador de Clarke), el tetróxido de osmio, etc. El último de los fijadores clásicos descubiertos, y paradóji­ camente el más utilizado actualmente, fue el formaldehído. Fue el doctor F. Blum quien, mientras estudiaba en 1893 en Frankfurt las propiedades antisépticas del formaldehído, se dio cuenta, por casualidad, de la excelente capacidad de preservación histológica del mismo. Pronto se demostró que el formol era uno de los fijadores que mejor mante­ nían la estructura fina del citoplasma, y hasta ahora sigue siendo uno de los fijadores de preferencia para tejidos animales. El examen microscópico de los tejidos supone como condición indispensable que los cortes sean translúcidos y, por tanto, de espesor muy fino. En los inicios de la histolo­ gía, la obtención de cortes finos, en especial en tejidos blandos animales, era un proceso que acarreaba numerosos problemas. La in­ troducción de las técnicas de endurecimiento por frío y de inclusión en parafina o celoidina supusieron la superación definitiva de tales dificultades. En 1825, Raspail ya había com­ probado los ventajosos efectos del frío sobre los tejidos blandos. No obstante, el método de los cortes por congelación es atribuido a Stilling, quien, en 1842, redescubrió la citada técnica. La parafina fue utilizada por primera vez en 1869 por Klebs, que buscaba un so­ porte material para las piezas que evitase los artefactos asociados a la criosección. Inicial­ mente, la parafina solo se usaba para englobar las piezas, pero no para incluirlas. Las prime­ ras infiltraciones propiamente dichas fueron llevadas a cabo en un estudio de embriología de invertebrados marinos en la Stazione Zoologica di Napoli, en 1882 (fig. 1-4). La observación de los cortes histológicos requiere un mínimo de contraste entre los diversos elementos del tejido. La coloración

FIG U R A 1 -4 L a S ta z io n e Z o o lo g ic a di N apoli, fundada en 1872, fue donde se hicieron las prim eras inclusiones histológicas.

selectiva (v. capítulo 4) de las estructuras de la sección aumenta ese contraste y facilita el estudio microscópico. A finales del siglo xvni, Felice Fontana dio los primeros pasos en el campo de las técnicas de tinción al tratar los tejidos que observaba con medios ácidos o básicos y sustancias colorantes de origen vegetal. En 1781, el ilustre científico reveló la existencia del núcleo y del nucléolo, que 50 años más tarde, en 1831, Brown confirmó y generalizó a todas las células. La puesta a punto de nuevas técnicas de coloración y la optimización de las ya existentes fueron dos de los objetivos principales de la inves­ tigación de muchos pioneros de la histología durante no poco tiempo. La importancia deci­ siva de las técnicas de coloración fue puesta de manifiesto en innumerables ocasiones. Los métodos de impregnación argéntica, perfeccionados, entre otros, por Santiago Ramón y Cajal, jugaron un papel principal en el conocimiento de la estructura del sis­ tema nervioso. El carmín, la hematoxilina y otros derivados anilínicos ya eran utilizados rutinariamente en 1860. A finales del siglo xix y principios del xx se desplegaron la ma­ yoría de los métodos de tinción histológica conocidos en la actualidad. Gracias al progreso de las técnicas his­ tológicas, en la segunda mitad del siglo xix se producen numerosos nuevos descubri­ mientos. La mayor parte de los estudiosos de esa época se dedicaron a confirmar ex­ perimentalmente inferencias derivadas de la teoría celular. El núcleo, por ejemplo, fue objeto de especial atención. Entre 1870 y

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FIG U RA 1-5 L a p rim era d escripción del proceso básico de la mitosis la realizó W alther Flemming (18431905) en su obra Zellsunstanz, K e m und Zelltheilung (1882). L a imagen es una de las numerosas ilustraciones de células en mitosis que contiene dicho libro.

1880 se describieron por primera vez las figuras de la mitosis en plantas y animales. Primero Eduard Strasburger (1875), en los vegetales, y luego Walter Flemming (1878), en el reino animal, propusieron que la mitosis es la forma general de la división celular y describieron sus fases. Strasburger describió fundamentalmente lo que actualmente de­ nominamos metafase y anafase; Flemming ya informó sobre las cuatro fases que cono­ cemos en la actualidad.2 De hecho, la gran aportación de este último no fue solo la des­ cripción del proceso básico de la mitosis, que resumió magistralmente en los diagramas publicados en su libro Zellsubstanz, Kem und Zelltheilung (1882) (fig. 1-5); también se dio cuenta de que en la mitosis las dos mitades longitudinales de cada cromosoma se separan en direcciones opuestas, de modo que el nú­ cleo de la célula hija está formado por un conjunto completo de mitades longitudinales del núcleo de la célula madre. Los primeros recuentos de cromosomas metafásicos se re­ alizaron en esos años. Las dificultades téc­ nicas y los fundamentos teóricos no siempre exactos llevaron a resultados inciertos; por 2 Flemming eligió como material de estudio la salaman­ dra (Salamandra maculata), fundamentalmente porque este anim al tiene células y núcleos muy grandes. Esta elección se dem ostró m uy fructífera, ya que el hecho de q ue lo s crom osom as de esta esp ecie fueran muy largos le p e rm itió o b ten er im ágenes m uy cla ras de células en mitosis. U n ejem plo m ás en la historia de la ciencia de la im portancia de seleccionar m uy bien los modelos experim entales.

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ejemplo, numerosos botánicos (entre ellos el propio Strasburger) negaban la constancia en el número de los cromosomas. No obstante, ya en 1885, Radl, al observar en algunas es­ pecies esa constancia numérica, propuso la permanencia de los cromosomas durante la interfase. Inicialmente, se hablaba de «fila­ mentos», «gránulos» y «material cromático», hasta que Waldeyer, en 1888, propuso el afortunado nombre de «cromosomas». Al mismo tiempo se produjo una gran ex­ plosión de estudios sobre el citoplasma, que concluyó con el descubrimiento de nuevos orgánulos en lo que, inicialmente, se creía que era un jugo celular homogéneo. Así, Altmann (1886) describe unas esférulas intracelulares independientes, que posteriormente Benda (1894) y Mevés (1908) reconocieron y denominaron «mitocondrias». Boveri y Van Beneden (1883) descubrieron en el óvulo un cuerpo especial de gran relevancia en la re­ producción celular: el «centrosoma» con el «áster». Hendenhain (1875), Langley (1879) y otros revelaron en las glándulas la existencia de gránulos cargados de diversas sustancias, como mucina, cimógeno, melanina, etc. En 1898, Camillo Golgi describió en algunas neuronas un «aparato reticular interno», ha­ llazgo que posteriormente fue confirmado por otros autores como Holmgren (1900) o el pro­ pio Cajal, que lo definió así: «Primero en las células nerviosas, después en otras categorías de elementos, un tubo cerrado, de funciones enigmáticas, especie de cavidad digestiva an­ fractuosa». Este orgánulo, en atención a su primer observador, en la actualidad recibe el nombre de «aparato de Golgi». La extensión de la teoría celular a los do­ minios de la embriología fue llevada a cabo por Rudolph Albert von Kólliker, recogiendo ideas de Barry sobre la segmentación del huevo de conejo. Kólliker, que en 1845 había propues­ to la naturaleza celular de los gametos, fue el principal protagonista en los primeros pasos de la biología del desarrollo embrionario. Gracias a sus estudios, entre 1840 y 1861 quedó es­ tablecido que la división celular es el único fenómeno responsable de la segmentación y de la formación de las hojas embrionarias. En el afianzamiento de la teoría celular jugó, asimismo, un papel decisivo el ilustre patólogo

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FIGURA 1-6 A) Santiago Ram ón y Cajal (1852-1934) en su laboratorio a la edad de 40 años, un poco después de ser nombrado catedrático de H istología y A natomía Patológica de la Universidad d e Madrid. B) Corte transversal semiesquemático del cerebelo de un mamífero. Dibujo científico de Santiago Ramón y Cajal (hacia 1892). (Copyright Herederos de Santiago Ramón y Cajal.) alemán Rudolph Virchow, profesor de anato­ mía patológica y creador de la primera revista de la especialidad. Virchow inició la patología celular y animó a sus colegas a la utilización del microscopio como medio diagnóstico. Una de las grandes ideas de Virchow fue el concepto de que en la base de las enfermeda­ des siempre puede encontrarse una alteración celular. Este fue el momento inicial de la pa­ tología celular, que más tarde se desarrolló en una patología de los orgánulos y, actualmente, en una auténtica patología molecular. Virchow también ha pasado a la historia por haber acu­ ñado uno de los aforismos científicos más ins­ pirados. En un artículo publicado en sus Archiv en 1885, formuló la célebre sentencia latina «Omnis cellula e cellula» (toda célula procede de una célula) para ilustrar la comunidad de origen de todas las células del organismo y la continuidad entre los individuos a través de las células germinales. Para J. R. Baker esta es una de las más importantes inducciones de la historia de la biología. Uno de los problemas que encontró la teoría celular para ser aceptada por todos los científicos fue la dificultad de demostrar irrefutablemente la individualidad celular en

todos los tejidos. Así como era evidente que cada una de las células vegetales —rodeada por la gruesa pared celular— era individual, existían numerosos estudios que sugerían la continuidad del protoplasma en los tejidos animales. Un ejemplo de estas propuestas lo constituyen los estudios de Sedgwig sobre el mesénquima embrionario de elasmobranquios. Este autor proponía que este tejido estaba constituido por retículo protoplásmico continuo, en cuyos nudos se alojaban los nú­ cleos, formando un sincitio. El zoólogo Emst Haeckel fue un enérgico defensor de este concepto sincitial de los tejidos animales, que se denominó «teoría reticularista». Un tejido en el que los reticularistas concen­ traron particularm ente su atención y sus argumentos en contra de la universalidad de la teoría celular fue el nervioso. Las observa­ ciones de las complejas redes y conexiones neuronales parecían apoyar este concepto de unidad protoplasmática. Los estudiosos de la anatomía microscópica de la escuela alemana de Gerlach propusieron la fórmula interme­ dia de que el reticularismo era un fenómeno restringido al tejido nervioso. La habilidad técnica y el coraje investigador de Santiago

C apítulo | 1 Introducción histórica a la biología celular y la histología

Ramón y Cajal (fig. 1-6A) permitieron resol­ ver esta polémica en favor de la teoría celular, que en este contexto también se llamó «teoría neuronal», después de que Wilheim Waldeyer introdujera el término «neurona». Cajal,3 en efecto, desplegó su tenacidad investigadora, sus excepcionales innovaciones en las téc­ nicas de impregnación argéntica y su genial intuición de que la observación del tejido nervioso en las fases de desarrollo embriona­ rio simplificarían enormemente el trabajo de interpretación (fig. 1-6B); de este modo, fue capaz de demostrar, sin posibilidad de duda, las terminaciones nerviosas y los contactos o articulaciones intemeuronales, que posterior­ mente Sherrington denominaría «sinapsis». Como síntesis de este período inicial de la citología y la histología se puede afirmar que fue una fase de desarrollo de las técnicas básicas de microscopía, de enorme trabajo de descripción morfológica de nuevas estructuras y de asen­ tamiento de los conceptos en tomo a la teoría celular. La citología clásica dejó como legado la visión de la célula como unidad básica de organización de los seres vivos, un completo y maravilloso atlas de los diversos tipos celulares y tejidos organizados, y una notable aproxima­ ción a las estructuras subcelulares.

LA NUEVA BIO LO GÍA CELULAR: LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Y OTROS DESARROLLOS TECN O LÓ GICO S EN MICROSCOPÍA La aparición del microscopio electrónico (v. capítulo 9) fue uno de los momentos revo­ lucionarios dentro del desarrollo de la biología

3 E n u na discreta nota a pie de página de su M anual de H istología Normal, C ajal reivindica la paternidad de la teoría neuronal frente a quienes la atribuían al his­ tó lo g o alem án : «E n E sp a ñ a e s e rro r co m unísim o, p o r desconocim iento de la b ibliografía, el atribuir a W . Waldeyer, el ilustre histólogo de Berlín, la paternidad de la doctrina de las neuronas, ignorando que el citado sabio, al resum ir en un semanario alemán nuestras ideas y descubrimientos, no hizo sino bautizarla con una pala­ bra nueva, la voz neurona (unidad nerviosa)». Ramón y Cajal S. M anual de H istología Normal. 5.a ed. Madrid: Imprenta y Librería de Nicolás Moya; 1910. p. 440.

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celular. Como hemos señalado, a pesar de los avances en las técnicas de preparación y tin­ ción de los cortes, durante las últimas décadas del siglo xix y las primeras del xx el poder de resolución de los microscopios no aumentó significativamente. Los histólogos se daban cuenta de que había estructuras subcelulares que escapaban a su poder de disquisición, pe­ ro no aparecía el instrumento necesario para resolver esos interrogantes. En los primeros años de la década de los treinta, Max Knoll y su estudiante de doctorado Emest Ruska en la Universidad Técnica de Berlín construyeron el primer microscopio electrónico, fundado en el conocimiento de que los electrones son capaces de moverse en el vacío y ser deflectados en su movimiento, de modo que pue­ den ser enfocados por solenoides que actúan como lentes. A finales de los años treinta ya se publicaron los primeros intentos de foto­ grafiar material biológico examinado con el microscopio electrónico. Desde estos primeros balbuceos hasta el diseño y la utilización de los microscopios electrónicos actuales, con un poder de resolución teórico de unos pocos angstroms, se ha producido un proceso de per­ feccionamiento técnico muy parecido al que se vivió en relación con el microscopio de luz. Durante varias décadas, los esfuerzos se concentraron en optimizar la preparación de los tejidos. Inicialmente se trabajaba con ex­ tensiones; más tarde, con cortes de material fijado mediante fijadores convencionales e incluido en parafina. La dureza del material de inclusión se reveló como un parámetro importantísimo para facilitar la obtención de cortes muy finos. Sucesivamente se probaron materiales como el colodión, la parafina fría, el metacrilato y, finalmente, resinas epóxicas como Araldita® o Epon®. Paralelamente fue perfeccionándose la calidad técnica de las cuchillas y de los microtomos. Inicialmente se utilizaban microtomos convencionales y cuchillas metálicas. Se intentó con técnicas de corte ultrarrápido, pero se demostró que no ofrecían demasiadas ventajas; las cuchi­ llas de cristal o diamante se fueron impo­ niendo, y el espesor del corte, reduciendo. La ultramicrotomía data de comienzos de los años cincuenta. Cuando en la actualidad se revisan retrospectivamente las primeras

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m icrografías electrónicas publicadas, es relativamente fácil darse cuenta de que la mayor fuente de problemas era la deficiente fijación. Aunque ya desde 1927 se conocía la enorme fiabilidad del tetróxido de osmio, no fue hasta 1945 cuando comenzó a utilizarse en microscopía electrónica. Hasta 1958 no se introdujo la aplicación de hidróxido de plomo para resolver los problemas de con­ traste debidos a la utilización de resinas epóxicas. En definitiva, hasta lograr los actuales protocolos, el progreso fue lento y trabajoso. Cualquiera que haya dedicado algún tiem­ po a trabajar con el microscopio electrónico, y se haya deleitado con la belleza y el orden del mundo biológico ultramicroscópico, com­ prenderá bien el entusiasmo y la dedicación de los pioneros de la microscopía electrónica, que se asomaron por primera vez a la ultraestructura de las células animales y vegetales. El fruto de esos intensos esfuerzos para el desa­ rrollo de la ciencia biológica está a la vista. Probablemente la principal aportación de la microscopía electrónica no consistió solo en la posibilidad de observar e identificar estruc­ turas que hasta entonces habían permanecido ocultas por las limitaciones del microscopio de luz; el microscopio electrónico fue, sobre todo, el instrumento clave para conseguir unificar los conocimientos morfológicos y funcionales de la realidad biológica. Gracias a la microscopía electrónica, la visión dualista de la forma y la función como elementos difícilmente recon­ ciliables fue superada por una visión mucho más dinámica y unitaria. En conjunción con los progresos conceptuales y técnicos de otras disciplinas biológicas, se llegó a transformar una citología y una histología puramente mor­ fológicas en la moderna biología celular.

Desarrollos recientes e innovación tecnológica en microscopía El proceso de perfeccionamiento técnico en relación con la microscopía electrónica no se ha detenido en ningún momento.4 Además 4 U n buen resumen de avances recientes se puede encon­ trar en el suplemento de julio de 2004 de Nature Reviews. Autores varios: microscopy collection. N ature reviews supplement n.° 3,2004.

del microscopio electrónico de transmisión (TEM, del inglés transmission electron mi­ croscope), desde hace décadas se utiliza el microscopio electrónico de barrido (SEM, del inglés scanning electron microscope), que permite estudiar las superficies de las muestras sombreadas con metales. Instru­ mentos de mayor complejidad combinan el microscopio de transmisión con el de barrido (STEM, del inglés scanning trasnmission electron microscope). El microscopio de alto voltaje (HVEM, del inglés high-voltage elec­ tron microscopy) permite el estudio de cortes más gruesos e incluso de células enteras. El concepto de microscopía dio un vuelco con la invención del microscopio de efecto túnel por H. Rohrer y G. Binnig (1982), quienes recibieron el premio Nobel de Física por su invención. Este fue el microscopio pionero de una nueva clase de microscopios mecánicoópticos de alta resolución que reciben el nombre genérico de «microscopios de campo próximo». Todos estos microscopios se basan en un mecanismo de funcionamiento común: el barrido de la muestra por una sonda muy sensible que registra alguna propiedad de la superficie de la muestra y registra el valor de esa propiedad en cada punto. Con esos datos, reconstruye una «imagen» de la muestra. En función del tipo de microscopio se puede me­ dir, por ejemplo, un campo electromagnético, la conductancia iónica, una fuerza determina­ da o una corriente eléctrica. El microscopio de fuerza atómica (AFM, del inglés atomic force microscopy; v. capítulo 10), desarrollado por Binning, Quate y Gerber en 1986, utiliza una punta afilada que recorre la superficie de la muestra y detecta las interacciones (fuerzas de repulsión a corta distancia, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals) que se generan entre ambas superficies. El AFM es capaz de detectar fuerzas del orden de los piconewtons. Los efectos sobre la pun­ ta sensible serán un reflejo de la topografía superficial de la muestra con un límite de re­ solución de tan solo 1 nm. El principal valor de la AFM es su versatilidad. Puede utilizarse para estudiar con una resolución nanométrica biomoléculas aisladas, complejos macromoleculares, etc., en condiciones fisiológicas. Otra generación de microscopios no ópticos

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de resolución nanométrica y subnanométrica son los microscopios de proyección puntual (point-projection microscopes). Entre estos microscopios están el de emisión de campo (field emission microscopy), el de ión de cam­ po (field ion microscopy) y la tomografía de sonda atómica (APT, del inglés atom probe tomography). Los tres están basados en la ex­ citación de iones de una muestra que golpean en un detector. La APT es el ejemplo más mo­ derno y permite realizar una reconstrucción tridimensional de una superficie átomo por átomo, con una resolución subnanométrica. Otras técnicas de microscopía desarrolla­ das más recientemente tienen que ver con la microscopía de fluorescencia. En el capítulo dedicado a la microscopía (v. capítulo 2) es­ tudiaremos las características básicas del mi­ croscopio de fluorescencia. Otro capítulo de este libro está dedicado a la microscopía confocal (v. capítulo 8), que es una modificación avanzada del microscopio de fluorescencia. Además de los modelos convencional y confocal de este último, más recientemente se ha desarrollado la microscopía de excitación de multifotones (multiphoton microscopy), que mejora considerablemente las condiciones de preservación de la fluorescencia de la muestra, disminuye el fotoblanqueamiento y reduce la fototoxicidad, lo que permite el es­ tudio continuado de células vivas que pueden permanecer en observación durante largos períodos de tiempo. A lo largo de las últimas dos décadas se han estado diseñando diversas metodologías basadas en el microscopio de fluorescencia que persiguen superar el límite de resolución impuesto por la difracción en la microscopía óptica que describe la ley de Abbe. Estas técnicas de microscopía óptica de superresolución, combinadas con la mi­ croscopía confocal, permitirán obtener imá­ genes de mucha mayor calidad y resolución. Ejemplos de este tipo de microscopía son la 4Pi y la de emisión estimulada (STED, del inglés stimulated emission depletion), que permite analizar la muestra con resolución nanométrica. Otros desarrollos recientes de la micros­ copía permiten combinar la observación y la manipulación simultánea de la muestra. El más extendido en estos momentos es el

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microscopio con microdisección por láser (fig. 1-7), que permite identificar bajo el microscopio óptico, aislar y recoger para su anáfisis molecular zonas concretas del tejido, incluso células individuales o cromosomas metafásicos. También en microscopía elec­ trónica existen nuevos equipos disponibles comercialmente que permiten la manipula­ ción de la muestra (corte, separación, etc.).

INTERACCIÓN DE LA CITOLOGÍA Y LA HISTOLOGÍA CLÁSICAS CON OTRAS DISCIPLINAS: EL ORIGEN DE LA BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR MODERNA Los intentos de correlación morfofuncional se han sucedido a lo largo de la historia de la biología celular, pero se han intensificado especialmente en las últimas décadas. Inicial­ mente, la fisiología fue la disciplina que más interactuó con la citología y la histología, en un intento de relacionar la morfología y la función de los órganos y tejidos. La biología celular moderna se ha for­ mado por el entretejido de diversas hebras: citología, fisiología, bioquímica y genética, que forman el sólido entramado que actual­ mente se denomina «biología celular». Esta articulación de disciplinas diversas ha propi­ ciado una nueva visión, mucho más dinámi­ ca, de la vida celular. Cada una de las hebras tiene sus propios orígenes históricos, y la mayor parte del entrelazamiento ha ocurrido en los últimos 50 años. La biología celular actual se entiende como una disciplina integradora de diversas ciencias que pretende conocer mejor el funcionamiento de células y tejidos. La bioquímica y la fisiología han completado enormemente la dimensión de la citología en el abordaje del conocimiento celular. Así como la citología ha avanzado gracias al perfeccionamiento de las técnicas de microscopía de luz y electrónica, la bio­ química y la fisiología deben buena parte de su veloz desarrollo a la puesta a punto de las técnicas de centrifugación y cromatografía, que facilitan la separación de los compo­ nentes moleculares y supramoleculares de la célula. La ultracentrífuga, como medio

FIG U RA 1 -7 A ) Microscopio con microdisector láser. B-E) Proceso secuencial de microdisección de un grupo de células de un carcinoma escamoso en un corte de tejido pulmonar: B) preparación teñida con tinción convencional (hematoxilina-eosina) para observar bien el tejido; C) corte seriado siguiente coloreado con verde metilo dispuesto a ser microdisecado; D ) corte después d e la microdisección, y E ) el fragmento aislado tras la microdisección, dis­ puesto para el análisis molecular. (P or cortesía del Dr. D avid Blanco, Universidad de Navarra.)

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de separación de estructuras subcelulares y macromoléculas en función de su tamaño, estructura tridimensional y densidad, ha sido también otro de los elementos decisivos del desarrollo de estas áreas. La ultracentrífuga y el microscopio electrónico fueron puestos a punto aproximadamente al mismo tiempo. De ese modo, la posibilidad de observar orgánulos y estructuras subcelulares se obtuvo casi al mismo tiempo que la de aislarlos y purificarlos. Los trabajos pioneros de Albert Claude de aislamiento de fracciones subce­ lulares fueron el primer ejemplo que llevó a la convicción de que las observaciones de la estructura celular y los estudios funcionales podían complementarse mutuamente: eran los comienzos de la biología celular. Otra de las ramas cuyos conocimientos confluyen con los de la biología celular es la genética, que, aunque históricamente se remonta a tiempos de Mendel, ha constituido la mayor parte de su cuerpo doctrinal en los últimos decenios. El descubrimiento de que la información ge­ nética es transmitida por el DNA fue uno de los elementos decisivos en el nacimiento de la nueva genética. El modelo de la doble hélice propuesto por James Watson y Francis Crick en 1953 supuso el comienzo de un creciente interés por el DNA y el punto de partida de una nueva era de la genética molecular, que desde entonces ha revolucionado la biología. Watson y Crick obtuvieron el premio Nobel de Medicina en 1962. Además de la citada técnica de fracciona­ miento celular, cuya importancia fue resaltada en 1974 cuando sus pioneros —Claude, De Duve y Palade— recibieron el premio Nobel, otras técnicas que serán objeto de estudio a lo largo de este libro fueron clave para el conocimiento de la fisiología celular: la autorradiografía, la citoquímica e histoquúnica, la inmunocitoquímica, los cultivos celulares, la citometría estática y de flujo, la hibridación in situ, el análisis de imagen, la morfometría y estereología. Además, la biología celular actual se ha nutrido de otras técnicas propias de la biología molecular y la genética, como la citogenética, las técnicas básicas y avanzadas de biología molecular, las tecnologías de anáfisis de proteínas y lípidos, las técnicas de secuenciación, la genómica, la proteómica, etc.

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Autorradiografía (v. capítulo 9) Se trata de una de las técnicas básicas para el estudio de la fisiología celular. El funda­ mento de la técnica autorradiográfica es la demostración de marcadores radioactivos en tejidos, células u orgánulos mediante la ex­ posición de películas fotográficas o emulsión autorradiográfica a secciones de esas mues­ tras. El marcador radiactivo normalmente se incorpora a la célula in vivo; por ejemplo, un tiempo antes de sacrificar al animal. La autorradiografía demostrará el destino y la situación dentro de la célula de la molécula marcada radiactivamente que se ha adminis­ trado. De este modo se puede conocer, por ejemplo, su incorporación diferencial a uno u otro tejido, su localización intracelular, su procesamiento, etc. El amplio uso que se ha hecho durante décadas de la autorradiografía demuestra cómo una técnica fundamental­ mente morfológica puede dar respuesta a in­ numerables interrogantes de orden funcional. En la actualidad, otras técnicas moleculares no radiactivas, que utilizan moléculas quimé­ ricas, trazadores o marcadores fluorescentes, han ido sustituyendo a la autorradiografía en muchas de sus aplicaciones.

Citoquímica e histoquúnica (v. capítulo 5) Su desarrollo comenzó cuando, en 1939, Gomori describió un método para localizar la actividad de la fosfatasa alcalina en los tejidos. En general, la citoquímica consiste en hacer que la actividad de una molécula presente en un tejido sea detectable con el microscopio. En el caso de la localización de enzimas, el fundamento de la técnica consiste en usar la reacción catalizada por una enzima para generar un producto in­ soluble, que pueda ser observable con el microscopio de luz o electrónico, por su color o su densidad a los electrones, res­ pectivamente.

Inmunocitoquímica (v. capítulo 6) Los avances de la inmunología en cuanto a la obtención de anticuerpos monoclonales

Técnicas en histología y biología celular

y policlonales han beneficiado decisivamente a la citología y la histología al converger en nuevas técnicas: la inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica. Fue Albert Coons, en los años cincuenta, quien primero marcó un anticuerpo con fluoresceína para localizar la correspondiente molécula antigénica en una sección histológica. Desde entonces han proliferado una gran variedad de técnicas, principalmente indirectas, de localización inmunocitoquímica a microscopio tanto de luz como electrónico, y en la actualidad es el principal método de localización celular disponible. Dentro de los métodos de de­ tección inmunocitoquímica indirecta, los más utilizados actualmente en microscopía óptica son la inmunofluorescencia indirecta y el método de los complejos avidina-biotina (ABC, del inglés avidin-biotin-complex) o variaciones del mismo todavía más sensibles. Por su parte, en microscopía electrónica, la técnica inmunocitoquímica más utilizada es la del oro coloidal.

Cultivos celulares (v. capítulo 13) La técnica de cultivo de tejidos se ha utili­ zado desde principios del siglo xx, cuando investigadores como Ross Harrison o Ale­ xis Carrel (premio Nobel de Medicina en 1912) diseñaron protocolos para estudiar el comportamiento de las células animales aisladas. En la actualidad, las técnicas de cultivo celular, después de un período de tiempo de carácter meramente explora­ torio y de otra etapa expansiva alrededor de los años cincuenta, están en una fase de especialización y de apogeo. La estandariza­ ción de las condiciones de cultivo y de las líneas celulares necesarias para la producción y el estudio de vacunas, y, especialmente, la necesidad de disponer de grandes cantidades de células han supuesto un enorme ímpetu en el desarrollo de las técnicas de cultivos. Esto, unido a la comercialización de medios de cultivo y a la mejora en el control de las contaminaciones gracias a los antibióticos y al equipamiento de purificación de aire, ha convertido la técnica de cultivos celulares en algo accesible a un amplio espectro de laboratorios.

Citometría estática y de flujo (v. capítulo 14) La técnica de la citometría estática ha permi­ tido objetivar y sistematizar la recogida de parámetros tales como la distribución de la crom atina nuclear, el porcentaje de área nuclear respecto de la citoplasmática o la disposición espacial de las células. El pro­ cedimiento consiste en la conversión de las imágenes recogidas por una cámara de vídeo en códigos numéricos utilizables por el or­ denador. El empleo de la citometría de flujo en el anáfisis automático y en la separación de las células ha abierto nuevas perspectivas en el campo de la investigación biológica. El desarrollo y la aplicación de esta tecnología se han beneficiado de los recientes avances producidos en campos tan diversos como la producción de anticuerpos monoclonales, el conocimiento de las propiedades químicas de los fluorocromos, los procedimientos de tin­ ción histoquímica, la informática y la tecno­ logía láser. Esto representa un ejemplo más de convergencia de diversos campos para ganar en rapidez, precisión y sensibilidad en el análisis celular.

Análisis de imagen (v. capítulo 11), morfometría y estereología (v. capítulo 12) Constituyen otro grupo de técnicas que se han desarrollado gracias a los esfuerzos coordinados desde diversas áreas de conoci­ miento, como las matemáticas, la estadística y la informática. En el momento presente, la trascendencia y la significación de la mayor parte de los resultados del ámbito de la cito­ logía y la histología, que antes se quedaban en el nivel de definición cualitativa, deben ser valoradas cuantitativamente mediante la utilización de estas técnicas. El análisis de imagen tiene cada día un desarrollo mayor, en paralelo al perfeccionamiento y optimiza­ ción de los recursos del mundo digital. Por ejemplo, como veremos en el capítulo 11, el aum ento prácticam ente exponencial en el tiempo de la capacidad de almacena­ miento de información y de la velocidad de procesamiento ha facilitado enormemente

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la innovación tecnológica en el análisis de imagen aplicado a la biología celular.

Hibridación in situ de ácidos nucleicos (v. capítulo 7) Esta técnica perm ite la localización de secuencias concretas de ácidos nucleicos (tanto de DNA como de RNA) en secciones de tejidos. Fue descrita por primera vez en 1969 por dos grupos de forma independiente: John et al., y Gall y Pardue, aunque hasta los años ochenta no se introdujo como técnica común de los laboratorios de citología o his­ tología. Sus aplicaciones son muy diversas, tanto en el campo de la genética como en el de la biología del desarrollo y la fisiología celular. Se trata de aplicar la técnica de la hibridación de ácidos nucleicos desarrollada por la biología molecular para extractos celu­ lares a preparaciones histológicas, extensio­ nes celulares, etc. De este modo se consigue localizar morfológicamente en los tejidos lo que hasta entonces solo se detectaba bio­ químicamente. La técnica de hibridación in situ puede llevarse a cabo en tejidos fijados según distintos protocolos. Así, la empleada para localizar secuencias de DNA admite, por ejemplo, material fijado en formol e in­ cluido en parafina. El marcado de las sondas puede ser no isotópico (p. ej., con biotina o digoxigenina) o isotópico (H3, S35, P32).

Citogenética Uno de los primeros ejemplos de conver­ gencia entre la citología y la genética se dio al aparecer la citogenética. Cuando Tjio y Levan publicaron en 1956 su artículo sobre el correcto número de cromosomas de las células humanas, que dedujeron gracias a su técnica de «aplastamiento», estaban abriendo la puerta a una auténtica revolución. De 1948 a 1959 Joe Hin Tjio, nacido en Java cuando esta era colonia holandesa, investigó sobre cromosomas de plantas en la Estación Ex­ perimental Aula Dei de Zaragoza, donde fue jefe de la unidad de citogenética de plantas. En esa época, pasaba los veranos en Suecia, trabajando en cromosomas humanos con el profesor Albert Levan de Lund. Fue en 1956

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cuando los dos publicaron en la revista sueva Hereditas el artículo que ilustraba que las células humanas tienen 46 cromosomas y no 48, como se creía hasta entonces tras los trabajos publicados en 1923 por Theophilus Painter. La principal aportación de Tjio y Levan no fue tanto que indicaran el número de cromosomas de la especie humana como que introdujeran el método que ha hecho posible innumerables estudios posteriores. En síntesis, se trata de utilizar células en suspensión y detener su proliferación en metafase, de modo que se pueda cosechar un número suficiente de células en división. A la vez, estas son tratadas con una sustancia que afecta al huso mitótico, de modo que los cromosomas metafásicos estén separados y puedan ser estudiados con facilidad. Las técnicas de listado cromosómico desarro­ lladas posteriormente fueron el complemento ideal para estudiar los cariotipos normales y aquellos con alteraciones.

Técnicas de biología molecular. Un ejemplo: la reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) ha sido una de las técnicas claves para el desarrollo de la biología molecular de las últimas décadas y por eso la hemos seleccionado como una de las que más ha aportado también al desarrollo de la biología celular. La PCR consigue ampli­ ficar in vitro una región concreta del genoma, obteniendo así miles de copias idénticas de esa secuencia. Para ello, primero se diseñan dos oligonucleótidos sintéticos, complementarios a cada una de las dos hebras de la doble hélice, que hibridarán en los dos extremos opues­ tos de la región que se va a amplificar. Estos oligonucleótidos son los cebadores (primers) de la reacción de una enzima DNA polimerasa especial obtenida de bacterias termófilas. Es­ ta enzima es estable a altas temperaturas y, por tanto, resiste a la desnaturalización que se produciría con los repetidos tratamientos de calor incluidos en el protocolo de la PCR. También se pueden amplificar secuencias de DNA complementario (cDNA) obtenidas a partir de retrotranscripción del RNA, lo que

Técnicas en histología y biología celular

ha permitido estudiar la expresión de los genes en todo tipo de condiciones experimentales, así como en tejidos normales y patológicos. Se puede llegar a determinar, por tanto, si una célula o un tejido ha expresado un determina­ do gen, mediante análisis de la presencia de dicho RNA mensajero (mRNA), amplificado tras la retrotranscripción y la PCR. La incorpo­ ración de la PCR cuantitativa o a tiempo real permite, además, la cuantificación del DNA amplificado, mejorando así notablemente la técnica de la PCR convencional. En la PCR cuantitativa se utilizan fluorocromos (incor­ porados directamente al DNA o unidos en forma de sonda), que dan una señal medible relacionada directamente con la cantidad de DNA que se genera en cada ciclo de la PCR. La técnica cuantitativa permite, por tanto, conocer la cantidad absoluta de DNA o RNA en una determinada muestra. Actualmente se utiliza en diagnóstico para conocer perfiles de alteración en la expresión génica, carga viral o presencia de polimorfismos.

Técnicas de análisis genómico y proteómico a gran escala La técnica de secuenciación de ácidos nu­ cleicos ha ido perfeccionándose con el tiem­ po. El método que se usó para las primeras secuenciaciones de genoma completo y para el Proyecto Genoma Humano (v. más ade­ lante) es la técnica desarrollada en 1977 por Frederick Sanger, una de las pocas personas que han recibido dos premios Nobel, los dos de Química: el primero en 1958, por su con­ tribución a la secuenciación de proteínas, y el segundo en 1980, por su método de secuen­ ciación del DNA. El primer genoma com­ pleto que se secuenció fue el de la bacteria Haemophilus influenzae, que fue publicado en julio de 1995 (Science, 269, 496-512). Después de este gran éxito continuaron publi­ cándose los genomas de otros procariotas, hasta que en mayo de 1997 se publicó el genoma completo de Saccharomyzes cerevisiae, el pri­ mer eucariota totalmente secuenciado (Nature, 387, 5-105; 1997). Posteriormente, en el año 1998, se publicó por primera vez el genoma de un organismo multicelular, el nematodo C. elegans (Science, 282, 2012-2018; 1998).

El llamado «Proyecto Genoma Humano» constituyó otra iniciativa de gran trascen­ dencia. En mayo de 1998, la empresa Celera Genomics (Rockville, Maryland, EE. UU.) se propuso realizar en un tiempo récord la secuenciación del genoma humano. Parale­ lamente, surgió un proyecto con financiación pública del National Human Genome Re­ search Institute (NHGRI). Estos proyectos, liderados, respectivamente por Craig Venter y Francis Collins, contaron en realidad con múltiples equipos de distintos países que trabajaron en aspectos muy diversos, desde la secuenciación hasta la bioinformática. En abril de 1999 empezó la secuenciación y el 6 de abril del año 2000 se anunció a la prensa que ya se había logrado un borrador muy completo de la secuencia del genoma huma­ no. En febrero de 2001 se publicó en Nature (409, 860-921) y Science (291, 1304-1351) la secuenciación de unos 3.000 millones de pares de bases, aproximadamente el 90% del genoma humano. Uno de los hallazgos más sorprendentes fue que el número de genes (unos 20.000) era bastante menor que el es­ timado previamente. La secuencia del geno­ ma completo fue publicada en abril de 2003. Tras la publicación de 2001, Francis Collins, el director del NHGRI, explicó que el ge­ noma recién secuenciado se podía describir como un libro con muchos posibles usos: un libro de historia, que narra el viaje de nuestra especie a través del tiempo; un manual de instrucciones, que contiene un mapa increí­ blemente detallado de cómo construir cada célula del organismo, y un libro de texto de medicina, con datos que proporcionarán una inmensa capacidad de diagnosticar, prevenir y curar la enfermedad. El Proyecto Genoma Humano fue revolu­ cionario. Demostró la capacidad del trabajo en equipo para sacar adelante retos científicos de enorme magnitud. La secuenciación del genoma humano completo fue también la consecuencia de diversos desarrollos tecno­ lógicos en el ámbito de la secuenciación, de la automatización de reacciones químicas y del manejo de datos bioinformáticos. El método de Sanger fue la base fundamental para el Proyecto Genoma Humano. Pos­ teriorm ente han surgido tecnologías de

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secuenciación de nueva generación (NGS, del inglés next generation sequencing) que están permitiendo realizar secuenciaciones de genomas completos de forma mucho más barata y rápida. Actualmente, las tecnologías NGS combinadas con el desarrollo de técni­ cas bioinformáticas para el procesamiento masivo de ingentes cantidades de datos, nos permiten conocer con muchísimo más detalle el «paisaje genómico» de individuos nor­ males de muchas especies y de células con alteraciones genéticas, como las tumorales. Las técnicas genómicas de primera ge­ neración, el Proyecto Genoma Humano y las tecnologías NGS han proporcionado una gran cantidad de información a los investiga­ dores y, lógicamente, también han abierto las puertas a nuevos interrogantes, como son los procesos de regulación de la expresión de los genes. En este momento, no solo se estudia la secuencia codificante del gen y el mRNA derivado de su expresión. La regulación epigenética, las alteraciones en el procesamien­ to del RNA, el corte y empalme (splicing), el papel de las regiones no codificantes y del RNA derivado de ellas, los micro-RNA, etc. son nuevas áreas de conocimiento en las que muchos investigadores están centrando su atención y donde puede haber respuesta a muchas preguntas de interés clínico y bioló­ gico. Un nuevo proyecto multiinstitucional, Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE), pretende realizar un anáfisis integrado de to­ das las fuentes de información relacionadas con la genética y la epigenética. También se han abierto muchas cuestiones en tomo a las diferencias en el genoma entre los individuos de una misma especie, sobre la correlación entre genómica e historia evolutiva y sobre el modo por el cual las más sutiles alteraciones pueden o no predisponer a cada individuo a desarrollar una enfermedad. La investigación del siglo xxi se centrará en comprender cómo las variantes genéticas regulan el fenotipo de células, tejidos y órganos. Se calcula que existen unas 8.000 enfermedades here­ ditarias. En la actualidad ya se dispone de pruebas genéticas para unos pocos centenares de ellas. Para dar respuesta a estas preguntas se han desarrollado tecnologías que permiten

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el análisis de la expresión de miles de genes en un solo experimento. En el contexto de esta parte de la genómica se han puesto a punto las micromatrices de material bioló­ gico (microarrays o biochips), que han sido desarrolladas como una herram ienta más para el análisis y la obtención masiva de información biológica. La bioinformática también se ha desarrollado como disciplina puente para analizar la información masiva que se genera a partir de los diversos tipos de micromatrices. Si la genómica estructural es la rama de la genómica orientada a la caracterización y localización de las secuencias que conforman el DNA de los genes, permitiendo de esta manera la obtención de mapas genéticos de los organismos, la genómica funcional es la disciplina que se orienta hacia la recolección sistemática de información acerca de las fun­ ciones desempeñadas por los genes. El obje­ tivo de la genómica funcional es superar la laguna existente entre el conocimiento de las secuencias de un gen y el de su función. Por otro lado, la función en las células es realiza­ da por proteínas, por lo que el conocimiento genómico se debe trasladar al proteómico. La proteómica puede definirse como la genómi­ ca funcional en el ámbito de las proteínas. Es la ciencia que correlaciona las proteínas con sus genes y estudia el conjunto completo de proteínas de una célula, una muestra bioló­ gica o un organismo. Conocer el proteoma de un organismo implica tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas por ese organismo, en un momento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y ambiente. Las células expresan va­ rios miles de proteínas diferentes y cada una de ellas puede experimentar numerosas mo­ dificaciones en respuesta a microambientes diferentes. El análisis proteómico presenta, no obstante, importantes dificultades técnicas y todavía se está relativamente lejos de cono­ cer el proteoma humano de modo completo. También se ha desarrollado recientemente la llamada «metabolómica», que es el es­ tudio sistemático del perfil de metabolitos que se produce en una célula en las diversas situaciones normales o patológicas. La era «ómica» vislumbra un futuro esperanzador

Técnicas en histología y biología celular

en el tratamiento de muchas enfermedades; las diversas «ómicas» ayudarán a compren­ der el mecanismo que subyace en la génesis de esas enfermedades y, por tanto, abrirán nuevas perspectivas terapéuticas. El futuro de la biomedicina pasa nece­ sariamente por desarrollar nuestra capaci­ dad de integración de conocimientos. Es preciso integrar la información que ha ido aportando la biología celular y molecular con sus técnicas clásicas, y los abundantísi­ mos datos que aportan en la actualidad las tecnologías «ómicas». La bioinformática y la biología de sistemas son especialidades que han nacido al hilo del progreso de la biología que acabamos de describir y que han de contribuir en las próximas décadas a alcanzar este necesario objetivo de la inte­ gración de conocimientos. En este contexto, habrá que tener en cuenta que esta avalancha de innovaciones científicas está planteando, asimismo, importantes cuestiones éticas, que hacen preciso llevar a cabo un esfuerzo aún más profundo de integración de conocimien­ tos, no solo desde el ámbito científico sino

también desde el histórico, el filosófico y el teológico. Cada uno de estos ámbitos del conocimiento arroja su propia luz sobre los diversos aspectos de la verdad acerca del mundo y del ser humano que son necesarios para orientar adecuadamente los recientes logros de la ciencia.

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AUTOEVALUACIÓN 1. ¿Cómo contribuyó Ernst Abbe a la mi­ croscopía óptica? a. Fabricó el primer microscopio com­ puesto. b. Corrigió aberraciones cromáticas de las lentes. c. Desarrolló tinciones específicas para observar el tejido nervioso. d. Desarrolló las técnicas histoquímicas. e. Describió por primera vez microor­ ganismos al microscopio. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: Ernst Abbe propuso los fundamentos teóricos que llevaron a la fabricación de objetivos apocromáticos, en los que la aberración cromática es totalmente corregida. 2. Fontana describió por prim era vez la existencia en las células de: a. Núcleo. b. Aparato de Golgi. c. Lisosomas. d. Membrana plasmática. e. Retículo endoplasmático. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: en 1781, Fontana describió la existencia del núcleo y del nu­ cléolo. 3. ¿A quién se considera el «padre» de la patología celular? a. A Theodor Schwann. b. A Santiago Ramón y Cajal. c. A Rudolf Virchow. d. A Robert Hooke. e. A Marcello Malpighi. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: Virchow inició la patología celular y utilizó el microscopio como medio diagnóstico. Estableció el con­ cepto de que en la base de las enfermedades siempre puede encontrarse una alteración celular. 4. ¿Qué postulaba la teoría del reticularismo? a. Las células contienen un sistema reticular interno. b. Las células forman estructuras sincitiales.

c. Las células del sistema nervioso están separadas entre sí. d. Los tejidos vegetales están formados por celdillas, correspondientes a las paredes celulares. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: esta teoría proponía que los tejidos estaban constituidos por un sincitio, en cuyo interior se alojaban los nú­ cleos de las distintas células que lo compo­ nían. 5. ¿Cuál es la contribución de Max Knoll y Ernst Ruska a la microscopía? a. Desarrollaron técnicas de inclusión de los tejidos. b. Desarrollaron el primer microscopio electrónico. c. Utilizaron por primera vez el formal­ dehído para la fijación de los tejidos. d. Crearon el microscopio de efecto túnel. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: en los primeros años de la década de los treinta, Max Knoll y Emest Ruska construyeron el primer micros­ copio electrónico en la Universidad Técnica de Berlín. 6. El gran logro de A lbert Claude en la biología celular fue: a. Observar por primera vez lisosomas al microscopio electrónico. b. Desarrollar la técnica de autorradiografía. c. Poner en marcha la técnica de culti­ vos celulares. d. Desarrollar las técnicas inmunohistoquímicas. e. Aislar fracciones subcelulares me­ diante ultracentrifugación. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: los trabajos pioneros de Albert Claude de aislamiento de fraccio­ nes subcelulares mediante ultracentrifuga­ ción permitieron estudiar orgánulos aislados.

20.e2

7. La citogenética es una técnica que se desarrolló en los años: a. Treinta. b. Cuarenta. c. Cincuenta. d. Sesenta. e. Setenta. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: en la década de los cincuenta. 8. Frederick Sanger contribuyó enorme­ mente al avance de la biología molecular, ya que: a. D escribió por prim era vez que el DNA estaba formado por una doble hélice. b. Contribuyó de modo esencial al aná­ lisis de la secuenciación del DNA. c. Estableció la metodología para la am­ plificación del DNA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). d. Contribuyó al análisis de la secuen­ ciación de proteínas. e. Las respuestas B y D son correctas. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: Frederick Sanger recibió dos premios Nobel; el primero en 1958, por su contribución a la secuenciación de proteínas, y el segundo en 1980, por su método de secuenciación del DNA. 9. El primer genoma completo que se secuenció fue el de: a. Una bacteria. b. Una levadura. c. Una planta. d. Un animal. e. El hombre. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: el primer genoma completo que se secuenció fue el de la bacte­ ria Haemophilus influenzae, y fue publicado en julio de 1995. 10. De entre las siguientes respuestas sobre el objetivo del proyecto Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE), escoja la más adecuada: a. Pretende conocer el proteoma humano. b. Pretende llevar a cabo un análisis completo integrado genético y epigenético del genoma humano.

Técnicas en histología y biología celular

c. Pretende conocer las secuencias co­ dificantes de los genes humanos. d. Pretende determ inar el patrón de mutaciones de las principales enfer­ medades humanas. e. Pretende establecer un mapa evoluti­ vo de los genes humanos. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el proyecto multiinstitucional ENCODE pretende llevar a cabo un análisis integrado de todas las fuentes de información relacionadas con la genética y la epigenética.

RECURSOS O N LIN E Enlaces de interés R o b e rt H o o k e Observ. X V III o f the schematisme or texture o f cork, and o f the cells and pores o f some other such frothy bodies T he P ro je ct G utenberg: http://w w w .gutenberg.org/ files/15491/15491-h/l 5491-h.htm http://www.gutenberg. 0rg/eb 00ks/l 5491 Micrographia N ational L ib rary o f M edicine. T u rning T h e Pages Inform ation S ystem (TTPI). A udio-guided book: http://archive.nlm.nih.gov/proj/ttp/flash/hooke/hooke.html

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Microscopio óptico: fundamentos y tipos Francisco José Esteban Ruiz, Juan Ángel Pedrosa Raya

INTRODUCCIÓ N Los microscopios (del griego mikrós, «peque­ ño», y skopéin, «observar») son instrumentos de óptica que nos permiten ver objetos muy pequeños o detalles estructurales imposibles de distinguir a simple vista porque están por debajo del límite de resolución del ojo humano. El límite de resolución es la capacidad de visualizar dos puntos próximos como dos imágenes separadas. El límite de reso­ lución del ojo humano es de alrededor de 100-200 fxm (0,1-0,2 mm). Esto significa que, en el mejor de los casos, el ojo humano puede distinguir objetos cuyo tamaño no sea inferior a 100 o 200 |xm, o que se encuentren a 100-200 (xm de distancia entre sí. En la mayoría de los casos, al micros­ copio se observan células muertas que han sido procesadas a fin de eliminar el agua que contienen, preservar lo mejor posible su estructura, dar contraste a sus distintos componentes y obtener una sección (lámina de material) lo suficientemente delgada co­ mo para que la luz o los electrones puedan atravesarla. Sin embargo, en determinadas circunstancias también pueden observarse microscópicamente células vivas. Las células, en general, son muy peque­ ñas y transparentes a la luz visible, por lo que no pueden ser observadas a simple vis­ ta. El tamaño de la mayoría de las células eucariotas oscila entre 10 y 30 (xm de diáme­ tro, mientras que las células procariotas y los componentes subcelulares son aún menores. © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

Debido a ello, su visualization solo es posible si se utilizan diferentes tipos de microscopios que, por efecto de sus lentes combinadas, poseen mayor límite de resolución (lo que se expresa en un valor más pequeño, hasta 0,2 |xm para el microscopio óptico [MO] o unos pocos nanómetros en el caso del micros­ copio electrónico de transmisión). Así, los microscopios permiten obtener imágenes de la morfología externa o interna de las células. Los conocimientos actuales sobre las es­ tructuras celulares y tisulares se han obteni­ do, básicamente, con la ayuda de tres tipos de microscopio: el MO, y los electrónicos de transmisión y de barrido. Cada uno de ellos y cada procedimiento de preparación del material biológico para su observación brin­ dan un tipo de información particular acerca de la morfología celular. En este capítulo se presentarán los principios básicos de los diferentes tipos de MO.

M ICROSCOPIO SIMPLE (LUPA O MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO) Son aparatos que constan de una sola lente o de un solo sistema de lentes convergentes biconvexas (parte óptica) sostenidas por un soporte con tomillos de enfoque (parte mecá­ nica). La distancia focal es pequeña, de entre 5 y 10 cm. Proporcionan una imagen virtual, derecha, aumentada entre 2 y 20-30 veces. La magnificación depende del aumento pro­ porcionado por los oculares; generalmente 21

Técnicas en histología y biología celular

tienen también un sistema de acercamiento (zoom) enfrentado al objeto. Las lupas se utilizan como auxiliares en la observación o disección de piezas anatómicas pequeñas. Los estereomicroscopios modernos per­ miten una mayor distancia útil de trabajo, están provistos con sistemas de iluminación dirigible (luz reflejada) y pueden incluir las opciones de luz transmitida, iluminación de campo oscuro y luz polarizada. Cuentan con comandos que facilitan la manipulación de las piezas que se observan, y también es pos­ ible adaptar a ellos una cámara fotográfica o de vídeo.

M ICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO (CONVENCIONAL) También es llamado «microscopio de campo claro» o «microscopio fotónico», ya que se utiliza un haz de luz común (luz blanca) que atraviesa la muestra biológica e ilumina el campo de observación (fig. 2-1). La muestra que se observa debe ser lo bastante fina como

FIGURA 2-1 M icroscopio óptico convencional, pro­ visto de cámara fotográfica digital adaptada en el cabezal trinocular. (Imagen cedida p o r Leica-Microsystems.)

para que la luz pueda atravesarla. Los deta­ lles estructurales se visualizan debido a las diferencias de absorción de la luz en las dis­ tintas partes del material biológico. Este tipo de microscopio se suele utilizar para observar preparaciones histológicas coloreadas. El MO cuenta con tres sistemas de lentes: el condensador, que enfoca los rayos de luz sobre la muestra; los objetivos, que magni­ fican la imagen, y los oculares, que agregan una mayor magnificación y permiten la vi­ sualization directa del preparado (fig. 2-2). Se obtiene una imagen final virtual, invertida y aumentada de los objetos observados, tal como se explica en la figura 2-3.

Parte mecánica La parte mecánica de un MO consta del pie, la columna, el tubo, la platina y los tomillos para regular su funcionamiento (v. fig. 2-2). • El pie debe ser estable, sólido y amplio. • La columna puede tener un diseño de líneas curvas o rectas; sostiene el tubo y la platina. • En el tubo se encuentran los oculares y los objetivos. Puede ser monocular (con un ocular), binocular (con dos oculares) o trinocular (con dos oculares y un dis­ positivo para adaptar una cámara foto­ gráfica o de vídeo). Los objetivos están enroscados en un sistema de revólver, que permite colocar uno u otro en el eje óptico. • La platina es una superficie horizontal en la que se coloca el preparado, sujeto por medio de pinzas; generalmente cuenta con un sistema de corredera de precisión (platina mecánica) para desplazar dicho preparado de derecha a izquierda (eje x) o de atrás hacia delante (eje y). Un orificio en la parte central de la platina permite el paso de la luz que atraviesa la muestra. • Los tomillos de enfoque permiten regular la distancia entre el preparado y los ob­ jetivos, a fin de enfocar la preparación y obtener una imagen nítida de la misma. Generalmente hay un tomillo macrométrico, o de enfoque grueso, y uno micrométrico, o de enfoque fino, montados

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

Je dioptrías Cabezal portaoculares

Sistema de desplazamiento de oculares

Tornillo de fijación de portaoculares

Tornillo de desplazamiento vertical del condensador

Palanca del diafragma del condensador

Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico

Tornillos de desplazamiento del carro Sistema de iluminación (diafragma de campo y filtro) J -—~ n~|~ J i 11111ii i 11 n

|5|~]

Regulador de intensidad de iluminación Esquema del m icroscopio óptico convencional.

publicación MASSON. Fotocopiar

FIG URA 2 -2

Interruptor

FIG U RA 2-3 Recorrido de los rayos luminosos en el microscopio compuesto. Al atravesar la luz, la muestra (AB), situada un poco por delante del foco del objetivo (F0bj) y las lentes del mismo, se forma una imagen real, invertida y aum entada (A ’B ’) dentro del foco del ocular (F0c). Las lentes del ocular, sobre esta imagen, forman otra final, virtual y m ás aumentada (A”B”), que percibirá el ojo del observador.

Técnicas en histología y biología celular

en un mismo eje o en ejes diferentes. En los modelos más antiguos de micros­ copios, la platina es fija y los tomillos, ubicados en la parte alta de la columna, desplazan verticalmente el tubo. En los modelos modernos, es la platina la que puede moverse en sentido ascendente o descendente; el tubo es fijo y los tomillos de enfoque están ubicados cerca de la base del microscopio. • Debajo de la platina hay soportes para el condensador, el diafragma y los filtros.

Parte óptica La parte óptica de un microscopio comprende los objetivos, los oculares, el condensador, el diafragma del condensador y el sistema de iluminación. O b je tivo s

En el revólver portaobjetivos de un MO, generalmente hay objetivos de diferentes au­ mentos: uno llamado «lupa» o «de campo», que magnifica los objetos 3,5-5 veces (3,5 X, 4X o 5X); otros de 10X y/o de 25X, uno de 40 o 45 X y, con frecuencia, un objeti­ vo de inmersión de ÍOOX. Este último no puede usarse «en seco», sino que entre su lente frontal y el cubreobjetos del preparado histológico se coloca una gota de aceite de cedro u otra sustancia con índice de refrac­ ción semejante al del vidrio. De esta manera se evitan las desviaciones por refracción de los rayos de luz al pasar del vidrio al aire, y viceversa, que quitan precisión a las imáge­ nes obtenidas con tanto aumento. Los objeti­ vos de inmersión se utilizan frecuentemente para exámenes citológicos (sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, etc.). Los objetivos son piezas constituidas por sistemas de lentes convergentes, corregidas para las aberracio­ nes cromática y esférica. La aberración cromática se debe a que la luz visible está compuesta por una infinidad de radiaciones, las cuales sufren una des­ viación desigual debido a que la longitud de onda depende del índice de refracción del material. Además, la distancia focal depende también del índice de refracción. Por consi­ guiente, la distancia focal será diferente para

los distintos colores. Se forman así una serie de imágenes a diferentes distancias de la len­ te, una por cada color incidente. Para corregir este defecto, se colocan dos lentes adosadas, de modo tal que el conjunto tenga la misma dis­ tancia focal para dos colores. Este sistema de lentes se denomina «acromático». Se em­ plea vidrioflint (silicato de potasio y cromo) y vidrio crown (silicato de potasio y calcio). La aberración esférica se produce porque los rayos marginales que van a incidir en una lente de gran apertura se refractan más que los centrales. En consecuencia, se forman una serie de focos del mismo objeto sobre el eje principal, con lo que se logra una imagen borrosa. Esta aberración se puede corregir de diferentes maneras; por ejemplo, colocando un diafragma contra la lente, de modo que solo permita el paso de los rayos centrales, o bien adosando dos o tres lentes: una lente biconvexa convergente de gran índice de re­ fracción (vidrio flint) con una lente cóncava divergente (vidrio crown). En conjunto, estas lentes funcionan como si se tratara de una convergente, a la que se denomina «aplanática». La utilidad del MO reside en su capa­ cidad de magnificación y en su límite de resolución. La magnificación depende del aumento que proporcionan las lentes de los objetivos y los oculares; entre ambos pueden aumentar la imagen 1.000 o 1.500 veces. El límite de resolución (es decir, la capacidad para producir imágenes separadas de objetos que se encuentran muy próximos) depende no solo del sistema óptico (p. ej., su apertura numérica [AN]) sino también de la longitud de onda de la luz (A). Se calcula mediante la fórmula de Abbe: n x sena donde LR es el lím ite de resolución y (n X sena) se denomina «apertura numérica» (AN). La AN es la capacidad del objetivo de utilizar un mayor o menor número de rayos luminosos en la formación de la imagen mi­ croscópica (fig. 2-4). La AN de un objetivo depende del ángulo de apertura del mismo y

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

del índice de refracción (n) del medio que se interpone entre la lente frontal del objetivo y el preparado. El ángulo de apertura del objetivo es el formado por los rayos más pe­ riféricos que penetran en el sistema óptico y que contribuyen a formar la imagen de un punto cualquiera del objeto. Para los objetivos en seco, n = 1, pues hay aire entre el objetivo y el preparado. Cuando se realiza una observación con lente de inmersión se usa aceite de cedro, cuyo n = 1,515; esto explica que la AN de las lentes de inmersión sea sensiblemente mayor. El límite de resolución de una lente es inversamente proporcional a su AN y direc­ tamente proporcional a la longitud de onda, que en la luz visible va desde 0,4 a 0,7 |xm, del violeta al rojo. Es decir, que cuanto mayor sea la AN del objetivo y menor sea la longi­ tud de onda de la luz utilizada, menor será el límite de resolución. Con una luz que tenga una longitud de onda de 0,45 |xm, obtenida a partir de la luz blanca que pase por un filtro verde, y con ob­ jetivos y condensadores adecuados, el límite de resolución máximo que puede alcanzar el MO es de en tomo a 0,2 (xm Este es un

límite teórico máximo, que generalmente no se alcanza en condiciones normales de trabajo. En la práctica, las estructuras más pequeñas que pueden distinguirse con un MO son las bacterias y las mitocondrias, de una longitud de 1 |xm y un diámetro de 0,4-0,5 [xm, aproximadamente. Por supuesto, deben estar contrastadas apropiadamente, y solo se distingue su forma, no sus detalles. Usando lentes más potentes o proyectando la imagen en una pantalla, se podría incre­ mentar el aumento, pero no se mejoraría el límite de resolución (es lo que se denomina «aumento vacío»). Los objetivos están recubiertos por cilin­ dros metálicos, en los cuales están inscritos sus valores de aumento y AN (fig. 2-5); por ejemplo, 45 X indica la magnificación (aumenta el objeto 45 veces), y 0,65, la AN. Esos valores pueden aparecer juntos: 45x/0,65. En un objetivo de inmersión, esa inscripción sería, por ejemplo, 100x/l,35 oil (oil, «aceite»). También se indica en los

xxxxx PLAN APO 40 '0 65 Oil

1

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__ 2 3

1

____ 5

J

-----6 i---- 7

\3

F IG U R A 2-4 L a apertura num érica d e un objetivo se expresa en función d e la longitud de onda d e la luz em pleada y el semiángulo de apertura del objetivo (a) form ado p o r el cono de luz q ue p enetra en el mismo. En la figura se representa el citado cono, tras atravesar la preparación y penetrar luego en el sistema de lentes del objetivo.

F IG U R A 2-5 D ibujo esquem ático de un objetivo planapocrom ático visto por el exterior y en sección longitudinal, en el que se muestran los grupos de lentes de los que se compone, así como las inscripciones que suelen incluirse e n los objetivos. 1, rosca de fijación; 2, nombre del fabricante; 3, correcciones ópticas (campo plano y tipo apocromático); 4, aumento, apertura numé­ rica y medio de inmersión; 5, especial para microscopía de interferencia (interferencia o contraste diferencial [DIC]); 6, longitud del tubo, grosor recom endado del cubreobjetos, distancia d e trabajo (WD, working dis­ tance); 7, anillo de color según código del fabricante (aumento, tipo de medio de inmersión).

Técnicas en histología y biología celular

objetivos si son apropiados para la observa­ ción de preparados sin cubrir o si se requiere, necesariamente, emplear el cubreobjetos. En este último caso, aparece grabado un número, generalmente 0,17, que significa que el objetivo debe usarse con preparados provistos de cubreobjetos (de 0,17 mm de espesor). La cifra 160 que aparece en algu­ nos objetivos indica la longitud del tubo, en milímetros, en microscopios de modelos clásicos. Corresponde a la distancia entre el plano de observación y la superficie de atornillado del objetivo. La profundidad de campo es la propiedad de un objetivo que permite ver varios planos del preparado histológico con una misma posición de enfoque. El poder de definición es la capacidad de un objetivo para formar imágenes de contornos nítidos. Los objetivos forman una imagen aumentada, real e inver­ tida, del objeto examinado, situado un poco más allá de su foco. Teniendo en cuenta las características ex­ plicadas anteriormente, los objetivos pueden clasificarse en diferentes tipos, circunstancia que se debe considerar antes de adquirir un microscopio. La elección de uno o de otro dependerá del uso que se le quiera dar y del presupuesto económico del que se disponga. A continuación, se describen las distintas clases de objetivos: • Acrom áticos: son los objetivos más sencillos y, por tanto, de más bajo coste; están destinados a usos no profesionales. Presentan corrección de la aberración es­ férica solamente para el color verde y dan ligeros halos por rayos de longitud de onda intermedia rojo-azul. Si se emplea un filtro de color verde en el microscopio, las imágenes capturadas en blanco y ne­ gro serán de mejor calidad. • Semiapocromáticos: a diferencia de los anteriores, sus lentes son de fluorita en vez de cristal, por lo cual presentan mayores correcciones frente a las abe­ rraciones ópticas. Así, están corregidos cromáticamente para el rojo y el verde, y presentan corrección esférica para el azul y el verde, por lo que dan mejores resultados que los anteriores para la foto­ grafía en color.

• Apocromáticos: presentan correcciones más completas que los anteriores, lo cual encarece sensiblemente su precio, dado que dichas correcciones se consiguen in­ crementando el número de elementos ópti­ cos que montan en su interior. Igualmente, su elevado grado de corrección implica un importante aumento en la AN, lo cual redunda en un mayor poder de resolución. Cualquiera de estos tres tipos de objetivos, sobre todo los apocromáticos, ofrece una li­ gera curvatura del campo de observación, la cual se puede corregir con la adición de los correspondientes elementos ópticos al ob­ jetivo. Se obtienen, así, objetivos planacromáticos, plansemiapocromáticos y planapocromáticos, de los cuales son estos últimos los de mayor calidad y precio y, por tanto, los de elección en el campo profesional y de investigación. Además de los tipos de objetivos mencio­ nados, existen otros especiales para su empleo con diferentes modalidades de observación; se puede decir que cada fabricante ofrece un tipo de objetivo diferente para cada caso en concreto. Así, por ejemplo, los de tipo Pol son adecuados para la observación con luz polarizada, y los Ph se emplean en micros­ copía de contraste de fases y están provistos de un anillo de fase complementario, que se ubica en el condensador. Finalmente, los de tipo Fluar son los más utilizados en micros­ copía de fluorescencia, por su corrección es­ pecífica para el rango de longitudes de onda de la radiación empleada en este caso. O cu la re s

El ocular es la lente que recoge la imagen dada por el objetivo, a partir de la cual origina otra aumentada, virtual y derecha. Al igual que un objetivo, está recubierto por un cilin­ dro metálico y tiene grabado el aumento que proporciona. El ocular está formado por un sistema de lentes, entre las que destacan la inferior de campo (o colectora) y la superior (u ocular), que actúa como una lupa. Existen diferentes tipos de oculares: • Ocular de Huygens o negativo: dos len­ tes planoconvexas separadas por un dia­ fragma.

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

• Ocular de Ramsden o positivo: dos lentes planoconvexas y un diafragma situado por encima de ellas. • Ocular de compensación: corrige la abe­ rración cromática restante de los objeti­ vos apocromáticos. • Oculares aplanáticos, ortoscópicos y periscópicos: proporcionan campos am­ plios, corregidos del abombamiento que producen los objetivos muy potentes. • Ocular de proyección: es el que proyecta la imagen hacia la cámara fotográfica o de vídeo. En los MO binoculares la separación entre los oculares puede regularse, de forma que se adecúe a la distancia interpupilar del operador. Los MO pueden estar provistos de sistemas para observación doble o múltiple (permiten que dos o más personas observen simultáneamente la preparación m icros­ cópica). La imagen final del MO, proporcionada por el efecto combinado de objetivos y ocu­ lares, es aumentada, invertida y virtual. El aumento final que proporciona un MO puede calcularse multiplicando la magnificación del objetivo utilizado por la del ocular. Si se utilizan oculares de 10X, con objetivo de 3,5X, los objetos se verán aumentados 35 veces; con objetivo de 10X, 100 veces; con objetivo de 45 X, 450 veces, y con objetivo de 100X, 1.000 veces, y se llega a un aumen­ to de 1.600 veces si los oculares utilizados son de 16X. Las combinaciones de oculares/objetivos adecuadas son aquellas que están dentro del rango de aumento útil (v. «Actividades» en «Recursos online»). C o n d en sa d o r

El condensador de tipo Abbe está constituido por un sistema de lentes convergentes ubi­ cadas en un soporte metálico. Su función es concentrar los rayos luminosos y proyectar­ los sobre el preparado a través del orificio que posee la platina. Generalmente el con­ densador tiene posibilidades de movimiento en sentido vertical. Para observaciones con objetivos de gran aumento, se requiere que el condensador esté cerca de la platina, de modo

que concentre la luz sobre la pequeña porción de la muestra que está siendo magnificada. Por el contrario, al trabajar con bajo aumento, conviene retirar (bajar) el condensador, para obtener una iluminación pareja en todo el campo observado. Diafragma

El diafragma iris, o diafragma de apertura, se encuentra debajo del condensador. Gradúa la cantidad de rayos luminosos que llegan al objeto. Para observar preparaciones sin teñir o escasamente contrastadas, suele ser conveniente cerrar el paso de la luz un poco más de lo habitual, a fin de incrementar el contraste. Sistem a d e ilum inación

El sistema o aparato de iluminación de un MO se sitúa debajo de la platina. Consta de fuente de luz, espejo, filtros y diafragma. La fuente de luz puede ser natural o artificial. La artificial puede ser independiente del mi­ croscopio o bien estar incorporada al pie del mismo. En este último caso, puede contar con una lente colectora y con un diafragma de campo que regula el paso de los rayos; es posible variar la intensidad lumínica. Si la fuente de luz es independiente del MO, este debe tener un espejo que dirija los rayos hacia el eje óptico y en forma paralela a él; ese espejo puede moverse para orientarlo de la manera más conveniente. El espejo tiene generalmente dos caras, una plana y una cóncava. Esta última se emplea cuando se trabaja sin condensador, con una fuente luminosa natural o con objetivos de bajo au­ mento. En cambio, la cara plana es utilizada cuando la fuente de luz es artificial y cuando se usa condensador. Filtros

Los filtro s de luz se colocan en los aros portafiltros que están situados debajo del condensador. Son cristales coloreados que dejan pasar radiaciones con una longitud de onda determinada y absorben las restantes. Una iluminación correcta de la muestra es fundamental para una buena observación, más aún si se realizan tomas fotográficas o filmaciones. La maniobra conocida como

Técnicas en histología y biología celular

«iluminación Koehler» es adecuada para ello. Consiste en: a) cerrar completamente el dia­ fragma de campo; b) mover el condensador hasta que los bordes de dicho diafragma aparezcan bien nítidos (observando por el ocular); c) centrar el condensador con los tomillitos laterales provistos para este fin, en la subplatina; d) abrir el diafragma de campo hasta que cubra todo el campo observado, para evitar la iluminación dispersa, que per­ judicaría el contraste, ye ) regular el diafrag­ ma de apertura del condensador hasta lograr un contraste y una resolución óptimos. Esta última maniobra puede hacerse retirando el ocular y observando el círculo luminoso for­ mado en el plano focal del ocular. En general, para la observación de preparaciones teñidas conviene cerrar el diafragma de apertura has­ ta cubrir aproximadamente el 80% de la AN del objetivo. A partir del MO común, se han desarro­ llado una serie de microscopios especiales con características particulares, que se co­ mentan brevemente a continuación.

M ICROSCOPIOS ESPECIALES A continuación, se describen los tipos de MO más utilizados en biología. Cada uno de ellos aporta una información diferente pero parcial sobre las características de la muestra, por lo que, en muchos casos, es interesante la utilización complementaria de diferentes tipos de microscopios para lograr un conocimiento lo más completo posible de las estructuras. En la figura 2-6 se ilustran los resultados obtenidos de esta forma sobre un mismo tipo de material.

transmitida o incidente. En el primer caso, la parte central del rayo de luz queda oclui­ da por una lámina circular colocada en su trayectoria, antes de atravesar la muestra, de tal manera que esta queda oblicuamente iluminada (fig. 2-7A). Los objetos pequeños aparecen brillantes sobre un fondo oscuro o bien con un curioso efecto de bajorrelieve (v. fig. 2-6B, D, F). Esta iluminación puede conseguirse colocando un filtro opaco circu­ lar dentro del condensador del microscopio. En función del diámetro del filtro, así como del aumento del objetivo y de la AN de este, se pueden conseguir efectos más o menos marcados. El segundo tipo de iluminación o inci­ dente necesita de un condensador especial provisto de una superficie central en forma de parábola que refleja lateral y periféricamente la luz hacia un espejo, con la inclinación su­ ficiente para enviar un cono de luz hacia la muestra. Estos condensadores proporcionan una mayor intensidad de iluminación que los convencionales, permitiendo así la observa­ ción a gran aumento. Normalmente, se usa la microscopía de fondo oscuro para la observación de células vivas y móviles, como bacterias y esperma­ tozoides. Si bien el límite de resolución no es mayor que en un MO de campo claro, el contraste logrado puede mejorar significa­ tivamente la visualización de pequeñas es­ tructuras, por lo que resulta muy útil para observar bacterias o ciertos detalles de célu­ las eucariotas. Por ejemplo, una célula de un cultivo puede mostrar brillantes el nucléolo, la envoltura, las mitocondrias y las gotitas de lípidos, que se destacan sobre el fondo oscuro del citoplasma.

Microscopio de campo oscuro Es un MO que cuenta con un condensador especial que dirige los rayos luminosos des­ de la parte lateral, de manera que ilumina la muestra oblicuamente. Las lentes del micros­ copio reciben solo la luz dispersada por los diferentes componentes celulares (fenómeno Tyndall), por lo que las estructuras celulares aparecen brillantes, contra un fondo oscuro. La ilum inación en campo oscuro se puede realizar de dos maneras diferentes:

Microscopio de contraste de fases El m icroscopio de co n traste de fases (fig. 2-7B) se basa en la existencia de pe­ queñas diferencias en el índice de refracción en distintas partes de cada célula y tejido; cuando la luz pasa por regiones de mayor índice de refracción, experimenta un retardo o deflexión y queda fuera de fase con res­ pecto al haz principal de las ondas de luz. Estas diferencias de refracción no resultan

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

3 publicación MASSON. Fotocopiar:

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FIG U RA 2 -6 Aspecto de la m isma preparación, sección transversal de una hoja de maíz, observada con diferentes tipos de microscopía. A ) Campo claro: epidermis del haz y envés de la hoja, el parénquima asimilador del mesófilo y dos haces vasculares rodeados por grandes células de parénquima (vaina del haz). B) Campo oscuro con iluminación transm itida a través de un filtro opaco: los contornos d e las células resaltan sobre el fondo oscuro. C ) interferencia (interferencia o contraste diferencial [DIC]): brillantes estructuras birrefringentes y con efecto d e bajorrelieve los orgánulos intracelulares (cloroplastos). D ) Fluorescencia: cloroplastos de las células del parénquima y la cutícula de las células epidérmicas en color rojo por autofluorescencia de las mismas. E) Contraste de fases: aunque la preparación está teñida, se observan los contornos de algunas estructuras con marcados halos en tom o a ellas. F ) polarización: resaltan las estructuras birrefringentes (paredes celulares epidérmicas y vainas d e los haces vasculares, así como elementos del xilema).

evidentes con el MO común, pero el micros­ copio de contraste de fase las amplifica, con lo que hace que su intensidad sea visible, de manera que las preparaciones citológicas e histológicas puedan ser observadas sin nece­

sidad de tinción. Para ello, este microscopio cuenta con una iluminación anular, debido a un diafragma con anillo de luz ubicado en el condensador. Este anillo de luz se cubre exactamente con uno de fase, que se halla

Técnicas en histología y biología celular

A

B

C

FIGURA 2-7 A) Esquema del funcionamiento de un microscopio de campo oscuro con iluminación transmitida. Los rayos de luz procedentes de la fuente de iluminación son parcialmente interrumpidos por un filtro opaco (F) que se coloca por debajo de las lentes del condensador (L). De aquí parte un cono de luz (C), que atravesará oblicuamente la m uestra (M) antes de penetrar en el objetivo (O) para formar la imagen observada. B) Marcha de los rayos luminosos en el m icroscopio d e contraste de fases. C, condensador; DA, diafragm a anular; E, espécimen; O, objetivo; PF, placa de fases. C) M archa de los rayos luminosos en el microscopio de interferencia. A, analizador; C, condensador; E, espécimen; O, objetivo; P, polarizador; W, Wollaston.

en el objetivo. Por interferencia entre los rayos de luz provenientes de las diferentes regiones del objeto y aquellos influidos por el anillo de fase, se logran imágenes dife­ renciadas que no se podrían ver en un MO de luz incidente uniforme. Debido a sus particulares características, este microscopio permite observar células y tejidos sin necesidad de teñirlos, por lo cual es muy útil cuando interesa conocer sus es­ tructuras in vivo, sin los eventuales artefactos provocados por las técnicas convencionales de preparación de las muestras.

Microscopio de interferencia Una modificación del microscopio de con­ traste de fases es el microscopio de inter­ ferencia o de contraste diferencial (DIC, differential-interference contrast), desa­ rrollado por G. Nomarski (fig. 2-7C). Este utiliza el sistema óptico en el cual la luz se divide en dos haces: uno que atraviesa la muestra, y otro que pasa lateralmente y es tomado como referencia. Luego estos haces vuelven a unirse e interfieren entre sí. Para conseguir este efecto se utilizan dos tipos de accesorios: en primer lugar, un polarizador

y un analizador, colocados, respectivamente, en el condensador y sobre el plano de los objetivos, como en el microscopio de pola­ rización, y, en segundo lugar, también loca­ lizados en el condensador y sobre cada uno de los objetivos, dos prismas birrefringentes (Wollaston), los cuales producen el desdobla­ miento del rayo de luz incidente y la pos­ terior interferencia de ambos tras atravesar la preparación, lo que produce un caracterís­ tico efecto de bajorrelieve y alto contraste. Esto unido al empleo de la luz polarizada y las diferencias de fase hace que la imagen ofrezca, además, determinados colores de in­ terferencia según los índices de refracción de sus componentes. Este tipo de microscopio presenta ciertas ventajas frente al de con­ traste de fases, tales como el poder trabajar con muestras de mayor grosor y la ausencia de halos en las imágenes. Ello ha hecho que se convierta en una eficaz herramienta en el estudio de muestras sin colorear, como las procedentes de cultivos celulares.

Microscopio de polarización Este microscopio usa luz polarizada —luz que vibra en un solo plano— para iluminar la

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

muestra. Permite diferenciar detalles debido a las características de las estructuras isotrópicas y anisotrópicas. El microscopio de polarización posee un prisma polarizador de la luz (nicol o polaroid), que solo deja pasar luz polarizada hacia la muestra. Otro filtro, analizador, se coloca por encima de la muestra. Ambos filtros pueden orientarse, de manera que, si sus secciones principales se cortan perpendicularmente, la luz que atraviese el polarizador no pasará a través del analizador (fig. 2-8). Cuando se obser­ van materiales celulares o tisulares llamados «isotrópicos», los cuales tienen el mismo ín­ dice de refracción en todas direcciones (de manera que no modifican la luz polarizada que los atraviesa, cualquiera que sea el plano de incidencia), se ven oscuros. Por el con­ trario, las estructuras anisotrópicas, como las sustancias cristalinas y las moléculas fibrosas orientadas en forma ordenada, modifican

el plano de la luz polarizada (la velocidad de propagación de la misma varía según la dirección que se considere) y envían rayos luminosos a través del analizador. Estas es­ tructuras aparecen brillantes, con colores que se deben, principalmente, a las interferencias producidas por diferencias en el espesor de las preparaciones. Los materiales anisótropos se denominan también «birrefringentes», porque tienen dos índices de refracción dis­ tintos, de acuerdo a la dirección de incidencia de la luz. Este tipo de microscopio permite estudiar tejidos duros (p. ej., hueso, diente, órganos vegetales lignificados), estructuras que ten­ gan simetría lineal (p. ej., tejido muscular, fibras de algodón) y la presencia o deposición de colágeno. Los MO modernos más completos vienen provistos de un condensador universal, que permite pasar de la microscopía de campo

POLARIZADOR (plano de polarización (plano de polarización

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publicación MASSON. Fotocopiar:

POLARIZADOR (Dlano de Dolarización (plano polarización ANALIZADOR vertical) (plano de polarización : natural ^ ^ - 1 horizontal)

POLARIZADOR (plano de polarización SUSTANCIAACrlvA vertical) .(para el, plano , -■""I de polarización) , , (plano de polarización (Pl horizontal) Solo para la

FIGURA 2 -8

M archa de los rayos luminosos a través del analizador y del polarizador.

Técnicas en histología y biología celular

claro a la de campo oscuro o de contraste de fases. Pueden tener también accesorios con dispositivos para la observación con luz polarizada, para interferencia (DIC) y, en algunos casos, también para epifluorescencia.

el recipiente en que están creciendo, sea este un frasco o una cápsula de Petri individual o múltiple. También se usa para observar y manipular gametos o embriones vivos in vitro, en técnicas de fecundación asistida.

Microscopios invertidos

Microscopio de fluorescencia

En los microscopios invertidos el revólver portaobjetivos se ubica debajo de la platina, y el sistema de iluminación y condensador, por encima de la misma (fig. 2-9). Esto permite contar con una amplia distancia de trabajo y poder observar células creciendo en medios de cultivo de varios milímetros de espesor. Generalmente se emplea la observación de contraste de fases o de interferencia diferen­ cial. También puede disponer de una lámpara de fluorescencia y de los correspondientes fil­ tros de excitación para realizar observaciones sobre células vivas a diferentes intervalos de tiempo (time lapse). Existe, igualmente, la posibilidad de adaptar al microscopio toda una gama de accesorios orientados a la micromanipulación y obtención de diminutas porciones de la muestra. Tal es el caso de la microdisección por captura láser (LCM, laser capture microdissection), la cual per­ mite el posterior análisis de biomoléculas procedentes del material extraído. Otra apli­ cación de este tipo de microscopio sería el control periódico de los cultivos celulares en

Este tipo de microscopio permite detectar moléculas que se vuelven fluorescentes, es decir, que absorben luz de determinada lon­ gitud de onda y reemiten luz de una longitud de onda mayor (fig. 2-10). El microscopio de fluorescencia se carac­ teriza por poseer una fuente de luz de gran intensidad y dos sistemas de filtros. Uno de estos sistemas filtra la luz antes de que alcan­ ce la muestra, de modo que deja pasar solo la longitud de onda que excita las moléculas fluorescentes que se quieren visualizar. La muestra es visualizada a través del segun­ do sistema de filtros, que deja pasar solo la longitud de onda correspondiente a la luz reemitida por los componentes fluorescentes. De esta manera, las estructuras fluorescentes aparecen luminosas y brillantes, y resaltan sobre un fondo oscuro. Como fuente de luz puede utilizarse luz visible, de longitud de onda corta, o bien ultravioleta, lo que permite detectar molé­ culas que absorben dicho tipo de luz y se vuelven fluorescentes, con lo que emitirán

F IG U R A 2-9 M icroscopio invertido, con sistema de m icromanipulación sobre la platina, controlado con las dos palancas de m ando que aparecen a ambos lados del mismo. (Imagen cedida p o r Leica-Microsystems.)

F IG U R A 2-10 Microscopio de fluorescencia, prepa­ rado también para interferencia o contraste diferencial (DIC) y con m otorización d e la platina en Z. (Imagen cedida p o r Leica-Microsystems.)

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

una luminosidad que se encontrará dentro del espectro visible. Con este tipo de mi­ croscopio pueden revelarse fluorescentes naturales (moléculas autofluorescentes o fluorocromos endógenos), como la vitami­ na A o la clorofila. Sin embargo, con mayor frecuencia se utiliza para detectar, en células o tejidos, la presencia de proteínas u otro tipo de moléculas a las que previamente se haya acoplado un colorante fluorescente (fluorocromo) agregado a la preparación, de manera que adquieran una fluorescencia inducida o exógena (fluorescencia secundaria). Las técnicas de inmunofluorescencia, que pro­ porcionan gran especificidad y sensibilidad en la detección de moléculas en células y tejidos, se basan en la utilización de anti­ cuerpos unidos a colorantes fluorescentes. En un mismo preparado pueden utilizarse dos o más fluorocromos, como, por ejemplo, la fluoresceína y la rodamina, que se vuelven fluorescentes con distinto color (verde y rojo, respectivamente). Los colorantes fluorescentes se pueden inyectar en células vivas para estudiar cam­ bios en la localización y la concentración de moléculas específicas en el interior celular.

Las imágenes obtenidas son también pare­ cidas a las del microscopio de fluorescencia, con las estructuras marcadas, brillantes sobre un fondo oscuro.

Microscopio láser confocal Es un sistema de microscopía que permite obtener imágenes de excelente definición y de una resolución un 30% superior a la de un MO común en la observación de objetos complejos tridimensionales (p. ej., células enteras), aunque también puede emplearse para cortes de tejidos. El microscopio confocal combina partes de un MO, al que se adapta un equipo fluores­ cente, con un sistema de barrido, en el que se emplea un rayo láser. Su fundamento y la marcha de los rayos puede resumirse como sigue, según se expüca en la figura 2-11: el rayo láser (a), fuertemente convergente, sale de un emisor L y, seguidamente, pasa por una delgada apertura confocal (AC) y un fil­ tro de excitación (FEX). A continuación, es reflejado por un espejo dicroico (ED), que

Microscopio de luz ultravioleta

publicación MASSON. Fotocopiar:

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Usa exclusivamente una fuente de luz ultravioleta para atravesar la muestra, lo que permite registrar fotográficamente los detalies del material biológico, en función del diferente grado de absorción de la luz de esa longitud de onda por parte de los componentes tisulares y celulares. Esta metodología es particularmente útil para detectar de manera específica la presencia de distintos tipos de moléculas (en especial ácidos nucleicos) en las células. La visualization solo puede rea­ lizarse a partir de fotografías, ya que la luz ultravioleta no es visible y daña la retina. Dada la pequeña longitud de onda de la luz ultravioleta, el límite de resolución de este tipo de microscopio es ligeramente superior al de los otros tipos de MO. Su diseño es muy similar al de fluorescencia, con una fuente de luz a base de una lámpara de arco de mercurio o xenón, filtros, objetivos y espejos con un revestimiento especial de aluminio.

FIGURA 2-11 E squem a general del m icroscopio confocal, con la marcha de los rayos luminosos a través del mismo. AC, apertura confocal; ED, espejo dicroico; F, fotomultiplicador; FEM, filtro de emisión; FEX, filtro de excitación; FP, plano fuera d e foco; LO, lente del objetivo; M, muestra; PF, plano a foco.

Técnicas en histología y biología celular

FIGURA 2-1 2 M icroscopio confocal. Puede ser directo o invertido y se acompaña de m esa de trabajo con los controles manuales y m onitor para visualizar las imágenes e interactuar con las aplicaciones informáticas de manejo del aparato. (Imagen cedida p o r Leica-Microsystems.)

lo dirige hacia el objetivo del microscopio (LO, trayectoria b) y este, a su vez, hacia un plano a foco de la muestra (PF, M), según la trayectoria c. La fluorescencia emitida por este plano seguirá la misma trayectoria de vuelta (d, e, f), atravesará de nuevo el ob­ jetivo y el espejo, y penetrará por un filtro de emisión (FEM) y, justamente, por una segunda AC hasta un fotomultiplicador (F), que detectará la fluorescencia y generará una imagen visible en un monitor de alta reso­ lución. La información procedente de otros planos de la muestra fuera de foco (FP) no conseguirá atravesar la segunda AC y, por tanto, no formará una imagen visible, por lo que será eliminada (v. fig. 2-11, línea en­ trecortada verde). El usuario puede elegir el plano de la muestra a foco, moviendo el rayo láser mediante un sistema de espejos y, finalmente, con ayuda del software del microscopio, mostrar cada plano («sección

óptica» de aproximadamente 1 (xm) o bien la suma de varios planos a diferentes profundi­ dades, como una reconstrucción tridimensio­ nal del espesor observado. También mediante la misma aplicación informática se puede rotar y observar dicha reconstrucción, ya sea entera o en corte, en cualquier orientación que se desee. Este microscopio permite detectar com­ puestos autofluorescentes o inmunomarcados, y es posible captar hasta tres fluorocromos diferentes en forma simultánea. Los datos proporcionados permiten realizar análisis morfométricos, estudios de electrofisiología, etc. Hay modelos de microscopios confocales convencionales e invertidos (fig. 2-12). Remitimos al lector al capítulo 8, en el cual podrá encontrar una descripción deta­ llada de los fundamentos, de las caracterís­ ticas y de las aplicaciones del microscopio confocal.

Capítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

Actividades t. Se le ha encargado la compra de un objetivo y un ocular para un microscopio óptico convencional, con el fin de poder vi­ sualizar con detalle un espécimen a 2 5 0 X . El profesor de Histología Aplicada comentó en clase que debemos ser cuidadosos al elegir las combinaciones adecuadas de objetivo/ocular, para así poder asegurar un aumento óptimo sin introducir artefactos in­ necesarios. También sabemos que el rango de aumento útil para una combinación ob­ jetivo/ocular viene definido por la apertura numérica (AN) del sistema, de modo que se establece un mínimo y un máximo de aumentos para una AN dada (5 0 0 -1 .0 0 0 X ANobjet¡vo); elegir aumentos mayores de este valor no nos proporcionará información adicional útil o una resolución y un detalle mayores de la muestra, por lo que se deno­ minan «aumentos vacíos».

En el pasillo de «Accesorios para mi­ croscopios», del Hipermercado de Técni­ cas Histológicas, encuentra un estante de objetivos y otro de oculares con las ins­ cripciones indicadas a continuación: Objetivos [aumento y AN]: 2 , 5 X (0 ,0 8 ); 4 X (0 ,1 2 ); 1 0 X (0 ,35); 2 5 X (0,55); 4 0 X (0,7); 6 0 x (0,95); 1 0 0 X (1,42)

Oculares [aumento]: 10 X ; 1 2 ,5 X ; 1 5 X ;2 0 X ; 2 5 X

a. ¿Qué combinación o combinaciones objetivo/ocular elegiría para observar su espécimen a 2 5 0 X ? ¿Por qué? b. Construya una tabla para indicar las posibles combinaciones objetivo/ocular válidas para el rango de aumento útil.

AUTOEVALUACIÓN

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1. ¿Qué características tiene la imagen ofre­ cida por un microscopio óptico? a. Es virtual. b. Es virtual, invertida y aumentada. c. Es invertida y aumentada. d. Es directa. e. Es virtual, directa y aumentada. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la imagen observada es invertida (objetivo), virtual (ocular) y aumentada (ocular y objetivo). 2. ¿De qué parte del microscopio depende el poder de resolución del mismo? a. De la longitud del tubo. b. Del condensador c. Del ocular. d. Del diafragma de apertura. e. Del objetivo. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: depende del objetivo, responsable de la apertura numérica, de la cual depende, a su vez, el poder de resolución. 3. ¿Cuál de estas características es aplicable a la microscopía de campo oscuro?

a. La luz norm alm ente atraviesa la muestra. b. El rayo incidente de luz de divide es dos antes de llegar a la muestra. c. La luz incide oblicuamente sobre la muestra. d. El rayo de luz experimenta un retardo al atravesar la muestra. e. Emplea filtros polarizadores cruza­ dos, para conseguir el campo oscuro. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la luz, tras atravesar un filtro opaco colocado en el condensador, incide oblicuamente sobre la muestra. 4. ¿Qué accesorios se colocan en un micros­ copio de interferencia? a. Filtros de interferencia. b. Anillos de fase. c. Prismas birrefringentes. d. Filtros degradados. e. Sistema de iluminación para campo oscuro. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: se colocan prismas birrefringentes (Wollaston), que provocan el

34.e2

desdoblamiento en dos del rayo de luz inci­ dente y la posterior interferencia de ambos. 5. ¿Qué tipo de tejido se podría identificar con microscopía de polarización? a. Lignificado. b. Nervioso. c. Sangre. d. Adiposo, con un tratamiento previo. e. Muscular. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: se podrían iden­ tificar los tejidos vegetales cuyas células contienen lignina como componente de su pared celular. 6. Además del microscopio de polarización, ¿qué otro tipo incluye filtros polarizadores? a. Confocal. b. De interferencia. c. De contraste de fases. d. De campo oscuro. e. De fluorescencia. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el microscopio de interferencia incluye un polarizador y un ana­ lizador, colocados en las mismas posiciones que en el de polarización. 7. ¿Qué tipo de microscopio se utilizaría para observar un cultivo celular en placa? a. El de contraste de fases. b. El de interferencia. c. El de fluorescencia. d. El invertido e. El confocal. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: el m icroscopio invertido, debido a su diseño, perm ite la colocación de una muestra grande (placa de Petri) sobre la platina. 8. ¿Qué tipo de microscopio óptico tiene mayor poder de resolución? a. El de polarización. b. El ultravioleta. c. El invertido. d. El de interferencia. e. El de fluorescencia. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el microscopio ul­ travioleta es el que tiene mayor poder de resolución, dada la longitud de onda de la radiación utilizada, menor que la de la luz normal usada en el resto de microscopios.

Técnicas en histología y biología celular

Este valor interviene en la fórmula para el cálculo del poder de resolución. 9. ¿Q ué m icroscopio perm ite realizar reconstrucciones tridimensionales del material observado? a. El invertido. b. El de contraste de fases. c. El de polarización. d. El confocal. e. El de interferencia. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: el m icroscopio confocal permite apilar distintos planos de la muestra mediante un software que lleva incorporado, lo que da, por tanto, una imagen en profundidad de la misma. 10. ¿Qué accesorios se colocan habitualmen­ te en un microscopio de fluorescencia? a. Filtro de emisión. b. Wollaston. c. Polarizadores. d. Sistema de iluminación anular. e. Condensador parabólico. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: se coloca un filtro de emisión, que deja pasar solo la longitud de onda correspondiente a la luz reemitida por los componentes fluorescentes de la muestra. 11 .Un amigo nos ha traído un microscopio que encontró en el desván de casa. Des­ pués de examinarlo y limpiarlo cuidado­ samente para comprobar que no le faltaba ninguna pieza esencial, hemos observado con él una preparación microscópica y en principio parece que funciona correcta­ mente. No obstante, tras fijamos con más atención, apreciamos que la parte central del campo observado aparece más nítida que la periferia del mismo. ¿A qué podría deberse esta anomalía? a. Algún objetivo está sucio por los bordes de la lente frontal. b. El diafragma de apertura está dema­ siado abierto. c. Las lentes del objetivo no están co­ rregidas para la aberración esférica. d. Hay suciedad acumulada en el inte­ rior del tubo del microscopio. e. Hay alguna imperfección en las lentes oculares. Respuesta correcta: c.

C apítulo | 2 Microscopio óptico: fundamentos y tipos

Respuesta razonada: el defecto observado (porción periférica del campo del micros­ copio borrosa) se debe a la aberración es­ férica presente en las lentes, que no cuentan con una adecuada corrección. 12. Necesitamos realizar una observación de un preparado en el cual el colorante no ha funcionado correctamente y la mues­ tra aparece casi transparente. Si solo disponemos de un microscopio óptico convencional, ¿se podría realizar alguna operación con el mismo para poder iden­ tificar las estructuras de la muestra? a. No. Se necesitaría un microscopio de contraste de fases o de interferencia. b. Habría que cerrar el diafragma de apertura. c. Sería necesario desplazar hacia abajo el condensador. d . Se debería disminuir la intensidad de la iluminación y utilizar un objetivo de bajo aumento. e. Habría que cerrar el diafragma de campo en la base del microscopio. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el cierre paulatino del diafragma de apertura del condensador consigue un aumento creciente en el con­ traste de la imagen observada. Por tanto, se debería cerrar el diafragma hasta conseguir el efecto deseado. 13. Después de estudiar una preparación, se han realizado algunas fotomicrogra­ fías de diferentes zonas de interés de la misma. Posteriormente, al examinarlas detenidamente, apreciamos que aparece una zona más oscura en los ángulos de todas las fotomicrografías. ¿A qué podría deberse este defecto? a. No se ha llevado a cabo una correcta alineación previa de la iluminación del microscopio. b. Algún objeto se ha interpuesto en la marcha de los rayos luminosos que atravesaron la preparación. c. El sensor de la cámara fotográfica está parcialmente dañado. d. El diafragma de apertura estaba de­ masiado cerrado. e . No se colocó correctamente la cámara fotográfica digital en su lugar.

34.e3

Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la correcta alinea­ ción de la iluminación del microscopio (pro­ cedimiento de Koehler) permite que la luz llegue homogéneamente a todo el campo de observación, con lo que se evita la aparición de zonas más o menos oscuras. 14. ¿Sería posible realizar una observación en campo oscuro si solo se dispone de un microscopio óptico convencional? a. No. Es necesario un microscopio con los accesorios adecuados. b. Sería posible si se colocara un filtro opaco dentro del condensador. c. Sería posible si se realizara un mejor ajuste de la iluminación Koehler. d. Se podría si se cerrara totalmente el diafragma de apertura. e. Sería posible si se disminuyera la in­ tensidad de iluminación y se cerrara el diafragma de campo del microscopio. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: si se colocara un filtro opaco dentro del condensador, se con­ seguiría el efecto de iluminación en campo oscuro. Es necesario abrir el condensador, desenroscando la lente frontal del mismo, e introducir el filtro (puede valer una moneda del tamaño y del grosor adecuados). 15.Necesitamos identificar estructuras lignificadas, pero no disponemos de tiempo suficiente para teñir las muestras. ¿Sería posible hacerlo con algún tipo de micros­ copio? a. Es imprescindible realizar una tinción específica de la lignina. b. Se puede utilizar un microscopio de polarización. c. Habría que cerrar convenientemente el diafragma de campo. d. Sería posible si se utilizara un micros­ copio confocal. e. Se podría si se empleara un micros­ copio de campo oscuro con ilumina­ ción incidente. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la lignina es un ma­ terial birrefringente y, por tanto, aparecerá iluminada sobre un fondo oscuro cuando la preparación sea observada entre polarizadores cruzados (extinción).

34.e4

RECURSOS O NLINE Enlaces d e interés Atlas histológico interactivo de la Universidad de Jaén. http://www.ujaen.es/investiga/atlas/ Colección de vídeos sobre diferentes aparatos y técnicas de uso habitual en histología. http://virtual.ujaen.es/histologia/ Portal sobre microscopía, con numerosos tutoriales so­ bre el m anejo y el funcionam iento de los diferentes microscopios. http://micro.magnet.fsu.edu/index.html

Técnicas en histología y biología celular

Procesamiento de muestras para microscopía óptica: fijación, inclusión y microtomía Luis M ontuenga Badía, María Elena Bodegas Frías, Carlos de Andrea, Francisco José Esteban Ruiz

INTRODUCCIÓ N Cuando observamos con el microscopio una preparación histológica o realizamos estudios moleculares sobre ella, debemos poner los medios para que lo analizado se corresponda lo más ajustadamente posible a la realidad biológica; no solo hay que asegurarse de que las estructuras tisulares y las poblaciones ce­ lulares corresponden al órgano de proceden­ cia; se trata, sobre todo, de optimizar la con­ servación y la manipulación del tejido y de sus componentes moleculares para minimizar posibles artefactos. El procesamiento de toda muestra histológica conlleva la realización de una serie de pasos y protocolos cuyo objetivo final es poner de manifiesto las estructuras tisulares o moleculares de un modo lo más parecido posible a su estado in vivo. Los pasos generales que se siguen en la mayoría de los protocolos de procesamiento de una muestra son: la fijación, o procedi­ miento de conservación; la inclusión, que es un paso que facilita el corte de la pieza; la microtomía, que consiste en la obtención de cortes (secciones) lo suficientemente delga­ dos como para que puedan ser atravesados por la luz y, por tanto, observados con el microscopio, y la tinción, con la que pon­ dremos de manifiesto las estructuras de inte­ rés. Cada uno de estos pasos puede presentar variaciones particulares en función de las © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

características de la muestra biológica y de las estructuras tisulares y celulares que se van a estudiar. En este capítulo nos centraremos en los procesos de fijación, inclusión y microtomía para microscopía óptica y tratare­ mos, asimismo, las técnicas de tinción.

FIJACIÓN La necesidad de fijación de las muestras es un hecho común para todas las técnicas de microscopía y con ella se persiguen cuatro objetivos: • Detener los procesos de degradación que ocurren durante o tras la muerte celular: autólisis (por liberación de enzimas lisosómicas) y putrefacción (por la presencia de microorganismos que liberan sus en­ zimas líricas). Debemos tener en cuenta que la velocidad de degradación depende de la riqueza en enzimas, variable según los órganos, y de la temperatura. • Insolubilizar los componentes celulares, principalmente las proteínas, de modo que se preserven en el corte, mediante enlaces cruzados o desnaturalización. • Dotar al tejido de la consistencia necesa­ ria para las manipulaciones posteriores. El fijador ideal debería ser capaz de man­ tener la forma y el volumen de las es­ tructuras que se van a estudiar, además de 35

Técnicas en histología y biología celular

preservar las características bioquímicas y moleculares del tejido. • Facilitar las técnicas de tinción o los análisis posteriores. Así pues, y atendiendo a los objetivos ante­ riores, la finalidad de la fijación es mantener la estructura (y, en determinados casos, la función) del tejido lo más parecida posible a su estado in vivo. Sin embargo, no existe el «fijador ideal universal». Normalmente, este hay que seleccionarlo en función de los objetivos concretos de la investigación o del análisis clínico. En determinadas ocasiones tendremos que favorecer la preservación mor­ fológica, molecular o funcional y, en otras, podremos elegir un fijador o una mezcla de fi­ jadores diseñada para obtener un compromiso entre todos esos objetivos. Algunas técnicas especiales, como la microscopía electrónica, o algunos tipos de inmunolocalización o de hibridación de ácidos nucleicos pueden exigir un tipo específico de fijador. También hemos de tener en cuenta que determinadas molé­ culas requieren fijadores específicos para su conservación; esto ocurre, por ejemplo, con los lípidos, que pueden perderse si utiliza­ mos protocolos de procesamiento histológico (como la inclusión en parafina) que incluyan alcoholes, ya que los lípidos se disuelven en contacto con los alcoholes. Por tanto, durante el diseño del experimen­ to, y antes de obtener las muestras, es impres­ cindible seleccionar adecuadamente el pro­ tocolo de fijación mediante la realización de experimentos piloto, o mediante revisión de la bibliografía. Debemos tener en cuenta que un defecto de fijación en una muestra es difícil de corregir. También hay que saber que es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fija­ ción. Para conseguir la fijación óptima, es ne­ cesario tener en cuenta diversos parámetros, como el tipo de fijador, el tiempo y la tempe­ ratura de fijación, así como los tratamientos posteriores; además, otras variables impor­ tantes que se deben considerar son la osmolaridad y el volumen del fijador. A continuación pasaremos a describir las características más importantes de la fijación y de los fijadores de uso más habitual. Para mayor detalle de los mecanismos fisicoquímicos asociados a

la fijación, el lector puede consultar el texto de Bancroft y Gamble (2012), que se reseña en la bibliografía de este capítulo.

Tipos de fijación La fijación puede ser un proceso químico o físico. La fijación química es, en general, la más efectiva y utilizada. Sin embargo, en el proceso de fijación química se pueden mo­ dificar notablemente ciertos componentes de la muestra, en particular enzimas y algunos lugares antigénicos. Por tanto, los méto­ dos de fijación física se emplean en aquellos casos en los que existe algún requerimiento específico que no permite la utilización de agentes químicos. Comenzaremos con una breve descripción de los fundamentos de las dos principales técnicas de fijación física, la criofijación y la fijación por calor, para, a continuación, pasar a describir las caracterís­ ticas de los principales fijadores químicos y sus fundamentos. Fijación física

La criofij ación consiste en la congelación del tejido fresco, que detiene los procesos celulares e inm oviliza las estructuras tisulares; con ella podemos evitar la acción química de los fijadores. Por tanto, varias estructuras celulares, entre otros el DNA y el RNA, permanecen preservados. Para que la congelación sea realmente eficaz y los procesos de degradación se detengan com­ pletamente, ha de alcanzarse una temperatura de al menos -70 °C. La criofijación debe ser instantánea, ya que una congelación lenta supone la formación de cristales de hielo que alteran la morfología celular, y normalmente se realiza sumergiendo una pieza pequeña en nitrógeno líquido o, mejor aún, en isopropanol enfriado previamente hasta su punto de congelación (-170 °C) en nitrógeno líquido. La inmersión en isopropanol (también llama­ do «isopentano») frío permite una difusión de la temperatura más homogénea durante la congelación. El tratamiento previo del tejido con agentes crioprotectores (glicerol, dimetilsulfóxido, propilenglicol o sacarosa) permite también minimizar la formación de cristales de hielo. En el proceso de criofijación, el

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tejido, una vez congelado, se coloca en una cámara de vacío a baja temperatura y después se seca (se deshidrata) por evaporación lenta (sublimación del agua). En la modificación de este método, llamada «sustitución de la congelación» (freeze-substitution), el hielo del interior del tejido congelado es sustituido por alcohol a muy baja temperatura. El prin­ cipal inconveniente de la criofij ación es su reversibilidad, ya que, una vez descongelado, el tejido volvería a sufrir los procesos de de­ gradación antes mencionados. Este tipo de fijación está siendo cada vez más utilizado, debido al reciente avance de las técnicas de criomicroscopía electrónica. La fijación por calor es un método anti­ guo que ya usaba Paul Ehrlich (1854-1915). La introducción del horno microondas en el laboratorio de histología ha permitido resol­ ver los problemas del calentamiento errático producido, por ejemplo, por la técnica de contacto directo con una llama de mechero. La fijación se produce debido al calor gene­ rado mediante radiaciones microondas, ya que, al aumentar la energía térmica de las moléculas bipolares (agua y cadenas late­ rales polares de las macromoléculas) en el tejido, las proteínas se desnaturalizan y, en menor medida, pueden establecerse puentes de unión entre ellas. Es un método poco pre­ ciso y con escaso poder de penetración (con microondas comerciales, entre 11 y 15 mm desde la superficie del tejido), pero es utili­ zado en algunos laboratorios. La temperatura óptima es de 45-55 °C. Si se calentara menos, sería más difícil realizar el corte, y si la tem­ peratura fuera mayor, se producirían numero­ sos artefactos en el tejido. En teoría, muchas técnicas de tinción son compatibles con la fijación por microondas, incluidas las de im­ pregnación argéntica utilizadas para tejido nervioso. En general, la fijación con microon­ das es ventajosa cuando se necesita llevar a cabo una fijación muy rápida o cuando los fijadores químicos son incompatibles con la preservación de alguna molécula en el tejido (p. ej., se ha usado para preservar la acetilcolina en el tejido cerebral). La fijación con microondas se ha empleado para la fijación rápida de muestras quirúrgicas de rutina, como biopsias cardíacas urgentes de cuya

interpretación rápida depende la decisión terapéutica. Como la fijación por calor es pobre y apenas se produce entrecruzamiento de proteínas, en algunos casos se comple­ menta, posteriormente, con fijación química. Fijación quím ica

Este tipo de fijación se basa en el empleo de agentes químicos que permiten detener los fenómenos post mortem y mantener las estructuras tisulares, debido a su capacidad de reacción con las macromoléculas que componen los tejidos. La mayor parte de los fijadores afectan a las proteínas, los ácidos nu­ cleicos, las glucoproteínas, los polisacáridos, etc., aunque, en función del fijador empleado, unos elementos moleculares son preservados mejor que otros. La mayor parte de los fijado­ res no afectan directamente a los lípidos, cuya preservación en el tejido depende, sobre todo, de que en el protocolo se evite la presencia de agentes que los disuelven, como, por ejemplo, los alcoholes. En función de su mecanismo de acción, se pueden distinguir tres grupos prin­ cipales de fijadores químicos: entrecruzantes, oxidantes y precipitantes. Fijadores entrecruzantes. Form aldehído y glutaraldehído Los fijadores entrecruzantes dan lugar a un entrelazamiento de las proteínas mediante la formación de puentes de hidroximetileno entre el fijador y las moléculas de proteína. Estas pasan de estado sólido a gel y forman una trama espacial que preserva la posición relativa inicial de las proteínas solubles al inmovilizarlas, a la vez que dota al tejido de consistencia mecánica. Los fijadores entre­ cruzantes más empleados son los aldehidos. En este grupo se encuentran el formaldehído (formol) y el glutaraldehído. Los aldehidos reaccionan, sobre todo, con residuos básicos de los aminoácidos y cambian ligeramente el punto isoeléctrico de las proteínas. La fija­ ción con formaldehído preserva mejor la na­ turaleza química y las propiedades reactivas de las moléculas que el glutaraldehído. Por el contrario, el glutaraldehído preserva mucho mejor la morfología del tejido, pero causa una pérdida de hasta el 30% de la estructura de a-hélice de las proteínas. Los aldehidos

Técnicas en histología y biología celular

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FIGURA 3-1

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Formaldehído (izquierda) y paraformaldehído (derecha).

tienen problemas de toxicidad y hay que manejarlos con precaución. El formaldehído (fig. 3-1) es un gas (punto de ebullición: -21 °C) soluble en medio acuoso. Se trata del fijador más comúnmente utilizado en los laboratorios de histología y anatomía patológica. El formaldehído preserva la es­ tructura general de la célula y los componentes extracelulares al reaccionar con grupos amino primarios y también con otros grupos de la cadena de aminoácidos (aminas, anillos aro­ máticos y grupos guanidina). Los puentes más frecuentes entre proteínas se producen a través del aminoácido básico lisina. El for­ maldehído apenas reacciona con los lípidos y, por tanto, no es un buen fijador de las membranas celulares. La reacción del for­ maldehído es reversible si se aplica un exceso de agua, especialmente durante las primeras 24 h, a diferencia de la del glutaraldehído, que veremos más adelante, que es rápida e irreversible. En su versión comercial, la formalina (o formol) se presenta como una disolución de formaldehído al 37-40% en vo­ lumen y normalmente contiene una concen­ tración muy baja de metanol y ácido fórmico. El formaldehído también puede obtenerse a partir de paraformaldehído (v. fig. 3-1), un polímero sólido de alto peso molecular H 0(C H 20 ) nH, donde n tiene un valor de entre 6 y 100. El paraformaldehído libera monómeros de formaldehído al calentarse en solución acuosa. El paraformaldehído se disuelve muy lentamente en soluciones tamponadas a alta temperatura. Esta solución no contiene metanol ni ácido fórmico, lo que hace del paraformaldehído recién preparado el fijador de elección cuando se requiere fijar muestras para técnicas histoquímicas o de hibridación más delicadas. También se

usa el paraformaldehído fresco para mez­ clas fijadoras en microscopía electrónica. La solución comercial de formol contiene trazas de metanol para evitar la reacción inversa de monómeros de formaldehído a paraformaldehído insoluble. Los protocolos de fijación generalmente emplean una diso­ lución de formol/formalina comercial al 10% (volumen/volumen) o de paraformaldehído sólido disuelto en medio acuoso al 4% (peso/ volumen). En ambos casos, la concentración final de formaldehído en el fijador sería del 4%, que corresponde a la concentración de trabajo habitual; debe prepararse como una solución tamponada (a pH de 7,4-7,6), de modo que la osmolaridad y el pH de la solu­ ción fijadora no afecten al tejido. Cuando el formaldehído gaseoso se di­ suelve en una solución acuosa, como ocurre en los preparados comerciales de formalina, se transforma rápidamente en metilenglicol [CH2(OH)2] y sus polímeros derivados [0H(CH20 ) nH, donde n varía entre 2 y 8], hasta alcanzar un equilibrio en el que pre­ dominan el metilenglicol y sus polímeros frente al formaldehído (fig. 3-2). Dicho de otro modo, la presencia final de formaldehído puede ser menor del 0,1% en la formalina comercial (10%). Así pues, cuando una pieza de tejido se sumerge en formalina comercial, el metilenglicol penetra rápidamente en el tejido, pero no lo fija.

H ?C = O + H jO

Formaldehído

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HO C H jO H

Metilenglicol

FIGURA 3-2 Reacción en equilibrio entre formalde­ hído y metilenglicol.

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

F IG U RA 3-3

Reacción del formaldehído con las aminas primarias.

F IG U R A 3-4 Reacción d e entrecruzam iento de proteínas tras la fijación con formaldehído por la formación de puentes estables de tipo metileno.

publicación MASSON. Fotocopiar:

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A este hecho se debe la lenta fijación de las soluciones de formaldehído, ya que el tejido no se fija hasta la llegada del propio fijador, el formaldehído, que es la especie reactiva de la reacción de fijación con las proteínas. Cuando el formaldehído establece enlaces con las proteínas, la concentración de formaldehído en solución en esa zona disminuye y la reacción se desplaza hacia la formación de más formaldehído a partir del metilenglicol, para alcanzar de nuevo el equilibrio, y así sucesivamente. El formaldehído reacciona con diversas regiones de las proteínas. El formaldehído se une a diversos grupos funcionales para formar enlaces hemiacetal y otros. Por ejempío, con las aminas primarias (aminoácidos N-terminales y cadenas laterales de las Usi­ nas) se produce la reacción que se muestra en la figura 3-3. El formaldehído también puede reac­ cionar con los grupos guanidino de las cadenas laterales de la arginina, los sulfhidrilos de las cisternas o los grupos hidroxilos alifáticos de serina y treonina. La adición de formaldehído a todos estos grupos de las proteínas inhibe la actividad de muchas enzimas, lo que previene la autólisis, pero no estabiliza estructuralmente el tejido, que es la otra función del fijador. De hecho, los grupos hidroximetileno (—CH2OH) que se forman cuando algo se fija brevemente en

formaldehído pueden ser eliminados si esa muestra se lava durante varias horas en agua o alcohol. Sin embargo, cuando estos grupos hidroximetileno están unidos a las proteínas son capaces de participar en una segunda reac­ ción con grupos funcionales de la misma proteína o de proteínas adyacentes y formar puentes metileno estables (fig. 3-4). De este modo, diversas proteínas pueden enlazarse («entrecruzarse») mediante puentes metileno químicamente estables. De hecho, la formación de estos puentes metileno es la reacción más relevante en el proceso de entrecruzamiento de proteínas que constituye la fijación y la estabilización estructural de las muestras histológicas cuando se usan alde­ hidos como fijador. La estructura secundaria de las cadenas polipeptídicas también se es­ tabiliza en proteínas que han sido tratadas con formaldehído. El glutaraldehído es un dialdehído (fig. 3-5). Se trata de un compuesto bifuncional cuyos grupos aldehidos también reaccionan

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FIG U R A 3-5

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Glutaraldehído.

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Técnicas en histología y biología celular

con los grupos polares de las proteínas, de modo que también da lugar a puentes de unión entre ellas y, por tanto, a una malla proteica. El preparado comercial consiste en una solución acuosa que presenta monómeros y oligómeros de glutaraldehído, aunque solo el monómero es activo como fijador. En los preparados co­ merciales de glutaraldehído, a medida que pa­ sa el tiempo, se produce la oligomerización y, por tanto, la disminución de concentración del monómero activo. Así, para garantizar la calidad fijadora del glutaraldehído, es muy importante comprobar su pureza, así como considerar su período de conservación. En general, es mejor preparar la solución fijadora en el momento en que vaya a ser utilizada, aunque puede evitarse su degradación (por polimerización) si se conserva a 4 °C, pero solo durante un tiempo limitado (nunca más de 6 meses). Su pureza puede comprobarse espectrofotométricamente, ya que el gluta­ raldehído puro presenta un pico máximo de absorción a 280 nm, mientras que el material polimérico absorbe a 235 nm. La fijación me­ diante glutaraldehído es rápida e irreversible, pero con una escasa capacidad de penetración. Por ello, es necesario que los bloques de tejido que se van a fijar sean muy pequeños (1 mm3). Es un buen fijador intracelular y se emplea, principalmente, en microscopía electrónica. Fijadores precipitantes Los fijadores precipitantes desnaturalizan las proteínas al modificar su estructura terciaria y su estado coloidal. Este tipo de fijadores es­ tabilizan el tejido y aumentan la consistencia mecánica en mayor grado. Podemos clasifi­ carlos como alcohólicos, ácidos y metálicos; el ácido pícrico, por sus características fisi­ coquímicas, se describe independientemente. Dentro del grupo de alcoholes, los más empleados son el metanol y el etanol. Se trata de moléculas higroscópicas que retiran el agua del tejido, de modo que los enlaces hidrófilos/hidrófobos de las proteínas (y otras macromoléculas) resultan alterados, con lo que sus estructuras terciaria y cuaternaria son modificadas y precipitan. La principal desventaja de este tipo de fijadores es que alteran considerablemente la morfología del tejido y producen procesos de retracción más

acusados que los fijadores entrecruzantes. Los orgánulos de membrana más delicados, como las mitocondrias, son prácticamente destruidos. Sin em bargo, los alcoholes preservan muy bien la reactividad y la antigenicidad moleculares, ya que producen relativamente pocos cambios químicos. A ba­ jas temperaturas, el etanol precipita mu­ chas proteínas, pero no las hace irreversi­ blemente insolubles en agua. Las proteínas precipitadas no desnaturalizadas retienen las propiedades enzimáticas y otras caracterís­ ticas biológicas. Los fijadores alcohólicos son especialmente útiles a la hora de estudiar, por ejemplo, los ácidos nucleicos, que no resultan modificados excesivamente por la fijación alcohólica. Estudios fisicoquímicos muestran que el DNA se colapsa en solución etanólica o metanólica, pero no es extraído, sino que permanece asociado a proteínas. Es posible, además, que se extraigan parte de las histonas. La concentración de etanol a la que tiene lugar este colapso es del 65% de volumen/volumen. Cuando el DNA des­ naturalizado se vuelve solución acuosa, se recupera bastante bien la estructura original. La reacción de precipitación de ácidos nu­ cleicos depende también de la concentración de sales en el medio. Fijadores oxidantes Como ejemplos de fijadores oxidantes pode­ mos citar el tetróxido de osmio (0 s 0 4) —que en ocasiones se denomina erróneamente «áci­ do ósmico»— y los compuestos del cromo, como el dicromato potásico (K2Cr20 7). No se conoce del todo su mecanismo de fijación, aunque se sabe que existe un cierto grado de entrecruzamiento entre las proteínas, en con­ creto en el tetróxido de osmio. Esto se ve por el rápido aumento de la viscosidad de una so­ lución de proteínas si reacciona con tetróxido de osmio. Las proteínas resultan afectadas notablemente por la fijación con osmio, lo que hace que esta sea poco compatible con técnicas de inmunolocalización de antígenos. El osmio presenta también una elevada avidez por algunos lípidos (como los de la membrana plasmática), por lo que, además de fijarlos, les confiere contraste, al ser denso a los electrones. Por ello, el tetróxido de osmio

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

es muy utilizado como fijador/elemento de contraste en microscopía electrónica de trans­ misión. Se suele comercializar en forma de cristales dentro de unas ampollas de vidrio selladas. Como tiene propiedades tóxicas, también por inhalación, requiere medidas de protección en el laboratorio, como uso de guantes, protección de ojos, mascarilla, etc. Asimismo, cuando se manipula este fijador, es necesario trabajar siempre en campana de extracción con ventilación externa. El proceso de fijación por di cromato se com­ prende todavía menos que el del tetróxido de osmio y no parece que la oxidación sea la única razón para el proceso de fijación. Además de fijar las proteínas, el ión dicro­ mato puede reaccionar con los fosfolípidos y hacerlos insolubles, aunque esta reacción con los lípidos no ocurre en el período de fijación usual de 1-2 días, sino que requiere tiempos más largos. Esta propiedad permitió a los primeros neurohistólogos conseguir una bue­ na preservación del tejido nervioso, después de largos períodos de fijación en dicromato.

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publicación MASSON. Fotocopiar:

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O tros fijadores El fijador de tipo ácido más empleado es el ácido acético (CH3COOH) al 1-5%. Este no fija las proteínas, sino que coagula los ácidos nucleicos. Penetra rápidamente en los tejidos y tiende a hincharlos, al contrario que los fijadores alcohólicos, que los retraen. Cuando se rehidrata la preparación (eliminándose el fijador) la muestra recupera su morfología. Su mecanismo de actuación probablemente se deba a la desestructuración de las relaciones entre histonas y ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos fijados con acético se hacen más accesibles a los reactivos empleados en los procesamientos histológicos posteriores. El ácido acético forma parte de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina. Se usa para preservar los cromosomas, preci­ pitar la cromatina de núcleos interfásicos y contrarrestar el efecto de retracción de los fijadores alcohólicos o el pícrico. El ácido tricloroacético (TCA; CCl3COOH) se usa ampliamente en bioquímica para precipitar proteínas en solución. La coagulación probablemente se produzca por la interacción de los iones tricloracetato con los grupos

cargados positivamente de las proteínas. El TCA forma parte de algunas mezclas de fija­ dores histológicos, pero raramente se utiliza solo. Dentro del grupo de los fijadores metáli­ cos destacan el cloruro de mercurio (HgCl2) y el dicromato potásico (K2Cr20 7), aunque, como hemos visto, este último se suele cla­ sificar también entre los oxidantes. Como muchos otros de los fijadores histológicos (también el formaldehído), estos, antes de su uso histológico, fueron utilizados en la industria del curtido del cuero, la cual sigue utilizando sales de cromo en su proceso. Es­ tos dos reactivos (HgCl2y K2Cr20 7) también tienen importancia histórica, ya que fueron los primeros fijadores que se utilizaron en los comienzos de la histología. Los fundamentos químicos de la fijación mediante cloruro de mercurio no están muy claros. El cloruro de mercurio reacciona con las proteínas y forma proteinatos o sales que las hacen inso­ lubles. El mercurio puede tener propiedades entrecruzantes a través de su capacidad de re­ acción con sales de amonio, aminas, amidas, etc. y formando enlaces más estables con el grupo sulfhidrilo de las cisternas. El principal problema del HgCl2 es su elevada toxicidad (principalmente en el hígado y en el sistema nervioso), por lo que en la actualidad se uti­ liza con muchas reservas. Penetra muy rápi­ damente y puede endurecer excesivamente el tejido si la fijación se alarga. Además, los fijadores que contienen determinados metales pesados, como el mercurio, tienden a favo­ recer la precipitación cristalina de algunos colorantes sobre el tejido, con lo se forman manchas artefactuales. En el caso de la fija­ ción con mercurio, existen protocolos para eliminarlo del tejido antes de proceder a la tinción, en concreto mediante el tratamiento con la solución de Lugol, que contiene yodo y yoduro potásico, seguido de un paso con tiosulfato, que desestabiliza los enlaces en los que interviene el mercurio. El ácido pícrico es un derivado del 2,4,6-trinitrofenol (fig. 3-6). Se trata de un compuesto con propiedades precipitantes al formar sales (picratos) con algunas pro­ teínas con grupos básicos. La precipitación no ocurre en soluciones neutras. De hecho,

Técnicas en histología y biología celular

OH

no2

FIGURA 3 -6

Ácido pícrico.

la neutralización permite la redisolución de las proteínas precipitadas. Algunos autores afirman que un prolongado contacto con el pícrico (incluso después de la inclusión en parafina) puede causar en el tejido deterioro estructural y deficiencias en la reactividad a los colorantes. Los tejidos fijados con pícrico se lavan en varios pasos de alcohol al 70% hasta suprimir, en la medida de lo posible, el color amarillo intenso del pícrico. El pH bajo del pícrico hidroliza los ácidos nucleicos, lo que hace que los tejidos fijados en pícrico no puedan ser usados en estudios cuantitativos de DNA. Se trata de un excelente fijador para estudios morfológicos, aunque puede dar lugar a retracciones en el tejido y a un endurecimien­ to excesivo. Además, la pieza puede quedar amarillenta debido al color del fijador, aunque puede clarearse con carbonato de litio. Se utili­ za en solución saturada (2%). Una de las des­ ventajas del ácido pícrico es que, en estado só­ lido, es explosivo. Su coloración intensamente amarilla también es una desventaja a la hora de trabajar en el laboratorio, por las manchas que produce, que son difíciles de quitar. La tabla 3-1 recoge las propiedades fun­ damentales de los diversos agentes fijadores.

Mezclas de fijadores En general, y con el fin de aprovechar al máximo las ventajas y compensar las des­ ventajas de los diferentes tipos de fijadores, en función del objetivo de la técnica, suelen utilizarse mezclas de fijadores. Entre las más usadas se encuentran los líquidos de Bouin, Zenker-formol y Camoy.

El fijador de tipo Bouin es una mezcla de un fijador entrecruzante (formol) y dos preci­ pitantes (solución saturada de ácido pícrico y ácido acético) —en proporciones 2,5:7:0,5, respectivamente—. Es un fijador muy bueno para preservar la morfología y para el estudio de péptidos de pequeño tamaño, por lo que su uso es habitual en estudios del sistema endocrino. Además, es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucógeno. Una variante es el empleo de Bouin alcohólico, que consiste, simplemente, en disolverlo en alcohol. Sin embargo, el fijador de Bouin no es el más idóneo para algunas técnicas inmunohistoquímicas. La mezcla de Zenker-formol consiste en nueve partes de líquido de Zenker —ácido acético (4%), HgCl2 (4%) y K2Cr20 7(2%)— y una de formol. Es muy eficaz para fijar hue­ so. Tiene el inconveniente de utilizar HgCl2: además de la toxicidad que presenta, cuando se emplea es preciso eliminar el mercurio metálico de la muestra con Lugol antes de realizar la tinción. Por estos inconvenientes derivados del uso del mercurio, la mezcla de Zenker-formol se ha dejado de utilizar en la mayor parte de los laboratorios. Por último, el líquido Camoy contiene etanol, cloroformo y ácido acético glacial (6:3:1, respectivamente). Presenta una gran capacidad de fijación y penetración y, ade­ más, deshidrata los tejidos, por lo que es muy útil cuando urge realizar un bloque de para­ fina. Es un excelente fijador de ácidos nu­ cleicos. Como inconvenientes podemos citar que produce lisis y retracción de los tejidos. El líquido de Camoy se utiliza también para fijar tejidos vegetales. Otras mezclas fijadoras para vegetales son el formol-acético-alcohol (FAA; 50% de etanol, 10% de formalina y 5% de ácido acético glacial) o la formaldehídoalcohol-propiónico (FPA; 50% de etanol, 10% de formalina y 5% de ácido propiónico)

Reacción de los fijadores con lípidos y carbohidratos Los lípidos son un grupo de moléculas de es­ tructuras y actividades muy variadas. En ge­ neral, en las técnicas histopatológicas de ruti­ na, los lípidos se pierden durante los diversos

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pasos de procesamiento del tejido; son ex­ traídos, especialmente, en los pasos por alco­ holes de la inclusión en parafina y de la desparafinación. Si se necesita visualizar lípidos, el protocolo de procesamiento de elección son los cortes de congelación mediante el criostato. Normalmente, durante la fijación, los lípidos están todavía presentes y algunos de ellos reaccionan con los aldehidos, como, por ejemplo, los que contienen grupos amino, como la fosfatidiletanolamina. Además, el formaldehído afecta a los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados, de modo que se producen glicoles y dioxanos. De todos modos, las reacciones del formaldehído con los lípidos son lentas. El mejor fijador para visualizar lípidos es el osmio. De hecho, el uso de la fijación con tetróxido de osmio para preservar los lípidos es fundamental en microscopía electrónica. El mecanismo de acción del tetróxido de osmio como fijador es poco claro. Se sabe que reacciona con lípidos insaturados y oxida los dobles enlaces para formar glicol-osmatos estables. Ya hemos señalado anteriormente que algunos autores sugieren que forman enlaces entre proteínas. El ácido tánico es un fijador que retiene los lípidos y que ha sido usado, por ejemplo, para estudiar el surfactante en el pulmón. En general, no hay un método ideal para fijar carbohidratos. Por ejemplo, en un tejido procesado a través de soluciones acuosas se suele perder una proporción muy alta (hasta el 80%) del glucógeno. Normalmente se re­ comienda el uso de fijadores alcohólicos para preservar mejor el glucógeno. En lo relativo a la ultraestructura, se ha utilizado con eficacia el ácido tánico para mejorar la preservación de glucógeno, aunque también se preserva, en buena parte, con el procesamiento conven­ cional con tetróxido de osmio.

Factores que intervienen en la fijación química La fijación química es un proceso complejo en el que intervienen toda una serie de facto­ res que dependen tanto de la composición y de las características fisicoquímicas del fija­ dor (o fijadores) empleados como del proce­ dimiento mismo de fijación y del tamaño de

Cuadro 3-1 Factores que alteran la fijación química • • • • • • •

pH de la solución Tiem po de fijació n Tam año de la muestra Tem peratura del fijador C oncentració n del fijador O sm olaridad y volum en del fijador M ez cla de distintos fijadores

la muestra (cuadro 3-1). Comenzaremos des­ cribiendo la perfusión, como el procedimiento de fijación de elección en experimentación animal. Además, se señalaremos aquellas características fisicoquímicas de los fija­ dores que consideramos que hay que tener en cuenta en todo diseño experimental para conseguir una fijación eficaz y eficiente.

Procedimiento de fijación: perfusión e inmersión Por sus propias características, la perfusión solo se usa en modelos animales de histología experimental. Puesto que el objetivo de la fijación es detener el desencadenamiento de las alteraciones morfológicas y estructurales propias de la muerte celular, la misma será más óptima cuanto menor sea el tiempo trans­ currido entre el inicio de dichos cambios y la llegada del fijador a las estructuras tisulares. En el ámbito de la histopatología clínica y en otras situaciones experimentales, un órgano o una porción de tejido tiene que ser retirado del organismo durante una interven­ ción quirúrgica. Normalmente se aplican gra­ pas, suturas o ligaduras para detener el flujo sanguíneo, lo que determina una situación de anoxia en ese órgano o tejido, hasta que es extraído del organismo. Entonces se entra en un segundo período en el que el tejido es sumergido en el fijador y este comienza a penetrar desde la superficie hacia el centro de la pieza hasta alcanzar una concentración adecuada en la totalidad de la misma. La duración de estos dos procesos es variable y puede inducir una serie de cambios en el teji­ do. La anoxia produce cambios morfológicos que se pueden observar en el microscopio electrónico ya a los 10 min: las alteraciones más habituales se observan en la estructura

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Fijador

Lavador

FIGURA 3 -7 Sistem a de perfusión p o r gravedad. A ) Se administra sucesivamente una solución lavadora y otra fijadora alm acenada en botellas situadas a determinada altura p or encim a del animal que v a a ser perfundido. La presión de perfusión se puede regular variando la altura relativa de las botellas. B) Las soluciones se introducen a través de una cánula situada en el ventrículo izquierdo (1). Se hace también una incisión en la aurícula derecha (2). El sistema de perfusión por gravedad se ha sustituido en la mayor parte de los laboratorios por bombas de perfusión que controlan el flujo y la presión del fijador. (A, tomado de P einado MA, e t al., 1996).

de las mitocondrias. Los cambios en las enzi­ mas celulares son también muy rápidos. Las células que están en el centro del tejido su­ frirán más cambios que las que se encuentran en la periferia, debido al retraso de la fijación por la penetración más tardía del fijador. To­ das estas modificaciones se producen más lentamente si el tejido permanece en frío. Por lo que se ha venido señalando, los es­ tudios histológicos de material post mortem de necropsias humanas son especialmente delicados, pues la necropsia se lleva a cabo pasado un período de tiempo legal mínimo tras la muerte del paciente, lo que hace que los tejidos sean susceptibles de presentar más artefactos. La situación ideal sería que el tejido se fijara inmediatamente y de modo completo cuando sus células todavía estuvieran vivas. En patología humana se puede conseguir una fijación muy rápida en el caso de biopsias pequeñas, tomadas, por ejemplo, mediante punción con aguja fina. La fijación inmediata de órganos enteros o grandes fragmentos no suele ser posible en histopatología humana, pero sí en la experimental, cuando la fijación

se realiza mediante perfusión. Este procedi­ miento consiste en introducir el fijador en el sistema circulatorio antes de que se inicien los fenómenos post mortem. De esta manera se logra fijar todas las células de un órgano completo de forma muy rápida y uniforme. Para llevar a cabo la perfusión, el animal debe ser anestesiado con dosis subletales: lo suficientemente elevadas como para que se encuentre profundamente anestesiado, pero sin que deje de latir el corazón por el efecto del anestésico. El procedimiento de la perfusión se inicia, tras abrir la cavidad torácica del animal, canulando la aorta a tra­ vés del ventrículo izquierdo (fig. 3-7), lo que nos permitirá introducir las soluciones en la circulación mayor e impulsarlas con la ayuda de la contracción cardíaca. En el momento en el que se inicie la entrada de los líquidos, habrá que realizar una pequeña incisión en la aurícula derecha, de modo que se permita la salida de la sangre y de las propias soluciones una vez que han recorrido el sistema circula­ torio mayor al completo. El primer líquido que se hará pasar será la denominada «so­ lución lavadora» (un tampón fosfato salino

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isotónico y a pH fisiológico), cuya función es limpiar de sangre el torrente circulatorio para facilitar la llegada de la solución fijadora y su acción posterior. Se harán pasar secuencialmente ambos líquidos con la ayuda de una bomba peristáltica, que controla el flujo y la presión del fijador que entra, o simplemente por gravedad; en este último caso, el flujo de salida adecuado de las soluciones dependerá de la altura de los recipientes. Conforme el líquido fijador penetra en todos los tejidos del organismo a través de la vía circulatoria, se va consiguiendo una fijación rápida y ho­ mogénea. En el caso de la rata de laboratorio, pasados 4 min de la entrada del fijador puede observarse ya rigidez en la cola y las patas del animal, que es el signo de que el fijador ha llegado a la mayor parte del árbol circulatorio. Posteriormente, se diseccionará el órgano de interés y se continuará la fijación por inmer­ sión, en general en la misma solución fijadora que se ha empleado en la perfusión. Este paso se suele denominar «posfijación» y el volumen de fijador debe ser entre 10 y 30 veces mayor que el de la muestra fijada. El tiempo de fija­ ción por inmersión es variable en función del tipo de muestra y del fijador utilizado. En muchas ocasiones en las que la perfu­ sión no es posible o práctica, directamente se

realiza la fijación por inmersión. En estos ca­ sos, se hacen especialmente importantes las variables que comentaremos a continuación (penetración y tiempo). Por razones obvias, la fijación por inmersión es la que directa­ mente se lleva a cabo en los laboratorios de anatomía patológica humana. El principal problema de este método es que la pieza no siempre se fija de modo homogéneo.

Penetración (difusión) del fijador y tiempo de fijación Durante la fase de disección, se producen procesos de degradación y, además, trans­ curre un tiempo hasta que el fijador penetra en todas las células del tejido. Como este pro­ ceso de penetración es relativamente lento, el tamaño y, específicamente, el espesor de la muestra son rasgos muy importantes que de­ ben tenerse en cuenta a la hora de diseñar un experimento que incluya fijación. Por ejem­ plo, en microscopía electrónica, los bloques deben ser de aproximadamente 1 mm3. La capacidad de penetración de los diversos fijadores es distinta. Cada fijador presenta diferente coeficiente de difusibilidad (tabla 3-2). Medawar describió que la distan­ cia de penetración de un fijador depende de la raíz cuadrada del tiempo de fijación t y de una

TABLA 3-2 Coeficientes de difusibilidad (K) para fijadores com unes Fijad o r

F ijad o r (% en vo lu m en )

K (tejido)

K (gel)

Ácido acético

5

1,2

2,75

Trióxido de cromo Formaldehído Etanol Glutaraldehído

0,5 4 100 6 4 1,2-4* 1,2-4 Saturado 100 0,5-2 Saturado 3

0,25 0,78 1 0,25 0,34 0,33-0,5 0,5-1 0,78-0,84

1 3,6

Cloruro de mercurio Metanol Tetróxido de osmio Ácido pícrico Dicromato potásico

-

0,29-0,58 0,5 1,33

-

2,2 1,45 0,85 0,8 -

*Determinados a 4 °C; el resto de los valores están en condiciones ambientales. Adaptado, con autorización de Elsevier, de Bancroft JD, Gamble M (eds.). Theory and practice of histological techniques. 7* ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2012.

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constante K, que depende de cada fijador se­ gún la relación d = Kyft. K es, por ejemplo, muy alta en el etanol puro (K = 1) y en el paraformaldehído (al 4%, K = 0,78), y muy baja en el ácido pícrico saturado (K = 0,5), en el tetróxido de osmio (al 0,5%, K = 0,29) y en el glutaraldehído (al 4%, K = 0,34). Por tanto, en la velocidad de fijación influyen, de forma importante, el tipo de fijador y el gro­ sor de la pieza: cuanto menor sea su tamaño, más rápido se fijará; por ello, los bloques de tejido para microscopía electrónica (fijados normalmente en glutaraldehído y osmio) no deben ser mayores de 1 mm3. Es importante distinguir entre velocidad de difusión (o penetración) y velocidad de fijación, que es a la que se producen los fe­ nómenos químicos implicados en la fijación. El ácido pícrico, por ejemplo, presenta una constante de difusibilidad baja, pero una alta velocidad de fijación. El glutaraldehído y la acroleína son fijadores que reaccionan muy rápidamente con los componentes del tejido. El tejido ha de estar en contacto con el fijador durante un tiempo determinado. En general, para fijadores basados en formol, se suele fijar entre 12 y 24 h. En ese tiempo, el tejido adquiere la dureza suficiente como para, por ejemplo, llevar a cabo cortes de material parafinado o congelado. En todo caso, el proceso de fijación, de hecho, po­ dría continuar si se dejara durante 1-2 sema­ nas a temperatura ambiente. Si el tejido se mantiene demasiado tiempo en soluciones de formaldehído, más allá de ese tiempo máximo de fijación, se producirá un endure­ cimiento excesivo. Además, en esas muestras sobrefijadas se suele depositar un pigmento parduzco, derivado de la degradación ácida de la hemoglobina, que se hace muy visible en los cortes histológicos. El depósito de pigmento pardo se evita si las soluciones de formaldehído se tamponan adecuadamen­ te y, en todo caso, se puede retirar tratando el tejido con agentes oxidantes. En el caso de fi­ jadores basados en glutaraldehído, el tiempo óptimo de fijación es de 2-4 h. Hay que tener en cuenta que la sobrefijación con cualquier fijador puede alterar no solo la consistencia del tejido sino también sus características bioquímicas y reactivas.

Disolvente, osmolaridad y temperatura de fijación El pH de cada fijador varía. El disolvente en el que se disuelve el fijador es importante. En general, se suele ajustar el pH de la solución fijadora a pH fisiológico, para lo cual se uti­ liza, como disolvente, una solución tamponada. Fuera del rango de pH entre 6 y 8 se pue­ den producir artefactos de fijación, que son especialmente visibles ultraestructuralmente. Hay algunos tejidos, como el cromafín, que se benefician de una fijación a pH ácidos. En el caso de los fijadores ácidos (p. ej., acé­ tico), el pH bajo durante la fijación afecta a la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas y las precipita. Como acabamos de decir, con frecuencia se utilizan soluciones tamponadas como disolventes del fijador. De ellas, las más comunes son tampones de fosfato y Tris; también se usan tampones de bicarbonato, acetato de veronal y cacodilato. Hay que elegir bien la combinación de disolvente y fijador porque puede haber reacciones entre ambos. Por ejemplo, los barbituratos (veronal) y el Tris reaccionan con los aldehidos. Otros tampones pueden interaccionar con enzimas o metabolitos del tejido, y hay que tenerlo en cuenta a la hora de interpretar los resultados (p. ej., un tampón fosfato inhibirá la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa). Además, hay que considerar la osmola­ ridad del fijador, para evitar problemas de retracción del tejido (si la solución fijadora es hipertónica) o de turgencia (si es hipotónica). Los fijadores isotónicos también hinchan al­ go el tejido, por lo que, en la práctica, se tien­ de a hacer una solución fijadora ligeramente hiperosmótica. De todos modos, algunos laboratorios prefieren soluciones ligeramente hiposmóticas. La cuestión de la osmolaridad del líquido fijador es de mayor relevancia en microscopía electrónica, donde se sue­ len preparar soluciones fijadoras levemente hiperosmóticas (alrededor de 400 mOsm; la solución isotónica en mamíferos es de 340 mOsm). Hay tejidos especialmente sensibles a la osmolaridad del fijador, como, por ejem­ plo, el riñón y aquellos órganos relacionados con la osmorregulación del organismo. Tam­ bién se ha visto que el páncreas exocrino es

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

muy sensible a la osmolaridad del fijador. Normalmente, en microscopía electrónica se añade sacarosa a las soluciones fijadoras para ajustar su osmolaridad. En la práctica, se controla la osmolaridad del vehículo más que la del producto fijador final. En las solu­ ciones de glutaraldehído se suele utilizar un disolvente de unos 300 mOsm, que se añade a la osmolaridad generada por el fijador, que es mucho menos importante. Al final, en casos más delicados, el ajuste de la osmolaridad del fijador se realiza por ensayo y error en función de la concentración de fijador y de los resultados obtenidos para ese tejido de­ terminado. La temperatura de fijación no es especial­ mente crítica para la microscopía óptica y suele llevarse a cabo a temperatura ambiente. Algunos recomiendan que se realice a 4 °C para disminuir los fenómenos de autólisis, pero esto también enlentece las reacciones del fijador. Sin embargo, la temperatura de fijación sí parece de mayor importancia en microscopía electrónica y se suele llevar a cabo a 4 °C. La concentración del fijador es importante por varios motivos, también económicos. Des­ de hace décadas se trabaja con concentracio­ nes de formaldehído de alrededor del 4%. El glutaraldehído para microscopía electrónica normalmente se usa al 3%, pero se ha com­ probado que se puede reducir incluso hasta el 0,05%. De hecho, es muy común el uso de glutaraldehído al 0,25% para técnicas de inmunolocalización al microscopio electrónico. En ocasiones, ante necesidades experi­ mentales específicas, se añaden otras sus­ tancias a la mezcla fijadora. Por ejemplo, se usa ácido tánico para mejorar el contraste al microscopio electrónico de algunas es­ tructuras (gránulos en fase de exocitosis, carbohidratos complejos, etc.) o se añade lisina al glutaraldehído justo antes de fijar para preservar mejor el ghcocáhx. Otros ejemplos son la adición al fijador de lantano o rojo rutenio para observar espacios intercelulares en los epitelios al microscopio electrónico, o el uso de detergentes durante la fijación para permeabilizar las membranas y permitir el paso de reactivos para inmunolocalización en etapas ulteriores.

Efecto de la fijación en estudios moleculares Muchos de los métodos de procesamiento de m uestra para estudios m orfológicos fueron desarrollados hace más de un siglo principalmente a partir del uso rutinario del formaldehído como fijador. Como hemos indicado, la fijación en formaldehído dis­ minuye los fenómenos de autólisis e insolubiliza los componentes celulares, principal­ mente las proteínas, pero no logra impedir cierta degradación y fragmentación del DNA y RNA e introduce ciertas modificaciones en su capacidad reactiva original. Estos cambios pueden ser más o menos compatibles con las técnicas de análisis molecular. La preserva­ ción de DNA y RNA de calidad adecuada es fundamental cuando se realizan estudios de biología molecular y celular. Las mues­ tras criofijadas son una fuente ideal para la localización o extracción de DNA y RNA. Como la fijación en formaldehído y la in­ clusión en parafina (v. más adelante) cons­ tituyen el modo más habitual de preservar y archivar los tejidos en los laboratorios de Anatomía Patológica, es fundamental tener protocolos estandarizados para minimizar la degeneración del material genético por efecto del procesamiento. En concreto, la estandarización del método de fijación es fundamental. Varios factores pueden influir en la tasa de fragmentación y degradación del DNA, como, por ejemplo, el tiempo y la tem­ peratura de fijación, el pH del fijador y la des­ calcificación. Lógicamente, el tipo de fijador influye decisivamente en la preservación de los ácidos nucleicos en el tejido. El uso de fijadores basados en formaldehído tamponado es compatible con una preservación sufi­ ciente de los ácidos nucleicos. Los fijadores precipitantes introducen más artefactos en la morfología, aunque preservan mejor el DNA o el RNA. A la hora de tomar la decisión sobre qué fijador utilizar, hay que buscar la situación óptima entre buena preservación morfológica y molecular. En general, si no existe una razón específica para seleccionar otro procedimiento, el uso de formaldehído tamponado con un protocolo bien estanda­ rizado permite llevar a cabo la mayor parte de los estudios moleculares más habituales,

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incluida la secuenciación de fragmentos de DNA o RNA extraídos del tejido. Si solo se van a llevar a cabo estudios moleculares y la morfología resulta menos importante, se pueden preparar bloques de criostato de material sin fijar o bien fijado con fijadores precipitantes.

INCLUSIÓN Una vez fijados los tejidos, el siguiente paso es la obtención de cortes lo suficientemente delgados como para que la luz pueda atrave­ sarlos y, por tanto, sea posible observarlos al microscopio. Para la microscopía óptica, el espesor de los cortes de tejido debe os­ cilar entre 1 y —en casos excepcionales— 100 (xm, en función del tipo de estudio. La mayoría de los cortes tienen un espesor de 3-5 |xm. Después de la fijación, los tejidos sin incluir son demasiado blandos o muy duros y es imposible seccionarlos en cortes delgados de espesor homogéneo. Por ello, a fin de cortarlos satisfactoriamente en láminas finas de un espesor regular, hay que infil­ trarlos con un material firme que dé consis­ tencia al tejido y permita la sección. Este es el proceso de inclusión y preparación de los bloques histológicos. El medio más comúnmente utilizado para la preparación de los bloques de tejido es la parafina. Esta es el medio de inclusión de elección, debido a su bajo coste y a su fácil manejo. Para la inclusión de muestras en his­ tología también se utiüzan, en algunos casos, otras sustancias, como la celoidina,

Inclusión en parafina La parafina es una mezcla de hidrocarburos que se obtiene como un subproducto inco­ loro e inodoro de la industria petroquímica. A temperatura ambiente es sólida. Existe una amplia gama de tipos de parafina cuyo punto de fusión varía entre 40 y 70 °C, según su composición; a mayor punto de fusión, mayor es la dureza. La de uso rutinario suele tener su punto de fusión entre 54 y 58 °C. Las parafinas que se utilizaban en el pasado eran polímeros que con el tiempo se oxidaban y reblandecían. En la actualidad

contienen aditivos que aumentan la dureza y la homogeneidad del bloque, así como la viscosidad, lo que favorece la obtención de cortes seriados. En los primeros tiempos de la microscopía, la parafina se empleaba para englobar o envolver la pieza con un material más sólido que el tejido que se iba a cortar. Sin embargo, este modo de englobar los tejidos en parafina no contribuye al endurecimiento tisular ni tampoco facilita mucho el corte. Lo que resulta realmente eficaz para facilitar el corte es infiltrar la parafina en el propio tejido, mediante el proceso denominado «inclusión», en el que la parafina sustituye al medio acuoso del tejido. Así pues, la inclusión se establece, por lo común, como un paso previo a la microtomía (obtención de secciones) y durante su desarrollo el agua del tejido es sustituida por parafina, de modo que la pieza adquiera una consistencia tal que facilite la obtención de secciones de un grosor de tan solo 3 (xm. Dada la naturaleza hidrófoba de la pa­ rafina, una correcta inclusión de las piezas requiere seguir un protocolo secuencial tras la fijación, por el cual el agua del tejido fijado sea sustituida gradualmente por parafina. Es­ te proceso es secuencial porque la parafina no es miscible con el agua. Hay que ir retirando progresivamente el agua del tejido y sustitu­ yéndola por un medio hidrófobo compatible con la parafina. A continuación resumimos el proceso de inclusión: • Lavado para eliminar los restos del fija­ dor. El lavado se realiza con una solución tamponada o alcohol de 70°, en función del fijador empleado. En algunos casos, como los tejidos fijados con K2Cr20 7, es necesario realizar lavados especiales. • Deshidratación. Consiste en eliminar el agua (agua del propio tejido y agua de la fijación) para, posteriormente, embeberlo en el medio de inclusión hidrófobo (no acuoso). Generalmente se realiza con alcohol etílico. El paso a etanol puro ha de hacerse de manera gradual, con pasos sucesivos por alcoholes de gradación creciente (p. ej., desde etanol al 70% has­ ta etanol absoluto), para que sea eficaz y se evite la retracción de los tejidos. Es recomendable seguir varios pasos

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

publicación MASSON. Fotocopiar:

FIGURA 3-8

3

A gentes aclaradores.

por cada una de estas concentraciones, de forma que se evite que cada una de ellas sea diluida por la anterior y así con­ trolar mejor el proceso de deshidratación. En tejidos más delicados, como los em­ brionarios o algunos organismos inverte­ brados, el paso es aún más gradual (des­ de etanol al 30% hasta etanol absoluto). El volumen del alcohol ha de ser, como mínimo, unas 10 veces superior al del tejido. En ocasiones se emplea también una mezcla de alcohol metílico y acetona, que acelera la deshidratación. Una mala deshidratación es siempre peijudicial pa­ ra los resultados histológicos, por lo que es necesario controlar bien el resultado. • Aclaramiento. Consiste en sustituir el agente deshidratante, normalmente alco­ hol, por un disolvente orgánico que tenga la capacidad de mezclarse tanto con el agente deshidratante como con el medio de inclusión (parafina). De esta forma, se extrae el agente deshidratante al 100% (el alcohol no se mezcla bien con la parafina) antes de proceder a la infiltración de la muestra en parafina fundida. Este paso se denomina «aclaramiento», porque las muestras se vuelven ligeramente trans­ lúcidas, pues el índice de refracción de los agentes aclaradores (fig. 3-8) es alto, similar al de las proteínas. Si la pieza ha sido mal deshidratada, los agentes aclaradores se vuelven opalinos. Los agentes aclaradores más empleados son el xileno (xilol), el tolueno, el cloroformo y el benceno. El xilol y el tolueno son los más rápidos y endurecen poco el tejido. Los inconvenientes son su volatilidad, toxicidad e inflamabilidad.

• Infiltración. A continuación se sumergen los tejidos en parafina fundida en estufa, generalmente a 60 °C. Debido al calor, los agentes aclaradores (xilol, benzol, tolueno) se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos (tanto extracelular como intracelularmente) lo serán por la parafina. La infiltración puede realizarse de forma manual o me­ cánica mediante el uso de un aparato de inclusión automática (fig. 3-9). • Confección de los bloques. Una vez que se impregna el tejido con parafina, el mismo es sumergido en parafina fundida, dentro

FIGURA 3-9 parafina.

A parato de inclusión autom ática en

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FIGURA 3 -10 Estación para rea­ lizar bloques de parafina, con dis­ pensador de parafina líquida, zona de m ontaje de bloques y zona de enfriamiento de bloques.

/ / / /

de un molde pequeño, y se deja enfriar para que solidifique la parafina y forme un bloque sólido que incluya el tejido. Para la realización de los bloques se utilizan las llamadas «estaciones de inclusión», que constan de dispensador de parafina líquida, un recipiente de parafina líquida para el almacenaje para estuches de inclusión ya preparados, una placa caliente para la orientación de las piezas y una placa fría para la solidificación del bloque (fig. 3-10). En la actualidad se utilizan máquinas robotizadas para llevar a cabo el proceso de deshidratación, aclaración e infiltración, así como estaciones de inclusión.

Descalcificación Para la inclusión en parafina de tejidos mi­ neralizados, como huesos y dientes o tejidos patológicos con calcificaciones, se requiere llevar a cabo un proceso de descalcificación entre el lavado del fijador y la deshidratación. La descalcificación consiste en eliminar del tejido las sales de calcio para reblandecerlo y así poder cortarlo. Es importante que un proceso de descalcificación excesivamente agresivo no provoque artefactos o alteracio­ nes en el tejido (p. ej., se ha de disminuir su antigenicidad si se quieren llevar a cabo técnicas inmunohistoquímicas), que impe­ dirían procedimientos posteriores. Existen,

fundamentalmente, dos técnicas de descal­ cificación, que utilizan dos tipos de agentes químicos que reaccionan con el calcio: o bien se usan ácidos fuertes o bien moléculas con capacidad quelante, que capturan los iones de calcio. Entre los ácidos fuertes más utilizados en descalcificación se encuentran el ácido fórmico, el nítrico o el clorhídrico. También se usan mezclas descalcificantes ácidas, co­ mo, por ejemplo, el líquido de Jenkins, que contiene ácido clorhídrico y acético, junto con cloroformo y alcohol. Las soluciones ácidas fuertes descalcifican de modo relativamente rápido, pero, si se mantienen durante largos períodos de tiempo, pueden afectar de modo importante a las propiedades tintoriales de la muestra. El uso de agentes quelantes para la descalcificación como, por ejemplo, el ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) puede resolver este problema. El EDTA tiene un efecto mucho menor en la tinción, pero su mayor problema es que el proceso de descal­ cificación es mucho más lento y puede llevar incluso semanas, en función del grado de mineralization y del tamaño de la pieza. El volumen del líquido descalcificante ha de ser al menos 20 veces mayor que el de la pieza y hay que ir cambiándolo periódicamente durante el proceso de descalcificación. En general, los agentes descalcificantes ácidos aumentan la fragmentación del DNA y disminuyen la inmunorreactividad de los

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tejidos, lo que imposibilita la realización de estudios moleculares. Como el EDTA es un agente quelante que se adhiere químicamente al calcio presente en la superficie más externa del cristal de apatita, prácticamente no daña los componentes no calcificados (orgánicos) de la muestra. Por tanto, el EDTA permite una preservación tanto morfológica como molecular de los tejidos. La concentración máxima de EDTA no debe exceder el 14%. Una vez terminado el proceso de descalci­ ficación (independientemente del tipo de agente descalcificante empleado), la mues­ tra debe ser lavada profusamente con agua para remover completamente el agente des­ calcificante.

Otros medios de inclusión Además de la parafina existen otros medios de inclusión, como son la celoidina, la gela­ tina, el agar y la poliacrilamida. En el ámbito de la microscopía electrónica, se utilizan resinas como medio de inclusión, La celoidina es una forma purificada de la nitrocelulosa con baja viscosidad y, en el pasado, se empleaba en muestras con una dureza heterogénea, como, por ejemplo, el globo ocular; en tejidos duros pero frágiles, como pequeñas piezas óseas poco des­ calcificadas, o en estructuras tisulares muy delicadas, como el órgano de Corti en el oído interno. También es útil en trabajos neurohistológicos y en estudios donde se pretende hacer cuantificaciones estereológicas de po­ blaciones celulares, dado que produce pocas retracciones y compresiones tisulares como consecuencia de la inclusión y del corte. No es hidrosoluble, y el aclaramiento ha de rea­ lizarse con una mezcla de alcohol y éter, lo que implica la necesidad de tomar especiales precauciones de seguridad. El procesamiento con celoidina no requiere de altas tempera­ turas, lo que tiene ventajas para preservar moléculas termosensibles, pero la inclusión puede tardar desde días a semanas y hay que preservar los cortes en alcohol. Las secciones han de ser algo más gruesas (10 pm) que las de material incluido en parafina. En general, el procesamiento con celoidina es mucho más complejo y tedioso que el de parafina y

solo es aconsejable para estudios muy con­ cretos. Una de sus desventajas estriba en que la celoidina no es eliminada de los cortes y muchas veces se tiñe al mismo tiempo que los tejidos. La mayor parte de los laboratorios han abandonado la inclusión con celoidina, debido a la complejidad del procedimiento. La gelatina, el agar y la poliacrilamida se utilizan para obtener cortes gruesos de órganos completos. Se trata de sustancias hidrosolubles, por lo que la inclusión no requiere la deshidratación y la aclaración previas. Tampoco es necesario realizar un tratamiento a alta temperatura (su punto de fusión es de 40 °C), aunque en ocasiones es necesario endurecer el bloque con formalina cálcica antes de cortarlo. Un inconveniente del uso de estas sustancias es que no pueden eliminarse y suelen interferir en los procedi­ mientos posteriores de tinción, por lo que su uso suele restringirse a procesos de marcado con fluorocromos. El agar se suele usar tam­ bién como medio para englobar y agrupar en un mismo bloque fragmentos muy pequeños de tejido difícilmente manejables en el pro­ cesamiento a causa de su tamaño reducido. La mejor manera para incluir fragmentos mí­ nimos es añadirlos a agar líquido calentado, esperar que se depositen en el fondo del tubo y dejar que el agar gelifique a temperatura ambiente. Alternativamente, se puede filtrar el fijador a través de un filtro Millipore® con una succión leve y, sobre este, recoger los fragmentos. Entonces se añade agar líquido lentamente para no desplazar excesivamente los fragmentos y se deja solidificar. En ambos procedimientos, una vez eliminado el exceso de agar, se incluye en parafina el bloque de agar gelificado con las muestras en su inte­ rior, como si fuese una muestra de tejido. En cuanto a las resinas, pueden ser de tipo acrílico — como el metilmetacrilato, el glicolmetacrilato o el LR White™ (hidro­ soluble)— o de tipo epoxi. Habitualmente, estas resinas se emplean en microscopía elec­ trónica, ya que su gran dureza, tras su poli­ merización, permite la obtención de cortes de gran finura que hace posible el paso de los electrones (hasta menos de 20 nm). Las resinas son monómeros de bajo peso molecu­ lar, líquidas en forma monomérica, pero que

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FIGURA 3-11 Cortes seriados semifino (1 |xm de espesor) (A) y fino (20 n m d e espesor, visto al microscopio electrónico) (B) del m ism o tejido: túbulos de M alpigio (aparato excretor) de la langosta del desierto Locusta mi­ gratoria. L a célula recuadrada es una célula granular, uno de los tipos celulares del aparato excretor de este insecto. L a inclusión d e la m uestra se llevó a cabo e n una resina epóxica, que perm ite cortes semifinos y ultrafinos. (Por cortesía del Dr. Luis Montuenga Badía, Universidad de Navarra.)

polimerizan con luz ultravioleta o altas tem­ peraturas, por lo que dan lugar a polímeros sólidos de gran dureza. La polimerización de las resinas es una reacción exotérmica que, en ocasiones, puede dañar el tejido. En los casos en que se requiere una deshidratación previa, suele utilizarse, además de alcoholes, óxido de propileno como líquido aclarador. En el capítulo sobre microscopía electrónica trataremos con mayor detalle la inclusión y el corte (v. capítulo 9). Además de cortes finos para el microscopio electrónico, de los bloques incluidos en resinas se pueden obtener secciones para microscopía óptica denominadas «semifinas», debido a su es­ caso grosor (1-2 (xm). También se llevan a cabo cortes seriados alternando semifinos, para microscopía de luz, y finos, para micros­ copía electrónica (fig. 3-11), que pueden es­ tudiarse con objetivos que permiten una muy baja profundidad de campo y una magnífica resolución.

MICROTOMÍA Para la realización de cortes histológicos que van a ser observados con el microscopio de luz se utilizan los microtomos. Los de uso más habitual son el de rotación, el criostato y el vibratomo. Para microscopía electrónica,

se utiliza el ultramicrotomo (comentaremos sus características en el capítulo 9). Los microtomos son instrumentos de precisión con los que obtenemos series inin­ terrumpidas de cortes de un grosor determi­ nado y uniforme que se depositan sobre una superficie (normalmente un portaobjetos de vidrio) para ser examinados. En general, los microtomos constan de un portabloques en el que se sujeta la muestra; de una cuchilla, habitualmente de acero, y de un sistema de avance regulado del bloque o de la cuchilla, que permite controlar el espesor de los cortes. En el pasado, las cuchillas empleadas en los diferentes tipos de microtomos eran bloques sólidos de acero muy afilados que requerían una excelente conservación, ya que cual­ quier melladura en la cuchilla provocaba rasgaduras o «apersianado» de los cortes. En la actualidad, se dispone de cuchillas de acero desechables, que permiten un trabajo mucho más cómodo y eficaz. Las cuchillas de acero desechables para microtomo están ya perfectamente diseñadas para mantenerse sin vibración durante el corte, facilitar la pro­ ducción de hileras seguidas de secciones, etc. Una de las claves de la eficacia del corte his­ tológico para cualquier tipo de cuchilla es el ángulo de inclinación entre la cuchilla y la muestra, que en el microtomo de tipo Minot

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

FIGURA 3 -12 de mano.

a

Microtomo

convencional oscila entre los 10 y los 15°. Si el ángulo fuera mayor, la cuchilla podría clavarse en el bloque, y si fuera menor, el corte no llegaría a producirse. En el caso de los ultramicrotomos, para microscopía elec­ trónica, la cuchilla es de vidrio o de diamante, pues los bloques de resina polimerizada son mucho más duros. Aunque el microtomo más utilizado en la mayor parte de los laboratorios de histología es el microtomo de rotación de tipo Minot, también existen otros tipos de microtomos para necesidades especiales, los cuales describimos brevemente a continuación.

Microtomo de deslizamiento Existen dos variantes: en una de ellas, el portabloques queda fijo y la cuchilla se des­ liza sobre él (microtomo de deslizamiento); en la otra (microtomo de tipo Minot), la cu­ chilla permanece fija mientras se mueve el portabloques. El microtomo de deslizamiento permite realizar cortes de material incluido, por ejemplo, en celoidina y se pueden obte­ ner secciones de entre 5 y 10 |xm, aunque es difícil conseguir cortes seriados. Es un microtomo que está cayendo prácticamente en desuso. Es más peligroso y difícil de usar que el de rotación.

Microtomo de mano

Microtomo de rotación o de Minot

| •I

Es el microtomo más rudimentario, heredero de los aparatos que utilizaban los primeros microscopistas. El microtomo de mano prác­ ticamente está en desuso. Se emplea para cortar material duro, como tejido vegetal (tallo, hojas, raíz). Consiste, simplemente, en un soporte o portabloques para sujetar la pieza, un mecanismo de avance de tomillo y una cuchilla de superficie lisa que se desliza a mano (fig. 3-12). No permite realizar cortes de un grosor inferior a 15 (xm y generalmente son incluso más gruesos, de unos 50 p.m, y no demasiado precisos. Ha sido muy útil en laboratorios de Enseñanza Media como técnica de ilustración del principio de la microtomía.

En este tipo de microtomo, la cuchilla perma­ nece fija y perpendicular al portabloques, en posición vertical (fig. 3-13). El movimiento rotatorio de una manivela hace que el bloque con la muestra se desplace hacia la cuchilla (adelante) una distancia fija, que determina el espesor del corte. Una vez realizado el corte (de arriba abajo), el portabloques se desplaza hacia atrás, hacia arriba y luego hacia delante una vez más para disponerse para el siguiente corte (v. fig. 3-13C). El microtomo de tipo Minot es el más utilizado actualmente. Con él se logran cortes de gran precisión, gene­ ralmente de entre 3 y 5 |xm. La figura 3-13 muestra uno de los primeros microtomos de tipo Minot y uno actual, que tiene el mismo

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Microtomo de Minot

FIGURA 3-1 3 M icrotomos de rotación de tipo M inot. A ) D ibujo d e una d e las versiones m ás antiguas del mi­ crotomo de M inot tomado del M anual de histología norm al y de técnica micrográfica, de Santiago Ramón y Cajal. B) M icrotom o de tipo M inot actual. En ambos m icrotomos (A y B) se observan cortes de parafina seriados recién obtenidos. C) Esquem a de los movim ientos del portabloques en un microtomo de rotación de tipo M inot (1-4). Las flechas indican el m ovimiento del bloque de tejido.

mecanismo que el primitivo pero con mucha mayor sofisticación en los elementos mecá­ nicos y electrónicos. En la actualidad, los mi­ crotomos de tipo Minot se diseñan y producen como instrumentos de precisión y, entre otros aspectos, cuentan con control electrónico del avance de la muestra, lo que permite regular de un modo muy preciso el espesor del corte. El espesor óptimo de un corte de material parafinado es de entre 3 y 5 |xm. Los microtomos de tipo Minot son muy útiles para obtener cortes seriados de un mis­

mo bloque (v. fig. 3-13). Únicamente pueden cortar material endurecido, incluido en pa­ rafina o resinas. La versión del microtomo de tipo Minot para cortar material incluido en resinas para microscopía electrónica es el ultramicro tomo, del que trataremos con mayor detalle en el capítulo 9.

Criostato o criotomo El criostato es el equivalente al microtomo de Minot pero para la obtención de cortes de

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

FIG U RA 3 -1 4 E l crio sta to es un m icrotom o d e rotación dentro de u na cám ara refrigerada que se m antiene entre - 2 0 y - 2 5 °C. Las m uestras se conservan siem pre a bajas tem peraturas. L a tem pera­ tu ra d e la cám ara, el b loque, la regulación fina del avance, etc. son monitorizados electrónicamente.

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material congelado. El mecanismo de avan­ ce del bloque sobre la cuchilla es idéntico al de tipo Minot. El portabloques y la cu­ chilla se encuentran dentro de una cámara a una temperatura que oscila entre —20 y —25 °C (fig. 3-14). Se pueden obtener cor­ tes de un grosor mínimo de 6-8 p,m, pero habitualmente se consiguen cortes algo más gruesos (10-15 p,m). Normalmente, se inclu­ ye la muestra fijada antes de congelarla en un ¿ gel que contiene resinas y glicoles solubles % en agua. El más común es el llamado «OCT» § (del inglés optimum cutting temperature, | compuesto para la temperatura óptima de '■% corte). El OCT, al congelarse, proporciona •8 una matriz con la consistencia adecuada 1 para el corte de la muestra mediante crios•I tato. El OCT facilita notablemente el corte a bajas temperaturas y no deja residuos en los portaobjetos durante el procedimiento de tinción. Por tanto, no es necesario incluir un paso de eliminación del OCT de la sección en los protocolos subsiguientes de tinción, inmunohistoquímica, etc. Los cortes congelados se emplean, por ejemplo, para demostrar la localización ce­ lular de antígenos para los que los anticuer| pos no funcionan en parafina, para demosw trar actividad enzimática o para estudiar la ■| presencia en el tejido de lípidos solubles. En J histopatología diagnóstica, también se usan © los cortes congelados cuando se necesita un

diagnóstico urgente ante la sospecha de un tumor mientras el paciente sigue en el qui­ rófano. En manos expertas, un corte congela­ do de una muestra de tejido humano se puede tener preparado para su examen microscópi­ co a los 5 min de haber extraído la mues­ tra del cuerpo. De esta forma se consigue un diagnóstico histológico rápido y preciso mientras el paciente sigue en el quirófano. La técnica de corte por congelación posibilita realizar un diagnóstico anatomopatológico rápido que permite a los cirujanos decidir acerca del procedimiento quirúrgico más adecuado.

Vibratomo En los apartados anteriores se ha indicado que la obtención de secciones con un microtomo de tipo Minot generalmente requiere que las muestras estén incluidas en parafina; si se utiliza un criostato, entonces es necesario congelar previamente el bloque de tejido. En cualquiera de los dos casos, los cambios de temperatura o los reactivos necesarios durante el procesamiento pueden inducir alteraciones estructurales y funcionales en los componen­ tes celulares y tisulares que impidan su pos­ terior detección histoquímica. La fijación, la inclusión en parafina o la congelación pue­ den, en algunas ocasiones poco frecuentes, no ser adecuadas para algunos proyectos

Técnicas en histología y biología celular

F IG U R A 3-15

A ) Baño de flotación. B) P laca de adhesión.

de investigación concretos. En estos casos, cuando se requieren secciones de tejido fres­ co no fijado o fijado sin incluir, se utiliza el vibratomo. En este tipo de microtomo, la cuchilla avanza a la vez que mantiene un movimiento vibratorio, lo que facilita el corte. La ven­ taja de este microtomo es que no requiere inclusión de la muestra, que se corta en fresco o fijada y se mantiene humedecida. Una des­ ventaja es que las secciones que se obtienen no pueden ser tan finas como las conseguidas en el caso de la inclusión en parafina o la congelación; de hecho, el grosor mínimo suele rondar los 20-25 p,m (lo habitual para el vibratomo son 40 (xm). Otra desventaja es que no se obtienen cintas de cortes se­ riados, y el corte es más difícil de manejar. El bloque de tejido se coloca en una cubeta del aparato, de modo que quede sumergida en una solución tamponada con el fin de lu­ brificar al paso de la cuchilla y de evitar la desecación del tejido. Al utilizar el vibratomo es necesario controlar los siguientes paráme­ tros: a) la velocidad de avance de la cuchilla: será más lento cuanto más blando sea el teji­ do; b) la amplitud de vibración: será mayor cuanto más blando sea el tejido; c) el ángulo de ataque de la cuchilla: será mayor cuanto más blando sea el tejido, y d) la naturaleza y

la temperatura de la solución del baño, que, generalmente, es una solución tamponada: cuanto más blando sea el tejido, menor será la temperatura requerida. Los valores con­ cretos de cada uno de estos parámetros se suelen fijar por ensayo y error para cada tipo de material. Además, el vibratomo permite el corte de materiales incluidos en gelatina, agar y poliacrilamida, es decir, de muestras relativamente blandas.

Recogida de las secciones tras el corte En el caso de los cortes de material inclui­ do en parafina, una vez obtenidas las sec­ ciones, se colocan sobre un baño de agua (fig. 3-15A), a 37 °C, para facilitar su per­ fecta extensión antes de disponerlas sobre el portaobjetos. Este paso del proceso es muy importante para evitar arrugas y pliegues en el corte una vez depositado en el portaobjetos. En el caso del criostato, los cortes se pueden recoger directamente sobre el portaobjetos o en libre flotación; las secciones procedentes del vibratomo se recogen siempre en libre flotación. El requisito imprescindible para que un corte no se desprenda del vidrio durante el proceso de tinción es que los portaobjetos

C apítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

corte al cristal. En general, el secado se realiza sobre una placa calefactora a 37 °C durante unas 12 a 24 h (fig. 3-15B). En función de la técnica que se vaya a realizar, los cortes pueden archivarse durante largo tiempo, si se protegen adecuadamente del polvo, del calor excesivo y de la humedad. Sin embargo, si se van a llevar a cabo técnicas especiales, como la inmuno­ histoquímica, conviene tener en cuenta que el paso del tiempo puede oxidar las moléculas del tejido y disminuir la antigenicidad.

EXTENSIONES Hay muestras que no requieren inclusión ni corte para su estudio, como es el caso de las extensiones (frotis) de sangre, de otros fluidos biológicos (esputo, lavado bronquioalveolar, exudados, secreciones, orina, etc.) o del mate­ rial celular procedente de punciones diagnós­ ticas. En tales circunstancias, simplemente, se procederá a extender las células en monocapa sobre un portaobjetos. En ocasiones se utiliza el cytospin (fig. 3-16), un aparato en el que las células presentes en un fluido se someten a una fuerza centrífuga suave, que las dispersa hacia la periferia, donde se han situado los portaobjetos, a los que quedan adheridas de forma homogénea y en monocapa. Más recientemente, se ha desarrollado una tecnología de extensión a partir de

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estén limpios, libres de grasa o polvo, etc. y que, una vez depositados, los cortes se sequen bien. Sin embargo, con ciertos pro­ tocolos (aquellos que requieren pasos por soluciones alcalinas o altas temperaturas, algunas técnicas de inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o hibridación in situ) o tipos de cortes (cortes de criostato, secciones de cerebro, tejidos que contienen coágulos de sangre), algunas secciones tienden a des­ pegarse del portaobjetos más que otras. Por eso, normalmente, los portaobjetos deben recubrirse con distintas sustancias que fa­ vorezcan la adhesión del tejido al vidrio, antes de usarlos para recoger el tejido. Con esta precaución se evita que se despeguen durante los siguientes pasos del protocolo de tinción, inmunohistoquímica, etc. Entre las sustancias adhesivas destacan, como las más empleadas, las siguientes: la albúmina de Mayer (clara de huevo y glicerol a partes iguales); algunas resinas acrílicas; la poli-Llisina y, más frecuentemente, los polímeros de silano. Ejemplos de polímeros de silano son el 3-aminopropiltrietoxisilano (APES) y otros preparados comerciales basados en el aminoacilsilano. Una vez extendidas las secciones sobre el portaobjetos, hay que secarlas, sobre todo si son de parafina. Con este paso de secado se consigue mejorar aún más la adhesión del

FIG U RA 3 -1 6 A) Cytospin. B) Cámara en la que se colocan las células, que, tras la centrifugación en el cytospin, quedarán adheridas al portaobjetos.

Técnicas en histología y biología celular

citología líquida que mejora la distribución de las células en el portaobjetos y facilita su visualización. Esta tecnología recibe el nom­ bre de «ThinPrep» y también requiere un apa­ rato y reactivos específicos. La preparación se basa en la homogeneización, dispersión, filtración y transferencia de las células al por­ taobjetos, creando así una monocapa celular representativa de la totalidad de la muestra. Este proceso permite la optimización del muestreo citológico al separar el material de interés diagnóstico de otros componentes de la muestra, como son detritus, moco y san­ gre, que son eliminados. Esta diferencia es esencial en lo que se refiere a los resultados que se van a obtener, ya que se consigue una muestra limpia, que permite una detección de células atípicas más eficaz. La citología con­ vencional que utilizaba la simple extensión tiene una gran frecuencia de falsos negativos (10-50%) y, de estos, el 90% son debidos a las limitaciones en la preparación de la muestra, ya que la extensión está formada por una capa gruesa y el fondo generalmente está sucio de sangre y moco. Con la nueva tecnología de citología líquida se disminuye notablemente el número de falsos negativos. Tampoco requiere inclusión ni corte el estudio de las llamadas «improntas». La impronta consiste en obtener células des­ prendidas de un tejido mediante una sen­ cilla maniobra por la que el portaobjetos es depositado sobre el propio órgano en fresco. Con este procedimiento, algunas células del tejido quedan adheridas al por­

taobjetos. Esta técnica suele emplearse para estudiar tejidos en los que las células están relativamente «sueltas», sin muchos nexos entre sí, como, por ejemplo, el bazo o la médula ósea, pero también se ha usado para analizar células de fragmentos de tumores sólidos en fresco.

BIBLIO GRAFÍA Bancroft JD, Gamble M , editors. Theory and practice of histological techniques. 7th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2012. Chayen J, Bitensky L. Practical Histochemistry. 2.a ed. Chichester: W iley; 1991. Garcia del Moral R. Laboratorio de A natomía Patoló­ gica. M adrid: Interamericana McGraw-Hill; 1993. G ardella D , H atto n W J, R ind H B , R osen G D , von Bartheld CS. Differential tissue shrinkage and com­ pression in the z-axis: implications for optical dis­ sector counting in vibratome, plastic and cryosections. J Neurosci M ethods 2003;124:45-59. H orobin R W , K iem an JA, editors. Conn's Biological Stains: a Handbook o f Dyes, Stains and Fluorochromes for U se in B iology and M edicine. 10th ed. Oxford: BIOS Scientific Publications; 2000. Kieman JA. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde and glutaraldehyde: W hat they are and what they do. M icroscopy Today 2000;1:8-12. Oliver C, Jam ur MC. Fixation and embedding. Methods M ol Biol 1999;115:319-26. Peinado MA, Pedrosa J A Rodrigo J. Avances en inmunocitoquímica y técnicas relacionadas. Jaén: Universidad de Jaén; 1996. Start RD, Cross SS, Smith JH. Assessment o f specimen fixation in a surgical pathology service. J Clin Pathol 1992;45:546-7. Start R D, Layton CM, Cross SS, Smith JH. Reassess­ m ent o f the rate o f fixative diffusion. J Clin Pathol 1992;45:1120-1.

Capítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

60.e1

Actividades t . La baja velocidad a la que los fijadores difunden a través de los tejidos es considerada un importante factor limitante del com plejo proceso de la fijación, que también depende de la velocidad a la cual los fijadores reaccio­ nan con los tejidos (y dicha reacción depen­ de, a su vez, del pH , de la temperatura, de la concentración y de la duración del proceso). La d ifu sió n de los fija d o re s se ha es­ tudiado tanto en tejido s com o en geles de g elatina/albúm ina — a modo de supuestos tejidos— . Estos trabajos han in d icado que los fijadores obedecen a las leyes de la difu­ sión y que la distancia de penetración (d) de un fija d o r depende de una funció n sim ple del tiem po (t) de fija ció n : d = K ( t)1' 2 d o nde la constante K es el co e fic ie n te de difusión del fijad or (la distancia en m ilím e­ tros que el fija d o r ha difundido en 1 h) y es esp ecífica para cad a fijador. En la tabla adjunta se muestra el tiempo necesario para fija r completamente, con formaldehído al 4 % , bloques de geles y de biopsias de hígado humano de diferentes tamaños:

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Tipo y tamaño (mm) del bloque

I is

Gelatina/ empo (h) albúmina 4 7,2 10,8 9 16 14,4 25 18 100 36

Hígado 1,56 2,34 3,12 3,9 7,8

• C a lcu le el coeficiente de difusión del form aldehído en ambos casos y la difusión media por hora en cada una de las piezas. • La penetración: • ¿Es m ás lenta en los te jidos o en los geles? ¿A qué puede deberse? • ¿Es más lenta en los bloques grandes o en los pequeños, o bien es indepen­ diente del tamaño? • ¿Cuánto tiem po es n ecesario para que el fija d o r difunda a través de los prim é­ ros 2 0 (jum de m uestra? (Esta d ista n cia

c o rre sp o n d e a p ro x im a d a m e n te a la prim era cap a de célu la s del tejido.) 2 . Im agine que la industria del cuero a ca ­ ba de adaptar para el proceso de curtido un n uevo fija d o r m ucho m ás e fic a z , barato y con m enos im pacto m edio am b iental que los que u tiliza habitualm ente (el más usado a ctualm en te está basado en sales de c ro ­ m o). Esa fórm ula fijadora no se ha probado todavía en material histológico. Atendiendo a los datos de fijadores que figuran en las tablas 3-1 y 3-2, proponga una serie de e x ­ perim entos para com probar las caracterís­ tica s de este posible nuevo fijador. 3 . Con el fin de averiguar si la inclusión y el sistema de corte de la muestra pueden in­ fluir sobre el grosor final de una sección his­ tológica, se llevó a cabo un experimento en el cual se procesaron cerebros de ratones adultos siguiendo diversos protocolos. Las variables que se compararon en este estudio fueron el procedimiento de inclusión y el tipo de corte. Los dem ás parámetros — fija ció n , tinción y montaje— fueron exactamente los mismos en todos los grupos experimentales. La figura e3-1A muestra el grosor que se seleccio nó en cad a uno de los aparatos y el espesor final que realm ente mostraban los c o rte s, u n a v e z te ñ id o s y m ontado s, según el pro cedim iento de in clu sió n y de m icrotom ía em pleado. U n a ve z observado el grado de com pre­ sión o encogim iento, debido a cad a uno de los procedim ientos de m icrotom ía, se cuantific ó el n ú m ero de neu ro n as del n ú cleo oculom otor (donde es co no cido que la dis­ tribució n de neuronas es homogénea) a lo largo del espesor de esas m ism as secciones y se representó (fig. e3-1 B) el porcentaje de neuronas detectadas cad a 1 0 % del grosor del corte (n = núm ero de neuronas totales contadas; los asteriscos in dican diferencias estadísticas significativas con respecto a los valores esperados (línea discontinua). Para detectar si afecta la deshidratación de las seccio nes tras la tin ció n , se com paró el recuento de neuronas en seccio n es con m ontaje temporal y perm anente; los resulta­ dos se muestran a continuación (fig. e3-1 C ). • C om ente las gráficas. • ¿Q u é m ecanism o es el responsable de la va ria ció n en el grosor de los cortes?

Técnicas en histología y biología celular

n

□ Grosor seleccionado en el microtomo I I Grosor final de la

m m

Vibratomo

Celoidina

Criostato

Parafina

Vibratomo, 30 |jm

Percentil en la sección

Celoidina, 30 |jm

2

4

6

8

10

12

14 16

18

2

4

6

8

10 12

14 16

Porcentaje de núcleos neurona les

Parafina, 20-30 pm

Criosecdones, 35 |jm

18

Percentil en la sección

Porcentaje de núcleos neurona les

2

4

6

8

10

12

14 16

Porcentaje de núcleos neuron a les

18

2

4

6

8

10

12

14 16

Porcentaje de núcleos neurona les

18

Capítulo | 3 Procesamiento de muestras para microscopía óptica

Secciones de parafina, montaje acuoso

6

8

10

12

14

16

18

Porcentaje de núcleos neuron a les

60.e3

Secciones de parafina, deshidratadas, DPX

2

4

6

8

10

12

14

16

Porcentaje de núcleos neurona les

FIGURA e3-1 Gráficas que ilustran los resultados de la cuantificación de neuronas del núcleo oculomotor en función del tipo de procesam iento histológico. (Reproducido de Gardella et al., 2003.) ¿Q ué sistem a de m icrotom ía elegiría si qu iere contar neuronas? • H aga un esquem a que represente cóm o está afectada la densidad neuronal en el tejido antes y después de la m icrotom ía. •

4.

E sta m o s in te re sa d o s en c o n o c e r el efecto d el estrés am b ie n tal (alte rac io n e s c lim á tic a s, re stricció n c a ló ric a , en ferm e­ dades, etc.) en el desarrollo de un mamífero

pequeño, el to p illo de las nieves. Para ello, y cono ciendo la existencia de m arcadores vita les y su lo ca liz a c ió n en estructuras de registro, nos proponemos evaluar si el desa­ rrollo del cem ento dentario es un indicador del estrés. D iseñe un experim ento que im ­ p liq u e la a d m in istra ció n de un m arcad o r v ita l, el p ro to co lo de o b ten ción y p ro c e ­ sam iento de las m uestras, y el a n á lisis de los resultados.

AUTOEVALUACIÓN 1. Un investigador desea estudiar las altera­ ciones genéticas del cáncer de colon. Sin embargo, para ello, tiene que utilizar un método de extracción de DNA de sus mues­ tras tumorales. Asegurar la preservación de DNA es una etapa fundamental de la investigación. ¿Cuál es el mejor método de fijación para prevenir el daño en el DNA? a. El formaldehído. b. El glutaraldehído. c. La fijación por calor. d. La criofijación e. El formol. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: la criofijación con­ siste en la congelación del tejido fresco, que detiene los procesos celulares e inmoviliza las estructuras tisulares; con ella podemos

evitar la acción química de los fijadores. Por tanto, varias estructuras celulares, como el DNA y el RNA, permanecen preservados. El formol, el formaldehído y el glutaraldehído dificultan la extracción del DNA, y la fijación por calor causa su desnaturalización. 2. La finalidad de la fijación es mantener la estructura del tejido. Un investigador desea estudiar una enfermedad llamada «esteatosis hepática», también conocida como «hígado graso». Antes de recoger las muestras, el investigador se cuestiona qué método de fijación utilizar para con­ seguir una mejor observación de las gotas de lípidos. ¿Cuál es el mejor método de fijación para histoquímica de lípidos? a. La criofijación. b. El alcohol.

60.e4

c. La acetona. d. El xilol. e. La parafina. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la criofijación es el mejor método para la preservación de lípidos. El alcohol, la acetona, el xilol y la parafina los solubilizan. 3. Durante el diseño de un experimento, y antes de obtener las muestras, es im­ prescindible seleccionar adecuadamente el protocolo de fijación. Para conseguir la fijación óptima, es necesario tener en cuenta diversos parámetros, como el tipo de fijador, el tiempo y la temperatura de fijación, etc. ¿Cuál es el principal pro­ blema de la selección inadecuada del protocolo de fijación? a. Ninguno, ya que siempre es posible corregir un defecto de fijación. b. Un defecto de fijación es difícil de corregir. c. La fijación es un factor independiente del objetivo de la investigación. d. La fijación es un proceso reversible. e. Un defecto de fijación no altera la morfología celular. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: durante el diseño del experimento, y antes de obtener las mues­ tras, es imprescindible seleccionar adecua­ damente el protocolo de fijación mediante la realización de experimentos piloto o de una búsqueda en la bibliografía disponible sobre el tema. Debemos tener en cuenta que un defecto de fijación en una muestra es difícil de corregir y que es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fijación. Para conseguir la fija­ ción óptima es necesario considerar diversos parámetros, como el tipo de fijador, el tiempo y la temperatura de fijación, así como los tratamientos posfijación; además, otras varia­ bles importantes a valorar son la osmolaridad y el volumen del fijador. 4. D urante la preparación de m uestras para obtener secciones histológicas, un alumno intenta seccionarlas usando un microtom o. Los cortes contienen varis artefactos. Al examinar la mues­ tra, el alumno percibe que la misma está

Técnicas en histología y biología celular

muy blanda y, al repasar el protocolo de fijación, no le es posible identificar fallos. ¿Cuál es el posible problema de las muestras? a. Probablemente no haya problemas con las muestras. b. Las muestras no son adecuadas. c. Durante la inclusión de las muestras se produjo algún problema. d. Las muestras no sirven para obtener secciones histológicas. e. El alumno se ha equivocado en la selección del método para estudiar las muestras. Respuesta correcta: c. R espuesta razonada: después de la fijación, los tejidos sin incluir son dema­ siado blandos o muy duros y es imposible seccionarlos en cortes delgados de espesor homogéneo. Por ello, a fin de cortarlos satis­ factoriamente en láminas finas de un espesor regular, hay que infiltrarlos con un material firme que dé consistencia al tejido. Este es el proceso de inclusión y preparación de los bloques histológicos. 5. Durante el estudio de cortes histológicos con el microscopio de luz, un inves­ tigador observa varias alteraciones como pliegues que se doblan sobre sí mismos, así como un arrastre y destrucción de una banda recta de tejido. ¿Qué son estas al­ teraciones? a. Son alteraciones morfológicas carac­ terísticas de un tejido tumoral. b. Son alteraciones propias del tejido. c. Son alteraciones de tinción. d. Son artefactos. e. Son problemas de inclusión de la muestra. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: artefacto es todo aquello que puede dificultar, confundir o hacer que se malinterprete una preparación histológica. Los pliegues y la destrucción de estructuras del tejido son clásicos ejemplos de artefactos.

RECURSOS ONLINE Enlaces de interés http://stainsfile.info/StainsFile/jindex.html

Técnicas de tinción en histología Luis M ontuenga Badía, María Elena Bodegas Frías, Carlos de Andrea, Francisco José Esteban Ruiz

INTRODUCCIÓ N Cuando se observa al microscopio una sec­ ción histológica sin teñir es difícil apreciar la estructura del tejido, a no ser que dicho tejido posea algún tipo de molécula o pigmento natural propio que le confiera coloración. Ejemplos de estructuras naturalmente co­ loreadas son los gránulos melanóforos (en melanocitos) o los cloroplastos (en tejidos vegetales). Las estructuras tisulares no te­ ñidas no pueden detectarse con el micros­ copio óptico convencional, debido a que el índice de refracción de todas ellas es similar; cuando iluminamos una preparación sin teñir no se producen cambios apreciables en la longitud de onda de la luz que la atraviesa que permitan distinguir los distintos com­ ponentes del tejido. Así pues, para poner de manifiesto las diferentes estructuras que integran una sección histológica, es necesario crear artificialmente un contraste diferencial entre los diversos elementos del tejido. Actualmente, existen multitud de estra­ tegias para conseguir resaltar las diferentes propiedades ópticas de las estructuras, incluso en material biológico sin teñir. Es el caso, por ejemplo, del empleo de microscopios es­ pecíficos, como el de contraste de fases y el de contraste interferencial que hemos visto en el capítulo 2. Estos microscopios permiten visualizar estructuras celulares sin necesidad de tinción. Sin embargo, la vía más frecuente y eficaz para conseguir ese contraste diferencial es la tinción de las estructuras celulares y tisu­ lares mediante el uso de colorantes o por téc­ nicas histoquímicas y moleculares selectivas. © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

En el presente capítulo nos centraremos en los fundamentos y las características de las tinciones convencionales más clásicas. Un desarrollo más completo de los mecanismos fisicoquímicos asociados a la coloración his­ tológica y de los protocolos específicos asocia­ dos a la tinción de estructuras concretas puede encontrarse en los textos de Kieman (2008) y Bancroft y Gamble (2012), de donde hemos obtenido información para algunas secciones del presente capítulo. En posteriores capítulos, haremos una introducción a las técnicas de histoquímica e histología molecular (inmunohistoquímica, hibridación in situ, etc.). Aunque en la actualidad, para caracterizar de modo com­ pleto un tejido biológico, se suele acudir a una combinación de las diversas aproximaciones técnicas, el dominio de las coloraciones his­ tológicas clásicas es muy útil para un anáfisis inicial de las estructuras presentes en un tejido. En el laboratorio de anatomía patológica, las técnicas histológicas basadas en colorantes son todavía las herramientas básicas de rutina, aunque cada vez es más común la utilización en paralelo otros métodos para caracterizar molecularmente el tejido (inmunohistoquímica, hibridación in situ, secuenciación, etc.). En muchos proyectos de investigación en biología celular se requiere, asimismo, caracterizar de forma tintorial las células y los tejidos norma­ les o patológicos que se estudian.

COLORANTES HISTOLÓGICOS Desde los inicios de las técnicas histológicas se ha perseguido la coloración selectiva de las diferentes estructuras tisulares. El uso 61

Técnicas en histología y biología celular

de colorantes se remonta al origen de la cien­ cia histológica y de la microscopía. Leeuwen­ hoek (1714) utilizó azafrán disuelto en vino para teñir fibras musculares, y Fontana (1781) empleó soluciones acidobásicas unidas a co­ lorantes para resaltar el núcleo y el nucléolo de las células. Fue a partir de mediados del si­ glo xix cuando se produjo un enorme avance en la aplicación de colorantes, en paralelo al desarrollo de las industrias química y textil. Los colorantes se pueden clasificar, en función de su origen, en naturales y artifi­ ciales. La mayor parte de los colorantes que se usan en histología son artificiales. Los colorantes naturales se obtienen de extractos de plantas y animales. En general, se conocen desde hace siglos y han sido utilizados por el hombre para generar pigmentos y colorantes de uso diverso. Entre los colorantes naturales más empleados se encuentra la hematoxilina, que deriva del tallo del palo de Campeche (Haematoxylon campechianum), original de esa provincia mexicana y ahora también cultivado en América Central y del Sur; el carmín, que se obtiene del cuerpo seco de la hembra de la cochinilla (Dactylopius coccus), originario de México y las regiones andinas, aunque ahora también existen explotaciones en las Islas Canarias; el azafrán, obtenido de los estambres de Croccus sativus y de gran importancia comercial en España e Irán, y la orceína, extraída tras la hidrólisis alcalina de ciertos liqúenes, aunque en la actualidad se puede preparar sintéticamente.

Naturaleza química de los colorantes Los colorantes son los reactivos utilizados en el proceso de tinción. Una tinción es un procedimiento para visualizar un tejido que puede implicar el uso de uno o varios colo­ rantes de modo simultáneo o sucesivo. En es­ ta sección vamos a resumir algunos aspectos generales de los colorantes más utilizados en histología. Más adelante, veremos algu­ nos ejemplos de los colorantes y las tincio­ nes más relevantes. Un compuesto químico es coloreado porque sus moléculas absorben cuantos de radiación electromagnética en la parte visible del espectro.

En las moléculas orgánicas, los dobles enlaces se alternan con enlaces sencillos para formar los sistemas conjugados. En estos, los electrones del enlace se mueven de un átomo al otro cambiando las posiciones del enlace sim­ ple y sencillo. En una molécula cíclica como el benceno se produce una estabilización gracias a la resonancia, que hace que todos los enlaces sean equivalentes. Se dice que estas moléculas cíclicas estabilizadas tienen carácter aromático. Generalmente, los colorantes presentan ani­ llos aromáticos en su estructura. El anillo de benceno es en principio incoloro; sin embargo, cuando alguno de sus dobles enlaces se fija, el compuesto se vuelve coloreado al absorber la luz en alguna región del espectro visible. Los colorantes suelen ser moléculas orgánicas que presentan anillos aromáticos y que absorben la luz visible por efecto de los electrones aso­ ciados a combinaciones de átomos llamados «cromóforos», que son combinaciones de algunos de estos enlaces (tabla 4-1). La fijación de los dobles enlaces se pue­ de lograr haciendo reaccionar el benceno con grupos químicos de carácter cromóforo. Estas moléculas con anillos aromáticos que han adquirido un grupo cromóforo se deno­ minan «cromógenos». El cromóforo es, por tanto, el radical químico incorporado a una molécula orgánica y responsable del color. Los cromóforos más abundantes en colo­ rantes biológicos son el grupo nitro -N 0 2, el nitroso -N = 0 , el grupo indamina (imino) >C=N-, el grupo azo -N = N - y la configu­ ración quinónica (v. tabla 4-1). Además, para que el colorante pueda teñir un tejido ha de ser capaz de unirse a las estructuras celulares. El elemento químico que le confiere esta capacidad se denomina «grupo auxocromo» (fig. 4-1). En cuanto a los grupos auxocromos, se pueden distinguir los básicos, que, fundamen­ talmente, son aminas, y los grupos auxocro­ mos ácidos. Un colorante con una carga neta positiva se denomina «colorante básico» o, mejor, «colorante catiónico». Los auxocromos ácidos son derivados de grupos sulfónicos, de carboxilos o de grupos hidroxilo de compues­ tos fenólicos. Se encuentran en los colorantes ácidos (amónicos) y pueden estar como ácido libre o como sales de sodio u otro catión.

C apítulo | 4 Técnicas de tinción en histología

TABLA 4-1 Principales grupos crom óforos y auxocrom os C ro m ó fo ro s

A u xo cro m o s

Nitro: - N 0 2

Grupos básicos

Nitroso: - N = 0 Imino: > C = N A zoico: -N = N Carbonilo: > C = 0 Tiazol: >C=S Etileno: > C= C< Configuración quinónica

Am inas primarias: NH 2 Am inas secundarias: NHR Am inas terciarias: NR2 Grupos ácidos Hidroxilo: -O H Carboxilo: -C O O H Sulfhidrilo: SH2

m3 o

1

F IG U RA 4-1

■a

¿Cómo se combinan los colorantes con el sustrato?

publicación MASSON. Fotocopiar:

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Estructura quím ica general d e un colorante típico.

La industria textil ha sido pionera en el desa­ rrollo y la aplicación de los colorantes; de hecho, la química de los colorantes y los mecanismos más importantes de reacción con el sustrato se conocen en buena parte gracias a los datos provenientes de este sector. También la industria alimentaria utiliza con frecuencia colorantes en una gran diversidad de alimentos. Los colorantes en las industrias textil y alimentaria, así como en la técnica histológica, son moléculas de estructura similar y, en muchos casos, coinciden. Obviamente,

en el caso de la industria alimentaria, los colo­ rantes se seleccionan descartando los posibles efectos tóxicos de estas moléculas. En general, la coloración histológica con­ siste en poner en contacto el colorante con el tejido o las células que se van a teñir en unas condiciones que favorezcan la combinación selectiva de algunos de los componentes del tejido con los de los colorantes utilizados en la tinción. Normalmente se usa un exceso de colorante que se aplica a temperatura ambien­ te. La proporción de moléculas del colorante que quedan unidas al tejido es baja en relación con todas las que se emplean en la tinción. En términos generales, en todo protocolo

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histológico hay pasos de lavado del exceso de colorante no unido al tejido. Se habla de «tinción progresiva» cuando la solución de colorante actúa más o menos lentamente y el proceso de coloración resulta interrum­ pido, y el colorante sobrante se elimina del medio cuando se ha llegado al grado de coloración deseada. En cambio, se habla de «tinción regresiva» cuando la estrategia del protocolo de tinción consiste en sobreteñir las estructuras histológicas y, luego, ir elimi­ nando la coloración, mediante soluciones que revierten la unión del colorante al sustrato, hasta alcanzar la intensidad óptima de tinción. Este proceso de eliminación controlada del colorante se denomina «diferenciación». El éxito de toda tinción histológica depende de la capacidad que tienen los colorantes de unir­ se selectivamente, y con diversa afinidad, a unas estructuras del tejido y no a otras. Los protocolos de tinciones histológicas están diseñados para optimizar este fenómeno de coloración selectiva (cuadro 4-1). ¿Cómo se unen los colorantes al tejido? ¿Cuáles son los fenómenos fisicoquímicos implicados? A continuación, describimos los mecanismos de unión tinción-sustrato más relevantes en el campo de la coloración histológica.

Relaciones electrostáticas Es el caso de la atracción de colorantes ácidos a estructuras básicas, y viceversa. El fenómeno de interacciones electrostáticas es el mejor conocido de los mecanismos de tinción. Por ejemplo, una molécula ácida como el proteoglucano de la matriz extracelular se unirá con colorantes básicos (catiónicos) y una proteína de carácter básico se teñirá con colorantes ácidos (amónicos). Las atracciones electrostáticas son importantes para atraer diferencialmente moléculas co-

Cuadro 4-1 Técnica de tinción • D eb e ser com patible con el fija d o r y el tipo de inclusió n • Los protocolos deben ser estandarizados • Es necesario considerar el uso de contro­ les para evaluar si la tinción es adecuada

lorantes de carga opuesta presentes en una solución en la que hay una mezcla de colo­ rantes de distinta carga. En teoría, se podría formar una sal insoluble entre el colorante y la molécula del tejido de carga opuesta, pero en el contexto de la coloración histológica esto no ocurre si solo se aplica un colorante. De hecho, en algunas tinciones, los enlaces iónicos son los únicos que mantienen unidos el colorante y el tejido. Para conseguir una unión más estable del colorante con el sus­ trato, la técnica histológica utiliza el pro­ ceso de mordentaje, que se describe en el siguiente párrafo.

Enlaces coordinados, mordientes y quelantes A pesar de lo dicho en la sección anterior, en muchos procesos de coloración histológica sí se producen moléculas insolubles en las que participa el colorante. En concreto, el uso de moléculas accesorias, con carácter de «mordiente», ayudan a la formación de com­ plejos coloreados insolubles. Una sustancia mordiente es, en general, aquella que sirve para unir un colorante a un sustrato. La pala­ bra «mordiente» se usa mucho en el contexto de la pintura; en terminología histológica, se utiliza, sobre todo, para referirse a iones metálicos que son capaces de unirse covalentemente a algunos colorantes para formar complejos (también denominados «compues­ tos de coordinación» o «complejos colorantemetal»). La molécula que se combina con el ión metálico se llama «ligando». Si el ligando tiene dos o más átomos posicionados para formar enlaces coordinados con el mismo ión m etálico, se puede form ar un anillo con mayor estabilidad: un complejo de tipo quelato. Los complejos de tipo quelato son bastante comunes en las interacciones entre iones metálicos y colorantes. Los cationes más frecuentemente usados en las tinciones histológicas son los de aluminio, hierro y cromo. Cuando un ión metálico actúa como mordiente, se forman enlaces coordinados tanto con el colorante como con el sustrato. La identificación de átomos del sustrato im­ plicados en la formación de enlaces coor­ dinados resulta menos fácil. En principio, cualquier átomo de oxígeno o nitrógeno que

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FIGURA 4-2 Posibles disposiciones d e los com plejos colorante (C)-m ordiente (M )-sustrato. H 20 , moléculas de agua con enlace coordinado. (Modificado de K iem an JA. H istological and histochemical methods. Theory and practice. 4 lh ed., 2008. Con autorización de Scion P ublishing Ltd.)

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publicación MASSON. Fotocopiar:

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no esté completamente coordinado con otras moléculas del tejido podría estar disponible para unirse a un ión metal mordiente. Existen diversas posibilidades de formar complejos colorante-mordiente-sustrato (fig. 4-2). El mordiente se aplica a veces antes del colorante y en otros protocolos se mezclan el mordiente y el colorante. En esas mezclas hay competición entre los posibles ligandos de los iones metálicos (colorante, sustrato, moléculas de agua). En la mayor parte de los protocolos hay un exceso de iones mor­ dientes respecto a las moléculas de colorante. Un ejemplo típico de acción mordiente es el de la tinción de núcleos con hemateína (hematoxilina CI 75290) asociada a iones hierro o aluminio. En general, los colorantes con mordiente son bastante resistentes a los pasos posteriores de los protocolos con agua, alcoholes o soluciones débilmente ácidas. Las preparaciones se pueden diferenciar de­ colorando con soluciones ácidas más fuertes o soluciones del mordiente aislado.

Enlaces covalentes En general, no se forman enlaces covalentes entre colorantes catiónicos o amónicos y el sustrato. Sin embargo, algunos colorantes tienen grupos auxocromos de tipo reactivo capaces de formar enlaces covalentes con grupos hidroxilo o amino del sustrato. Estos colorantes no se usan para tinción histológica convencional porque no son suficientemente selectivos. No obstante, los grupos auxocro­

mos reactivos de algunos cromógenos sí se utilizan como base para otras aplicaciones, como el marcado de macromoléculas que se usarán en inmunohistoquímica o hibridación in situ. Un ejemplo de estos auxocromos reactivos son los isotiocianatos. La fluoresceína, uno de los marcadores fluorescentes más utilizados para marcar proteínas, es un isotiocianato que se conjuga a las proteínas (p. ej., con inmunoglobulinas) a través de sus aminas primarias (p. ej., las de las lisinas).

Otros mecanismos fisicoquímicos Puentes de hidrógeno Aunque se formen entre el colorante y el sustrato, es improbable que la contribución de los puentes de hidrógeno a la unión entre ambos sea muy significativa cuando la colo­ ración se produce en medio acuoso. Hay que tener en cuenta la competencia de moléculas de agua, que son mucho más abundantes. En soluciones no acuosas y en el caso de algunos colorantes del colágeno, se ha sugerido que los puentes de hidrógeno puedan tener mayor protagonismo. Las fuerzas de Van der Waals pueden ser importantes en los procesos de co­ loración de tinciones muy específicas, como, por ejemplo, para fibras elásticas. Interacciones hidrófobas en la disolución diferencial: coloraciones de lípidos Al echar aceite al agua, somos testigos de un fenómeno fisicoquímico muy determinado. Cuando las moléculas no polares se ponen en

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contacto con el medio acuoso tienden a aso­ ciarse entre sí y formar, por ejemplo, núcelas. En este fenómeno de autoasociación entre moléculas hidrófobas intervienen fuerzas de Van der Waals entre los grupos hidrófobos de esas moléculas y los puentes de hidrógeno que se forman entre las moléculas de agua. En el mundo de la coloración histológica se utilizan colorantes hidrófobos para teñir sustratos hidrófobos. Este es el caso de las coloraciones de lípidos presentes en el tejido, como los que se encuentran en adipocitos del tejido graso o en la envoltura mielínica de las fibras nerviosas. En este caso, los colorantes se suelen disolver en disolventes orgánicos moderadamente polares (p. ej., etanol al 70%). Los colorantes que se utilizan (p. ej., Sudán negro) se unen con el tejido al disol­ verse en él. El Sudán negro y otros colorantes hidrófobos para teñir lípidos presentan una mayor capacidad de disolución en las grasas que en el disolvente moderadamente polar en el que se preparan. Estos colorantes, que se agrupan bajo los términos generales «colo­ rantes a la grasa», «colorantes disolventes» (solvent dyes) o «lisocromos», tiñen materia­ les lipídicos por «disolución diferencial», es decir, porque se disuelven en las estructuras lipídicas mejor que en el disolvente en el que se aplican. Ejemplos de este tipo de coloran­ tes son el Sudán negro (C I26150), el Sudán III (CI 26100), el Sudán IV (CI 26105) o el aceite rojo O (oil red O, CI 26125). Im pregnaciones Como veremos más adelante, en los procesos de coloración denominados «impregnación metálica», el «colorante» (no es propiamente un cromóforo) forma agregados metálicos insolubles que quedan retenidos en el tejido gracias a la malla molecular creada en el proceso de la fijación.

tud de onda de absorción de luz y, por tanto, el color observado del objeto teñido es dis­ tinto al del colorante libre. Este fenómeno se denomina «metacromasia». La metacromasia depende no solo del colorante sino también de las propiedades de las estructuras celulares que tiñe. Los sustratos que se tiñen de modo metacromático se llaman «cromotrópicos». En la mayoría de los casos, el color metacromático es de una longitud de onda mayor que el del colorante. Los colorantes azules, como la tionina o el azul de toluidina, tiñen en violeta o colores rojizos. Por ejemplo, el azul de metileno (CI 52025) o el azul de tolui­ dina (CI 52040), tiñen las células cebadas del tejido conjuntivo de color púrpura (fig. 4-3). Los colorantes metacromáticos son catiónicos y tienen afinidad por estructuras ácidas, es­ pecialmente las sulfatadas. Los colorantes metacromáticos se encuentran entre las tiacinas, las oxacinas, las acinas y los xantenos (v. más adelante). La metacromasia ocurre porque en la reacción del colorante con de­ terminadas estructuras las moléculas de co­ lorante se aproximan mucho entre ellas, de modo que se produce un cambio en su rango de absorción lumínica, lo que hace que esas estructuras se vean de diferente color. Existen técnicas especiales para revelar la metacroma­ sia. Algunas requieren un tipo de fijación es­ pecial (los fijadores alcohólicos la favorecen). La metacromasia es incompatible con los fija­ dores oxidantes; por ejemplo, no se puede ob­ servar metacromasia en muestras fijadas con tetróxido de osmio (0 s 0 4). Las técnicas para revelar metacromasia son útiles para estudiar morfológicamente estructuras que contienen glucoproteínas sulfatadas (algunas células mucosecretoras), heparina (en los gránulos de las células cebadas) y los proteoglucanos de la matriz del cartílago y algunos tejidos conjuntivos especiales.

Metacromasia

Nomenclatura de los colorantes

La mayoría de los colorantes son ortocromáticos, es decir, colorean el tejido con su propio color. Algunos, sin embargo, tiñen las estructuras de un color que no es el original del colorante. Esto ocurre porque los iones del colorante unidos al sustrato cambian la longi­

Hay razones históricas que han hecho confu­ sa la nomenclatura original de los colorantes: por un lado, su origen tan variado (natural, artificial, de la industria textil, etc.) por otro, el hecho de que un mismo colorante haya recibido diversas denominaciones, y también

C apítulo | 4 Técnicas de tinción en histología

F IG U R A 4 - 3 T in c ió n de az u l de toluidinaque revela las células cebadas en el tejido adiposo de rata. L as células cebadas aparecen m etacrom áticas: el az u l de to lu id in a las tiñ e d e v io le ta fuerte en vez d e azul. (P or cortesía de la Dra. M .aÁngela Burrell, Universidad de Navarra.)

que algunos colorantes usados en la prácti­ ca industrial o histológica, en realidad, son mezclas complejas de dos o más moléculas coloreadas. Por último, el nombre de los colorantes no tiene casi nunca relación con su estructura química. Por eso, la Society of Dyers and Colourists (Reino Unido) publica desde hace años un catálogo oficial con una nomenclatura estandarizada de colorantes y otros compuestos coloreados útiles: el llama­ do «Colour Index» (CI). En él, cada colorante tiene un número de referencia basado en su constitución química. El catálogo también informa de los nombres del colorante y de su color. Asimismo, la Biological Stain Comis­ sion (EE. UU.) realiza un control de calidad y garantiza la homogeneidad de los colorantes histológicos más utilizados. El CI es muy útil a la hora de hacer pedidos de colorantes a proveedores comerciales. En la siguiente sección, en la que introduciremos algunos colorantes, se utilizará el CI a modo de ejem­ plo. En el libro clásico de Conn (2010) sobre colorantes de uso en biología se describen y discuten todos los colorantes histológicos, los sinónimos con los que se conocen y sus propiedades tintoriales.

Tipos de colorantes En función de su estructura, de sus grupos auxocromos o de sus grupos cromóforos,

se pueden distinguir diversos tipos de co­ lorantes.

Según el grupo auxocromo • Básicos o catiónicos. Cuando el grupo auxocromo es fuertemente catiónico o básico, como, por ejemplo, los presentes en el azul de metileno o en la fucsina básica, estos colorantes tienen tendencia a unirse a las estructuras ácidas. Gene­ ralmente, los grupos auxocromos básicos son aminas. Un colorante con una carga neta positiva se llama «colorante básico» o, mejor, «colorante catiónico». Estos colorantes principalmente tiñen núcleos y carbohidratos ácidos. • Ácidos o amónicos. Cuando el grupo auxo­ cromo es de carácter ácido, y la carga neta es negativa, se habla de «colorantes ácidos o aniónicos». Los grupos auxocromos ácidos de los colorantes suelen consistir en grupos sulfónicos o carboxílicos o en hidroxilos de los fenoles. Ejemplos de co­ lorantes aniónicos son la eosina, el Orange G o la fucsina ácida. Se usan, por ejemplo, para teñir citoplasma y colágeno. • Existen también algunos colorantes sin carga, entre los que se encuentran co­ lorantes reactivos muy poco selectivos, colorantes hidrófobos (para teñir lípidos) o algunos colorantes coordinados con

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mordiente. Entre los colorantes neutros, algunos autores también engloban sales compuestas entre un colorante aniónico y otro catiónico, como el que se forma entre el colorante azur como catión y la eosina como anión. Este compuesto se utiliza disuelto en alcohol en la tinción de Romanovski, una tinción general precursora de la coloración de Giemsa para células sanguíneas y extensiones celulares (v. más adelante).

Según la estructura química y el grupo cromóforo • Los colorantes se pueden clasificar tam­ bién en función de su estructura química.

Nitrocolorante

Color ante azoico

La figura 4-4 muestra la estructura bási­ ca de las diversas familias de colorantes. • Colorantes nitrados o nitrosados. Son nitro- (-N 0 2) o nitrosoderivados (-N =0) de anillos aromáticos como el benceno. Uno de los más utilizados es el 2,4,6trinitrofenol o ácido pícrico (CI 10305). Este es un colorante nitroderivado anió­ nico de color amarillo que se usa también como fijador, como hemos comentado ya en este capítulo. Es soluble en agua y aún más en alcohol y otros hidrocarburos aro­ máticos, pero el xilol no lo extrae de las secciones ya teñidas. La presencia de los tres grupos nitro incrementa el carácter ácido de este compuesto fenólico.

Antraquinona

Xanteno

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Acridina

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FIGURA 4 -4 Ejem plos de tipos de colorantes según su estructura química y sus grupos cromóforos. (Adaptado de García del M oral R. Laboratorio de A natomía Patológica. Interamericana McGraw-Hill, 1993.)

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O (CI 26125) son diazoicos de carácter lipocrómico. El rojo Congo (CI 22120) es diazoico, mucho más soluble en agua que en alcohol y se utiliza como indicador de pH, pues cambia su color de rojo a azul por debajo de un pH de 3. En histología se usa como colorante para el amiloide. El rojo sirio (sirius red, CI 35780) es una molécula larga de tipo tetraquisazoico que se asocia linealmente en las largas fibrillas del colágeno y lo tiñe de rojo aumentando su birrefringencia natural cuando se analiza con el microscopio de luz polarizada (fig. 4-5). La tinción de rojo picrosirio (v. fig. 4-5), que se usa muy habitualmente para revelar las fi­ bras de colágeno, incluye el colorante rojo sirio y el ácido pícrico.

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• Colorantes azoicos. Hay muchos co­ lorantes de tipo azo que se usan en la industria y en el laboratorio histológico. Contienen el cromóforo -N = N - uniendo anillos adyacentes derivados del benceno o del naftaleno. Pueden ser monoazoicos (Orange G, ponceau de xilidina), diazoicos (Sudán negro, rojo Congo) o, más raramente, tetrazoicos (rojo sirio F3B). Pueden ser aniónicos o catiónicos, formar complejos metálicos o tener carácter de lipocromo (se disuelven en lípidos). Los colorantes azo aniónicos son, sobre todo, monoazoicos con radicales sulfónico y fenólico como auxocromos (Orange G, CI 16230). Un ejemplo de colorante azo catiónico es el Janus verde B (CI 11050). El Sudán negro (CI 26150) y el oil red

FIG URA 4 -5 A) Tinción de rojo picrosirio para revelar las fibrillas de colágeno en el pulmón de rata normal (A) y fibrótica (C). Las imágenes B y D son la misma zona del tejido que A y C, cambiando el microscopio a luz pola­ rizada. (Por cortesía del Dr. Javier Freire, Universidad de Navarra.)

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• Derivados de la antraquinona. Se ob­ tienen a partir de la oxidación del antraceno para constituir anillos quinónicos. Ejemplos de este tipo de colorante son el rojo nuclear rápido (nuclear fast red, C I60760) o el rojo alizarina (C I58005), que se utilizan también como reactivos histoquímicos para el calcio. La alizarina se usa, por ejemplo, como colorante para el hueso en preparaciones completas de animales pequeños. • Derivados del xanteno. Tiene una es­ tructura p-quinonoide con tres anillos y con cromóforos variables. En este grupo se encuentran la fluoresceína sódica (CI 45350), la eosina Y (CI 45380), la eosina B (CI 45400), la pironina B (CI 45010) y la rodamina B (CI 45170). Muchos cromógenos derivados del xanteno son fluorescentes y, de hecho, se usan sobre todo como fluorocromos. En concreto, un isotiocianato de fluoresceína (FITC) se usa muy frecuentemente para marcar de modo fluorescente las proteínas. El espectro óptimo de excitación está en el rango azul-violeta-ultravioleta, y el de emisión, en el verde. • Derivados de la acridina. Son similares a los xantenos, pero con un nitrógeno en vez de un oxígeno como enlace de los anillos bencénicos. Contienen, por tanto, el cromóforo imino (>C=N-). Dos ejem­ plos son la acriflavina (CI 46000) y el na­

ranja de acridina (CI 46005). Este último se usa solo como fluorocromo y tiene la propiedad de emitir fluorescencia en dis­ tinta longitud de onda, así como distinto color cuando se une al DNA o al RNA. Derivados de las iminas quinónicas. Po­ seen dos grupos cromóforos en función de los que se clasifican en derivados oxacínicos: galocianina (CI 51030); azul Nilo (CI 51180); violeta de cresilo y orceína (estos no tienen número CI); y en deriva­ dos tiacínicos: tionina (CI 52000); azul de metileno (CI 52015) (fig. 4-6); azur A, B y C (CI 52005, 52010 y 52002, respecti­ vamente); azul de toluidina (CI 52040) o derivados acínicos rojo neutro (CI 50040). Las tiacinas usadas en histología son todas catiónicas y la mayoría son de color azul o violeta, así como solubles en agua. Derivados de diarilmetanos y triarilmetanos. Los más relevantes son los aminotriarilmetanos, cuyo cromóforo es el grupo imino >C=N-. Entre los más sen­ cillos se encuentran los trifenilmetanos, que son muy utilizados en coloración his­ tológica. La pararrosanilina (CI 42500) es el colorante del que deriva el reactivo de Schiff (v. en el capítulo 5 los apartados «Técnica de PAS» y «Feulgen») des­ pués del tratamiento con ácido sulfuroso. Para producir el reactivo de Schiff se usa pararrosanilina pura o fucsina básica, que es una mezcla de pararrosanilina y

FIGURA 4 -6 A ) Tinción d e azul de m etileno (tiacina catiónica) d e un corte semifino de glándulas gástricas de renacuajo. B ) Se m uestra la m ism a región e n u n corte fino seriado al m icroscopio electrónico. (Por cortesía del Dr. Jordi Rovira y la Dra. A na Cristina Villaro, Universidad de Navarra.)

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new fuchsine (CI 42520) otro trifenilmetano. En la familia de trifenilmetanos también se encuentra el cristal violeta (CI 42555), el fast green (CI 42053), el verde de metilo (CI 42585) o la fucsina ácida (CI 42685), que es un derivado ácido de la pararrosanilina. El azul de Coomasie brillante (CI 42660), que se usa para teñir proteínas en geles de electroforesis, es un colorante amónico también derivado del trifenilmetano. • Derivados de las ftalocianinas. Como el azul alcián 8G (CI 74240) o el luxolfast blue (CI 74180). Las ftalocianinas con­ sisten en un sistema tetramérico en ani­ llo de cuatro moléculas derivadas del anillo bencénico o-quinonoide alrededor de un átomo de cobre, que recuerda al anillo hemo de la hemoglobina. Se trata de una estructura de gran estabilidad fisicoquímica. • Flavonoides. Como la hematoxilina (hemateína) (CI 75290) o la brasilina (brasileína) (CI 75280). El cromógeno es la estructura flavona. El grupo incluye colo­ rantes naturales y artificiales. La hemateína y la brasileína son los derivados colorea­ dos que se producen tras la oxidación de la hematoxilina y la brasilina, que son los compuestos de tipo flavonoide que ocurren en la naturaleza (v. fig. 4-4). Como resumen, a modo de ejemplo, de lo que hemos revisado respecto a las caracterís­ ticas de los colorantes, la figura 4-7 muestra un colorante, el rojo nuclear rápido (nuclear fa st red, CI 60760), para ilustrar la presencia

Rojo nuclear

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Cromóforos

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FIGURA 4 -7 Estructura química general del colorante antraquinónico ro jo n uclear (C I 60760) en la que se señalan sus dos grupos cromóforos y cuatro auxocromos.

de grupos cromóforos y auxocromos. Como hemos mencionado anteriormente, el rojo nuclear es un derivado de la antraquinona. Se trata de un colorante amónico que tiñe de rojo los núcleos por su reactividad con proteínas básicas nucleares (histonas). El término «rojo nuclear» se aplica a veces erróneamente a otro colorante, el rojo neutro (neutral red, CI 50040) que es un colorante acínico catiónico de propiedades tintoriales completamente diferentes.

Glosario de términos relacionados con las tinciones Antes de pasar a describir algunas de las tinciones más frecuentes, presentamos un glosario de términos importantes en la ter­ minología histológica relativa a las tinciones: • Mordiente: reactivo que aumenta la reac­ tividad del tejido estableciendo una interacción tejido-colorante. Existen mordientes de muy diversa naturaleza, pero los más importantes son: iones me­ tálicos y ciertos ácidos como los ácidos fosfotúngstico y fosfomolíbdico; sus­ tancias que favorecen la oxidación del tejido, como el 0 s 0 4 o el permanganato potásico y las sales de alumbre. • Alumbre: se trata de un tipo de reactivo utilizado en los procesos de tinción. Es­ tá constituido por una sal doble de sul­ fato de un metal trivalente y otro mo­ novalente. Generalmente, los metales son aluminio y potasio o amonio (NH4); aunque el aluminio también puede ser sustituido por hierro, cromo, wolframio o molibdeno. El alumbre modifica el colorante añadiéndole grupos auxocro­ mos y confiriéndole un carácter muy básico. • Coloración indirecta en un tiempo: aque­ lla en la que el tratamiento del tejido con el colorante y el mordiente se realiza si­ multáneamente en una misma solución. A la mezcla de colorante y mordiente en algunos libros de histología clásicos tam­ bién se le denomina «laca» (p. ej., laca de hematoxilina), aunque este término se está dejando de usar.

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• Coloración indirecta en dos tiempos: cuando colorante y mordiente actúan separadamente. • Tinción progresiva: tinciones en las que colorantes y mordientes se aplican siguiendo una secuencia definida y bajo un estricto control de los tiempos, para lograr una intensidad determinada de tinción. • Tinción regresiva: aquella en la que pri­ mero se sobrecolorea y, posteriormente, se elimina el exceso de colorante a través de un proceso denominado «diferencia­ ción». • Diferenciación: propio de las tinciones de tipo regresivo, consiste en eliminar el exceso de colorante. Con frecuencia es ne­ cesario, incluso, controlar la decoloración al microscopio para obtener la intensidad deseada de tinción. Los principales agentes diferenciadores son disoluciones alcohó­ licas de ácidos o álcalis, etanol, acetona, mordientes en solución, tampones o agen­ tes aclaradores.

típico teñido con H-E, los núcleos aparece­ rán teñidos de azul, y el citoplasma y la ma­ triz extracelular, de rosa. En el caso de que la fijación sea de buena calidad, mediante la combinación de la hematoxilina y la eosina se puede conseguir un detalle morfológico muy bueno; por ejemplo, se distingue muy bien la distribución de la heterocromatina dentro del núcleo; en el caso de las células de gran actividad de síntesis de proteínas, se puede ver el citoplasma azulado, por efecto de los polirribosomas que se tiñen con la hematoxilina (basofilia citoplasmática); en cortes finos y de buena calidad de células secretoras de proteínas teñidos con H-E se puede intuir la zona Golgi por la ausencia de tinción (se habla entonces de «zona Golgi negativa»). Es decir, en condiciones óptimas, la tinción de H-E puede revelar detalles mor­ fológicos y funcionales muy relevantes de la célula. La hematoxilina sin eosina es también útil como colorante de contraste en muchos procedimientos inmunohistoquímicos, de hi­ bridación in situ, etc.

Hematoxilina: tipos TINCIONES MÁS UTILIZADAS Hematoxilina-eosina Se trata de una tinción general, ya que tiñe todas las estructuras tisulares. Contiene un colorante para las estructuras ácidas como el DNA y RNA (hematoxilina-alumbre de hemateína) y otro colorante ácido para el citoplasma y estructuras extracelulares de carácter básico (eosina). Es la tinción más utilizada en morfología y es compatible con prácticamente todas las fijaciones. Existen diferentes tipos de hem atoxilina-eosina (H-E) en función de la hematoxilina utilizada y del mordiente. La hematoxilina se usa des­ de hace al menos un siglo y en la actualidad sigue siendo la tinción de rutina en la des­ cripción básica de la morfología de un tejido y para el diagnóstico anatomopatológico. La hematoxilina (después de ser oxidada y combinada con el mordiente) tiñe los ácidos nucleicos de tonos diversos de azul-violeta, en función del protocolo utilizado. La eosina tiñe de rosa las proteínas básicas del cito­ plasma y del medio extracelular. En un corte

La hematoxilina se extrae del parénquima del tallo del árbol Haematoxylon campechianum. La molécula de hematoxilina es incolora y requiere ser oxidada para convertirse en una molécula coloreada que entonces recibe el nombre de «hemateína» (fig. 4-8). La hematoxilina puede oxidarse de forma tanto natural como artificial. De manera na­ tural, se deja al aire durante varias semanas e incluso meses y se oxida por efecto del aire y de la luz; es un proceso llamado «madura­ ción» (esta hematoxilina adquiere un color muy intenso que se mantiene durante largo tiempo). Los protocolos de tinción con hema­ toxilina de Ehrlich y de Heidenhain utilizan hematoxilina oxidada naturalmente. De forma artificial, se le añade un oxidante químico (hematoxilina de Harris [HgO]; hematoxilina de Mayer [NaI03]). Este tipo de oxidación artificial, que es el más utilizado actualmente, suele ser instantáneo, pero presenta algunas desventajas, como una menor vida media, problemas de hiperoxidación, etc. La hema­ teína posee poca afinidad por los tejidos; por ello las hematoxilinas requieren siempre de

C apítulo | 4 Técnicas de tinción en histología

FIG U RA 4 -8

Oxidación de la hem atoxilina natural (incolora) a la hemateína (molécula coloreada).

un mordiente, que generalmente consiste en sales de aluminio o, en casos más especiales, hierro, cobre o plomo. El color de la tinción cambia en función del mordiente utilizado; por ejemplo, el cobre da un color verde azulado, y el hierro, una coloración oscura negruzca. Hay más de 40 protocolos distintos para la tinción de hematoxilina, que difieren en el método de oxidación, la concentración del colorante, el mordiente, su carácter pro­ gresivo o regresivo, etc. En general, la mayor parte de las hematoxilinas son tinciones pro­ gresivas, donde la coloración depende del tiempo de incubación con la hematoxilina y de su concentración; ejemplos de este ti­ po de tinción son la hematoxilina de Gill, la de Mayer y la de Weigert. Las hematoxili­ nas de tipo regresivo, como las de Harris o Heidenhain, requieren de una diferenciación tras la coloración en la que se elimina el ex­ ceso de colorante mediante una solución lige­ ramente ácida. Los resultados de cada proto­ colo son diversos en cuanto a afinidad por las estructuras que se tiñen, la intensidad y la co­ loración, etc. A continuación mencionamos diferentes tipos de tinción de hematoxilina en función del tipo de mordiente. • Alumínica: utilizan sales de aluminio como mordiente. Algunos ejemplos son los proto­ colos de hematoxilina de Gill, Ehrlich, Ha­ rris y Mayer. La solución de hematoxilina oxidada (hemateína) e iones Al+3 forman el reactivo de la tinción, la hemateína alu­ mínica, que se denomina también «hemalumbre». Aunque este es propiamente el colorante, al referirse a él normalmente se

utiliza el nombre de su precursor, la hema­ toxilina. Este reactivo se usa casi umver­ salmente para teñir núcleos celulares. Los protocolos basados en la hemateína alumí­ nica pueden ser progresivos o regresivos. Por ejemplo, el protocolo de hematoxilina de Gills es progresivo, y el de Harris, re­ gresivo. En general, la concentración de hemalumbre que se usa en la coloraciones progresivas es mayor, y en las regresivas, menor. Las hematoxilinas alumínicas son sensibles al ácido. La diferenciación en el caso de las hematoxilinas alumínicas re­ gresivas se consigue tratando las secciones ya teñidas con alcohol al 70 o 95%, al que se añaden unas gotas de ácido clorhídrico (la denominada «solución alcohol-ácido» de los protocolos). La hemateína alumínica cambia su color de rojizo original al azul a pH mayores de 6. Como el color que se busca para la tinción histológica de H-E es el azulado, las secciones se lavan des­ pués de teñir con una solución débilmente alcalina (generalmente con carbonato de litio disuelto en agua) o, simplemente, con agua del grifo (que suele tener un pH más alcalino que el hemalumbre). Este proceso es el que se denomina «azulamiento de la hematoxilina». Para la tinción de H-E es necesario que la hematoxilina esté azulada, de modo que exista un buen contraste del azul de la hematoxilina con el color rosa de la eosina. • Férrica: utiliza sales de hierro. Ejemplos de este tipo de hematoxilina son los proto­ colos de hematoxilina férrica de Weigert

Técnicas en histología y biología celular

o de Heidenhain. Estas hematoxilinas tienen un color azulado intenso, casi ne­ gro, y son muy resistentes al ácido, por lo que se emplean, por ejemplo, en las tinciones tricrómicas, que requieren pasos en ambientes ácidos para los colorantes sucesivos. La de Weigert se suele usar como tinción progresiva para revelar nú­ cleos. La de Heidenhain es una tinción regresiva que se diferencia bajo micros­ copio usando una solución de iones fé­ rricos, la misma que se emplea como mordiente. Esta modalidad de Heidenhain permite revelar detalles finos intracelulares, aunque requiere fijadores especiales como el fijador de Altmann (0 s 0 4 y una sal crómica). También se puede utilizar como colorante aislado para estudiar la cromatina y las diversas fases de la mitosis en el meristemo de las plantas. • Fosfotúngstica (tungsténica): utilizada para teñir la estriación del músculo, cé­ lulas de la glía, cilios, etc. • Plúmbica: para el estudio de glándulas endocrinas.

FIG U RA 4 -9

Estructura química de la eosina Y.

molécula de eosina (fig. 4-9); y la eosina B, con dos átomos de bromo por molécula de eosina. La eosina es una molécula autofluorescente por sus átomos halógenos y es soluble en agua y en alcoholes, lo que le confiere mucha versatilidad para la tinción histológica. Ade­ más, presenta un cierto carácter ácido, por lo que interacciona con las proteínas básicas del citoplasma, que adquiere un cierto tono rosa. En la figura 4-10 puede observarse la colora­ ción que proporcionan a los tejidos algunas de estas tinciones de hematoxilina o H-E.

Eosina

Tricrómicos

La eosina es un derivado halogenado del xanteno. Existen dos tipos de eosinas en función del número de átomos de bromo que posean: la eosina Y, con cuatro átomos de bromo por

Las tinciones tricrómicas persiguen resaltar fibras colágenas del tejido conjuntivo respecto del resto de estructuras tisulares (músculo, células epiteliales, etc.), que se colorean en

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FIGURA 4 -1 0 A ) Tinción d e u na arteriola con una hematoxilina-eosina (H-E) convencional. B) Corte de piel de ratón teñido con H-E. C ) Tinción de meristemo de raíz de cebolla con hematoxilina férrica. Se observan figuras m itóticas y núcleos teñidos p o r la hem atoxilina férrica. (D epartamento d e Histología y A natom ía Patológica, Universidad de Navarra.)

C apítulo | 4 Técnicas de tinción en histología

Por tanto, un tricrómico ha de poseer al menos: un colorante nuclear, como la hema­ toxilina férrica; un colorante amónico para las fibras, como el azul de anilina o el verde luz y otro colorante que tiña los citoplasmas y otras estructuras, como, por ejemplo, el ácido pícrico, la fucsina ácida, el ponceau de xilidina o el naranja de metilo. Son ejem­ plos de tinciones tricrómicas el tricrómico de Masson y el de Van Gieson. El primero de estos (fig. 4-11) es uno de los más sencillos y más frecuentemente utilizados. Además del colorante nuclear (hematoxilina férrica de Weigert), utiliza el colorante aniónico fuc­ sina ácida, otro colorante rojizo, que puede ser el colorante azo ponceau 2R (también llamado ponceau de xilidina, CI 16150) y un colorante aniónico que tiña las fibras de colágeno, que puede ser azul de anilina o fast green. En general, los fijadores alcohólicos no se recomiendan para la tinción tricrómi­ ca, que es totalmente incompatible con el glutaraldehído como fijador. Los tricrómicos funcionan mejor con mezclas fijadoras que contienen mercurio (retirando el metal con yodo y tiosulfato antes de la tinción), pe­ ro también funcionan en tejidos fijados en Bouin y formol. De hecho, como ya hemos señalado en el capítulo 3, en el apartado «Otros fijadores», los fijadores basados en las sales de mercurio se utilizan cada vez menos por la toxicidad y los problemas de residuos asociados a este metal. La calidad de la tinción tricrómica en material fijado en formol mejora si antes de hacer la tin­ ción el corte es tratado durante unas horas

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publicación MASSON. Fotocopiar:

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tonalidades diversas. Los tricrómicos contie­ nen siempre un colorante nuclear y al menos dos colorantes amónicos que se utilizan en asociación con una molécula de tipo heteropoliácido. Los dos heteropoliácidos usados en las tinciones tricrómicas y otras tinciones his­ tológicas son el ácido fosfomolíbdico (PMA) y el ácido fosfotúngstico (PTA). Se trata de moléculas coordinadas entre iones molibdato o tungsteno y ácido fosfórico. Los colorantes amónicos se pueden aplicar en conjunción con PTA o PMA, o en pasos sucesivos. El efecto de la asociación entre estos dos tipos de mo­ léculas es la coloración selectiva de las fibras de colágeno por uno de los colorantes amóni­ cos. Ese es precisamente el rasgo peculiar de toda tinción tricrómica: la tinción específica de las fibras colágenas. Además, el cartílago y algunas secreciones mucosas se tiñen del mismo color que el colágeno, pero menos intensamente. El resto de las estructuras se teñirán de color diverso en función de que haya uno o dos colorantes más en el protocolo. Por ejemplo, si, además del colorante nuclear y el colorante amónico que tiñe el colágeno, hay dos colorantes más, uno de ellos teñirá los eritrocitos, y el otro, los citoplasmas de otros tipos celulares. En el mecanismo de colora­ ción selectivo de las fibras de colágeno tiene un papel crítico la acción de los heteropoliácidos PMA o PTA, que presentan la propiedad de unirse a proteínas y aminoácidos pero no a carbohidratos. Las fibras de colágeno unen cantidades muy grandes de PMA. Algún autor ha llamado a los heteropoliácidos «colorantes amónicos sin color».

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FIGURA 4-11 S ecciones de epidídim o (A ) y glándulas sudoríparas (B) teñidas con tricróm ico de M asson. (Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.)

Técnicas en histología y biología celular

en mezclas fijadoras, como Bouin, Zenker o formol-zinc. Puesto que los colorantes para fibras funcionan en medios ácidos, las hematoxilinas empleadas en las coloraciones tricrómi­ cas han de ser resistentes a los mismos, como es el caso de la hematoxilina fénica. El mecanismo de coloración de los tri­ crómicos no está totalmente establecido. Algunos autores afirman que la coloración se basa no solo en la acción de los heteropofiácidos sino también en el hecho de que la malla molecular formada por el entrecruzamiento de proteínas durante la fijación es diferente en las distintas estructuras. En aquellas es­ tructuras, como la fibra de colágeno, con una composición de aminoácidos muy determina­ da y una disposición espacial muy compacta de las proteínas, la malla proteica será más «cerrada» que en otras estructuras del tejido. Según esta hipótesis, los colorantes de menor tamaño molecular son capaces de penetrar allí donde los de mayor peso molecular no lo hacen, por lo que se produce una coloración diferencial.

Giemsa Es una tinción general que se emplea mucho en hematología (fig. 4-12A), ya que permite distinguir, por su coloración, los gránulos de los diferentes leucocitos polimorfonucleares. Aunque se utiliza muy frecuentemente en

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extensiones celulares, también puede usarse en cortes de tejidos. Contiene una mezcla de colorantes catiónicos (azul de metileno, azur A o B) y amónicos (eosina). Se emplea también en técnicas para demostrar células endocrinas. Diversas casas comerciales ven­ den la mezcla de colorantes de Giemsa lista para usar, lo que ha facilitado la estandari­ zación de este protocolo. Una modificación con dos colorantes (azur B y eosina Y), lla­ mada «método estandarizado RomanovskiGiemsa», está también aceptada por el Comi­ té de Estandarización en Hematología (CEH). Este método utiliza colorantes individuales puros, también disponibles comercialmente, aunque es más costoso.

Papanicolaou Es una coloración histológica empleada, principalmente, para extensiones citológicas, como, por ejemplo, en las pruebas citológicas que se llevan a cabo en el con­ texto de la detección precoz del carcinoma de cérvix. Además, esta tinción se utiliza para otros especímenes citológicos de flui­ dos biológicos, como esputo, orina, líquido cefalorraquídeo, aspirados de aguja fina, etc. Es una técnica policrómica que contiene una mezcla de colorantes que no produce sobrecoloración. En las formulaciones ordinarias, la tinción de Papanicolaou (fig. 4-12B) tiene cuatro colorantes: uno nuclear, normalmente

o.

5 ai FIGURA 4 -1 2 A ) Tinción d e una extensión de sangre m ediante el m étodo de Giemsa. B) Detalle d e u n frotis vaginal humano en el día 13/14 del ciclo m enstrual teñido mediante el m étodo de Papanicolaou. E l diferente color de las células se debe a diferencias en la composición d e citoqueratinas. (Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.)

C apítulo | 4 Técnicas de tinción en histología

una hematoxilina alumínica; eosina Y, que tiñe de rosa los citoplasmas de las células epiteliales, los eritrocitos, etc.; el verde brillante (light green), que tiñe el moco, y un colorante que tiñe la queratina (Orange G). Primero se tiñe la cromatina con la he­ matoxilina alumínica; luego, el Orange G tiñe el resto de material celular no teñido. A pH superior a 3, la eosina y el verde bri­ llante desplazan al Orange G de todas las estructuras celulares excepto de algunos tipos de queratinas. Los citoplasmas que­ darán teñidos de rosa y el verde brillante se mantendrá unido al moco y el color de este cambiará a un tono más azulado. El pH óptimo para la competición selectiva entre todos los colorantes es de 6,5.

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TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS Aunque ya hemos indicado algunos ejemplos en las secciones anteriores, en este apartado nos referiremos a algunas otras tinciones que se usan para el estudio de tejidos concretos. Los colorantes y reactivos empleados, así como los protocolos específicos para la pre­ paración de muchas de estas tinciones pueden encontrarse en la bibliografía. Solo indica­ remos aquí las tinciones más comunes o los nombres de los colorantes según el tejido de aplicación: • Tejido nervioso. Para el soma neuronal y las prolongaciones son muy útiles las im­ pregnaciones argénticas que se describi­ rán en la siguiente sección, como la técni­ ca de Golgi o la de O s04-yoduro de zinc; la técnica argéntica de BielschowskyGross para las neurofibrillas, y la de 0 s 0 4 y la de Klüver-Barrera para las fi­ bras mielínicas. Para los grumos de Nissl del soma neuronal se utiliza el azul de toluidina, el verde de metilo-pironina o el violeta de cresilo. Para la neuroglia se usan también técnicas de impregna­ ción, en concreto las de Río-Hortega y Golgi-Río-Hortega. • Tejido conjuntivo. Ya hemos indicado el uso de tinciones tricrómicas para detectar las fibras de colágeno. Otras tinciones

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•

para fibras del tejido conjuntivo em ­ plean el picrocarmín (azul), el verde bri­ llante (verde), el azul de anilina (azul), el rojo sirio o la fucsina ácida (rojo). Para demostrar fibras reticulares se usa una técnica de impregnación argéntica llamada «técnica de la reticulina». Para teñir fibras elásticas, se usa la técnica de Weigert de resorcina-fucsina, la tinción de orceína, la tinción de Verhoeff o la técnica de aldehido-fucsina de Gomori. Músculo estriado. La estriación propia de las fibras musculares estriadas y car­ díacas se observa muy nítidamente con la tinción de hematoxilina fosfotúngstica ácida (PTAH) Hueso. El hueso es un tejido especial que se puede estudiar de diversas mane­ ras. Como hemos visto en el capítulo 3, apartado «Descalcificación», la mayor parte de los protocolos exigen des­ calcificación, pero también se pueden conseguir preparaciones finas de hueso mediante desgaste. Para la coloración se puede usar la solución de Jenkins, que incluye un paso conjunto para fijar y descalcificar (con una solución que con­ tiene ácido clorhídrico, ácido acético, cloroformo y alcohol), y la tinción de las células es con el colorante tionina. El hueso compacto también se puede es­ tudiar mediante técnicas sin colorante (tinción negativa), que se describen más adelante (fig. 4-13). Hígado. Además de la H-E y alguna tinción tricrómica, los análisis de mues­ tras hepáticas pueden incluir una im ­ pregnación argéntica para visualizar reticulina, así como una técnica de PAS y PAS-diastasa. También se lleva a cabo la tinción del azul de Perls para demostrar hemosiderina acumulada en las células de Kupffer por causas variadas (hemolisis, transfusiones, etc.) o en los hepatocitos por enfermedades genéticas que afecten al metabolismo del hierro. Riñón. En el caso del riñón, se suele hacer una H-E, un PAS, un tricrómico y una técnica de metenamina de plata para examinar con detalle todos los compar­ timentos del tejido renal, con especial

Técnicas en histología y biología celular

FIGURA 4 -1 3 Canalículos calcóforos y lagunas d e los osteocitos revelados m ediante coloración negativa. L a preparación es un corte de hueso p o r desgaste y n o tiene tinción. L as zonas oscuras (lagunas y canalículos) están ocupadas por aire y se produce u n efecto d e contraste óptico que las hace visibles al microscopio. (Departamento de Histología y A natom ía Patológica, Universidad de Navarra.)

atención a las membranas basales, los depósitos, etc. Piel. Los análisis dermatopatológicos sue­ len incluir una técnica de PAS y técnicas para fibras elásticas. Se utiliza también en ocasiones la técnica de argentafinidad de Masson Fontana, que permite distinguir los acúmulos de melanina. La técnica de PAS permite reconocer y destacar el es­ pesor de la membrana basal en el diagnós­ tico diferencial de algunas enfermedades, como el lupus eritematoso. Microorganismos en diversos órganos. Existen numerosas tinciones para detec­ tar distintos tipos de microorganismos. Algunos ejemplos son la visualization de hongos mediante PAS o metenamina de plata de Grocott; la coloración de Gram para tinción de bacilos y cocos diversos; la coloración mediante la técnica de ZiehlNeelsen de bacilos, que, por las propieda­ des biológicas de su pared, resisten la de­ coloración con alcohol-ácido después de la tinción con colorantes básicos y por eso se denominan «alcohol-ácido resistentes», o la identificación de bacilos Helicobacter pylori en el estómago mediante la técnica de Giemsa, que también se utiliza para vi­ sualizar distintos tipos de protozoos, como Toxoplasma, Leishmania, Plasmodium, Trichomonas, Giardia, etc.

TINCIONES SUBCELULARES En microscopía óptica también podemos re­ saltar e identificar determinados orgánulos mediante tinciones más o menos específicas y diferenciales. Más adelante, en el capítulo 8 sobre microscopía confocal, veremos que existen marcadores fluorescentes específicos de orgánulos que incluso se pueden introducir en células vivas para visualizar la dinámica de dichos orgánulos. De hecho, cuando se quiere estudiar las propiedades, alteraciones, etc. de algún orgánulo, la técnica de elección se suele basar en microscopía de fluores­ cencia confocal. Actualmente, se utilizan muy frecuentemente sondas fluorescentes para mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplasmático y lisosomas, que se han de­ sarrollado aprovechando el microambiente específico de estos orgánulos. También hay marcadores fluorescentes para los componen­ tes del citoesqueleto, estructuras nucleares, etc. Aunque estos son los marcadores de or­ gánulos de uso habitual, desde más antiguo se usaban también tinciones que colorean de forma más o menos específica algunos de los orgánulos, para su uso en microscopía convencional de luz. A continuación, y a modo de ejemplo, se citan algunos de los métodos de tinción más utilizados para la detección de estructuras subcelulares en el ámbito del microscopio óptico convencional.

C apítulo | 4 Técnicas de tinción en histología

• Núcleo. En cortes, hematoxilina férrica, safranina-verde luz o verde de metilo. En extensiones cromosómicas (prepara­ ciones de cromosomas metafásicos tras choque osmótico y aplastamiento celular; por ejemplo, para preparar cariotipos): carmín acético u orceína acética. • Nucléolo. Retículo endoplasmático rugo­ so, grumos de Nissl: azul de toluidina, vio­ leta de cresilo y verde de metilo-pironina (tiñen DNA y RNA, respectivamente; fig. 4-14). • Mitocondrias. Las mitocondrias se pueden teñir en células vivas con el verde Janus

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FIGURA 4 -1 4 Tinción de neuronas ganglionares con verde d e m etilo-pironina. L a pironina tiñe e n rojo los nucléolos y la basofilia en grum os q ue corresponde a los paquetes d e retículo endoplasmático rugoso, donde hay una gran acumulación de ribosomas. (Departamento de Histología y A natom ía Patológica, U niversidad de Navarra.)

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Avidina Ac primario

F IG U R A 6-8

Ac secundario biotinado

Esquema de la técnica de los complejos avidina-biotina (ABC).

(Estrept)av¡dina-peroxidada

y de Ac secundario (fig. 6-10). La princi­ pal ventaja de este sistema, al no utilizar biotina, es la eliminación del mareaje inespecífico debido a la biotina endógena. Otras ventajas son el aumento de la sensibilidad y la reducción del número de pasos de la téc­ nica respecto a otras convencionales (ABC, LSAB). La principal desventaja es que este método es más caro. Varias compañías han comercializado sistemas de detección basados en polímeros (p. ej., En Vision™, PowerVision™, ImmPRESS™).

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Métodos de amplificación con tiramida F IG U R A 6-9 M étodo L SAB: los com plejos estreptavidina-peroxidasa se unen a la biotina del antisuero secundario. Ac, anticuerpo.

a la biotina que marca los Ac secundarios pue­ de ser mejor. La presencia de gran cantidad de biotinas unidas al Ac secundario (hasta 150) hace que, a su vez, se puedan unir un gran número de complejos estreptavidinaperoxidasa, lo que amplificará la señal.

Métodos poliméricos Consisten en la utilización de un polímero que lleva unidas varias moléculas de enzima

Estas técnicas reciben varios nombres: am­ plificación de la señal con tiramida (TSA, tyramide signal amplification), amplificación catalizada de la señal (CS A, catalyzed signal amplification) o deposición catalizada de reportero (CARD, catalyzed reported depo­ sition). La amplificación con tiramida se basa en la deposición por acción de la peroxidasa de un elevado número de moléculas de tirami­ da marcadas (se puede utilizar biotina o un fluorocromo). La tiramida es un compuesto fenólico que, por acción de la HRP, se con­ vierte en un radical libre altamente reactivo

Técnicas en histología y biología celular

- Complejo polímero-Ac secunda rio-peroxidasa

que se une a compuestos aromáticos neos en e“, tales como la tirosina y el triptófano de las proteínas. En definitiva, un elevado número de moléculas marcadoras se unirán en el lugar de unión de la HRP y, por tanto, en aquel en el que se encuentra el Ag diana. La HRP se puede introducir en la técnica bien conjugada al Ac secundario o bien en los complejos ABC o estreptavidina-HRP. La detección y la visualización pos­ teriores de la tiramida depositada se pueden realizar de distintas maneras, en función de la molécula marcadora que se haya utilizado (biotina o fluorocromo) o del tipo de mareaje deseado (enzimático o fluorescente): • Tiramida-biotinada. Tras la deposición de la tiramida, se trata de detectar la biotina, tal y como se ha comentado en los métodos que se basan en el uso de esta molécula: se añaden complejos ABC o estreptavidina-HRP (o fosfatasa alcalina). Posteriormente, se revela con el cromógeno adecuado (fig. 6-11). La uti­ lización de biotina tiene el inconveniente de la obtención de mareaje inespecífico debido a la biotina endógena. • Tiramida-fluoresceinada. Tras la deposi­ ción, el resultado puede ser visualizado directamente al microscopio de fluores­

cencia. Más habitual es utilizar un Ac antifluoresceína marcado y amplificar más la señal. En este caso, se puede optar por continuar con un mareaje fluores­ cente o cambiar a un mareaje enzimático (fig. 6-12). Respecto al anterior, este método tiene la ventaja de no utilizar biotina, con lo que se evitan los proble­ mas asociados de tinción inespecífica, así como de ser más sensible. Se estima que la amplificación con tiramida puede tener una sensibilidad de hasta 100 ve­ ces superior al método estándar que emplea ABC (cuadro 6-2), lo que permite utilizar mayores diluciones de los antisueros pri­ marios o incluso marcar Ag que no resultan detectables por otras técnicas IHQ. No obs­ tante, la complejidad y el número de pasos de estos métodos también son mayores, así como también lo es la posibilidad de obtener mareaje inespecífico. Por ello, estas técnicas de amplificación con tiramida se reservan para determinados casos. En la figura 6-13 se presentan ejemplos de la detección de Ag de localización nuclear (Ki67, marcador de proliferación celular), de membrana plasmática (E-cadherina) y citoplasmática (factor de crecimiento del endotelio vascular).

Capítulo | 6 Técnicas inmunohistoquímicas

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FIGURA 6-19 Control de adsorción sobre cortes seriados. A) Uno de los cortes se incubó con un antisuero frente al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). B ) El otro corte se incubó con el antisuero primario previamente adsorbido con el péptido correspondiente. Se puede observar que, en este caso, no se detecta inmunomarcaje. (Por cortesía de la Dra. Jackeline Agorreta, Universidad de Navarra.)

exactam ente la m ism a que la que se ha utilizado para generar el antisuero. La forma más adecuada de determinar la especificidad de un antisuero es mediante western blot o inmunoprecipitación. También pueden realizarse controles de adsorción cruzada cuando existe la sospecha de que el antisuero reconoce otras moléculas distintas al Ag de interés y existe, por tanto, reacción cruzada. Estos controles consisten en realizar la preincubación del antisuero es­ pecífico con las moléculas con las que puede producir una reacción cruzada.

Controles del método: controles positivo y negativo Antes de aplicar la técnica IHQ sobre un tejido nuevo, conviene observar la preparación, ya que pueden existir pigmentos en el tejido o bien autofluorescencia, lo cual puede llevar a reali­ zar una interpretación errónea de los resultados.

Control positivo Consiste en utilizar un tejido o una mues­ tra que contenga el Ag de interés y que, además, haya sido procesado de la misma

forma (fijación, inclusión). Debe incluirse un control positivo para cada antisuero primario y realizar la técnica IHQ al mismo tiempo que en las preparaciones problema. Si no se detecta inmunotinción en el control positivo, será debido a algún error en la realización de la técnica (omisión de algún paso, diluciones erróneas, reactivos en mal estado, etc.) y, por tanto, no podremos valorar el resultado obtenido en las preparaciones en estudio. En tal caso, deberá comprobarse todo el proce­ dimiento hasta obtener un mareaje óptimo en el control positivo.

Control negativo Consiste en realizar la técnica IHQ omitiendo alguno de los pasos, como en los siguientes ejemplos: • Realizar el proceso de revelado sobre la preparación sin realizar ninguno de los pasos previos. Se pondrá de manifiesto la presencia endógena (o el bloqueo parcial) de la enzima utilizada como marcador. • Omitir el antisuero primario y sustituirlo por suero no inmune (o preinmune) de la misma especie en la que se ha obtenido

Capítulo | 6 Técnicas inmunohistoquímicas

el primario. En el caso de los antisueros monoclonales, también se puede sustituir por un antisuero primario no reactivo (frente a un Ag que con seguridad no expresa en ese tejido). En cualquier ca­ so, el antisuero no reactivo y el suero no inmune deben ser del mismo isotipo que el antisuero primario específico frente al Ag de interés. • Omitir el antisuero secundario o los complejos (ABC, LSAB, etc.) según el método IHQ utilizado.

BIBLIO GRAFÍA Burry RW . Specificity controls for immunocytochemical methods. J Histochem Cytochem 2000;48(2): 163-5. Peinado M , Pedrosa JA, Rodrigo J. Avances en inmunocitoquímica y técnicas relacionadas. Jaén: Univer­ sidad de Jaén; 1996. Polak JM, Van Noorden S. Introduction to immunocytochemistry. 2nd ed. New York: Springer-Verlag; 1997. Ramos-Vara JA. Technical aspects o f immunohistochemistry. V et Pathol 2005;42(4):405-26. Shi SR, Gu J, Taylor CR. Antigen retrieval techniques: inm unohistochem isty and m olecular m orphology. Natick: Eaton Publishing; 2000.

C apítulo | 6 Técnicas inmunohistoquímicas

125.e1

A ctividades 1. Disponemos de dos antisueros prima­ rios, uno policlonal obtenido en conejo y otro monoclonal obtenido en ratón. Está descrito que ambos anticuerpos (Ac) re­ quieren, para material fijado en formol e in­ cluido en parafina, recuperación antigénica con calor en una solución de Tris-EDTA (TE) a pH 9. Diseñe un protocolo adecuado para la realización de una técnica de mareaje enzimático doble sobre el mismo corte. Respuesta: En primer lugar, el doble mareaje inmunoenzimático será adecuado si los dos antígenos (Ag) que vamos a detectar tienen una localización distinta (diferentes células o compartimentos celulares). Si no es así, no será adecuado aplicar mareaje inmunoenzimático, sino que habría que re­ alizar doble inmunofluorescencia. Vamos a suponer que tienen distinta lo­ calización. Los primeros pasos son indepen­ dientes del protocolo elegido: desparafinar, hidratar los cortes, realizar la recuperación antigénica y, en el caso de utilizarla como enzima marcadora, bloquear la peroxidasa endógena. Hay varias posibilidades, pero lo más sencillo sería aplicar un método polimérico, ya que no tenemos que tener en cuenta la posible existencia de biotina endógena. Podemos elegir un secundario polimérico conjugado con peroxidasa y el otro con fosfatasa alcalina — lo mejor es que estén obtenidos en la misma especie, por ejemplo, en cabra— y revelar cada uno con cromógenos que resulten en precipita­ dos de distinto color que contrasten bien entre sí. También podríamos utilizar los dos antisueros secundarios poliméricos conju­ gados con peroxidasa (o fostatasa alcalina) y elegir cromógenos adecuados, como en el caso anterior. En este caso, la tinción doble debería realizarse de forma secuencial. Asimismo, podríamos utilizar métodos basados en la biotina. En tal caso, tendría­ mos que bloquear previamente la endóge­ na, sobre todo teniendo en cuenta que la recuperación antigénica con calor la pone de manifiesto especialmente. Si los dos Ac se detectan utilizando biotina, habría que realizar un mareaje secuencial. Otra posibilidad es una combinación de métodos, como uno con complejos avidina-biotina (ABC) — para el primario de

conejo, con bloqueo previo de la biotina endógena— y otro con fosfatasa alcalinaanti-fosfatasa alcalina (APAAP) — para el primario de ratón— . En cualquier caso, la mejor opción para evitar la unión de alguno de los reactivos utilizados para marcar un Ac primario con los empleados para el otro es realizar el mareaje secuencial. Además, deben llevarse a cabo los controles adecuados. 2. Nos proponemos detectar un Ag en un determinado tipo de tumor que se ex­ presa en pequeñas cantidades y dispone­ mos de un Ac frente a dicho Ag. Hemos puesto a punto las condiciones para el inmunomarcaje en otro tejido, en el que hay más expresión utilizando un método polimérico. Sin embargo, aplicando estas mismas condiciones, solo conseguimos obtener un mareaje muy tenue en nuestras muestras de tumor. Diseñe un protocolo con el que se pueda aumentar la señal obtenida teniendo en cuenta que no dis­ ponemos de un microscopio de fluores­ cencia. Respuesta: Ya que el método polimérico utilizado en la puesta a punto no tiene sen­ sibilidad suficiente para detectar el Ag en las muestras de interés, tendremos que aplicar un método de amplificación con tiramida. Si no disponemos de microscopio de fluores­ cencia, se tendrá que realizar un mareaje enzim ático. La mejor opción es utilizar tiramida conjugada con fluoresceína. Con ello, evitamos los posibles problemas de la amplificación de la biotina endógena y, por tanto, del aumento de tinción inespecífica. Además, este método es más sensible que utilizar tiramida-biotina. Tras la incubación con el Ac primario, utilizaremos uno secundario peroxidado. Después, añadiremos la tiramida-fluoresceína y la detectaremos con un Ac anti-fluoresceína. Posteriormente, aplicaremos un método de detección inmunoenzimático, como si de cualquier otro A c primario se tratara (ABC, LSAB, método polimérico, etc.). También podríamos utilizar otro méto­ do para introducir la peroxidasa en la técni­ ca antes de aplicar la tiramida-fluoresceína: ABC, LSAB, etc.

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Técnicas en histología y biología celular

AUTOEVALUACIÓN 1. Un hibridoma productor de anticuerpos (Ac) monoclonales procede de la fusión de: a. Linfocito B y célula tumoral. b . Linfocito T y célula de mieloma. c. Linfocito B y una célula de mieloma. d. Linfocitos B y T. e. Las respuestas a y b son correctas. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: los hibridomas pro­ ceden de la fusión de un linfocito B (produc­ tor de un determinado tipo de Ac) con una célula de mieloma. 2. El antisuero secundario en la técnica de los complejos avidina-biotina (ABC) está marcado con: a. Avidina. b . Peroxidasa. c. Digoxigenina. d. Biotina. e. Fluoresceína. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: la avidina contiene cuatro lugares de unión con la biotina. Los complejos ABC (avidina-biotina-peroxidasa) se conjugan de tal forma que quedan sitios libres en la avidina para unirse a la biotina, molécula a la que se conjuga el antisuero secundario. 3. La región de una molécula a la que se une un Ac se denomina: a. Antígeno (Ag). b . Epítopo. c. Fragmento Fab. d. Fragmento Fe. e. Carrier. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la región de una mo­ lécula que estimula la producción de un Ac y es reconocida por él se denomina «epítopo» o «determinante antigénico». 4. ¿Es posible realizar una técnica inmunohistoquímica enzimática doble utilizando solo peroxidasa? a. No, nunca. b . Sí, si utilizamos dos sustratos de colores distintos y distinguibles. c. Sí, si realizamos la técnica de modo secuencial.

d. Sí, aunque los dos Ag se localicen en las mismas células. e. Sí, si se cumplen las respuestas b y c. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: para realizar una técnica inmunoenzimática doble marcando solo con peroxidasa se requiere que los dos Ag no tengan la misma localización, realizar la detección de ambos de forma secuencial y utilizar para cada uno un sustrato distinto que produzca un precipitado distinguible uno de otro. 5. Indique la respuesta correcta respecto a los procedimientos de recuperación antigénica: a . Consisten únicamente en calentar los tejidos. b. Son efectivos en muy pocos casos. c. Aunque existen varios, el mejor, sin duda, es la digestión enzimática. d. No aportan nada en las técnicas inmunohistoquímicas. e . Requieren optimización. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: un elevado núme­ ro de Ag require la aplicación de técnicas de recuperación antigénica para poder detectar dichos Ag mediante inmunohistoquímica. Los procedimientos son varia­ dos (calor, digestión enzimática, etc.), por lo que hay que optimizar hasta encontrar el más adecuado. 6. Entre los siguientes, el método con menor número de pasos es: a . ABC. b. Amplificación con tiramida. c. Fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina (APAAP). d. Método polimérico. e . LSAB. Respuesta correcta: d. R esp u esta razo n a d a: los m étodos poliméricos tienen dos pasos de incubación (Ac primario y polímero) antes del revela­ do. En el resto de las técnicas indicadas se realizan como mínimo tres incubaciones antes de proceder al revelado de la enzima marcadora.

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7. Una de las ventajas de los Ac policlonales es que: a. Reconocen un solo epítopo de una molécula. b. R econocen varios epítopos de la misma molécula. c. Todos los lotes obtenidos son idén­ ticos. d. Se pueden obtener de forma ilimitada. e. Su producción es cara y laboriosa. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el hecho de que los Ac policlonales reconozcan varios epítopos de la misma molécula hace que sea más pro­ bable detectar el Ag, aunque alguno de sus epítopos esté enmascarado. El resto de ca­ racterísticas indicadas son propias de los Ac monoclonales. 8. La diaminobencidina (DAB) es sustrato de: a. La peroxidasa. b. La fosfatasa alcalina. c. La glucosa oxidasa. d. El oro coloidal. e. La tiramida. Respuesta correcta: a. Respuesta correcta: uno de los sustratos (existen varios) de la peroxidasa es la DAB, con la que se obtiene un precipitado de color pardo. 9. Para detectar un Ag presente en muy pe­ queña cantidad, la técnica que utilizaría es: a. ABC. b. APAAP. c. Amplificación con tiramida. d. LSAB. e. Cualquiera de respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: las técnicas de am­ plificación con tiramida son más sensibles; es decir, son capaces de detectar menos cantidad de Ag que cualquiera de los otros métodos. 10. Un inmunomarcaje doble: a. Es posible aunque los Ac primarios estén obtenidos en la misma especie. b . Es posible solo cuando los Ac primarios están obtenidos en especies distintas. c. Es posible solo con inmunofluorescencia. d. Nunca es posible. e. Es posible solo bloqueando previa­ mente con fragmentos Fab.

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Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: se puede realizar un inmunomarcaje doble incluso con Ac prima­ rios obtenidos en la misma especie, usando tanto técnicas inmunoenzimáticas (mareaje secuencial) como inmunofiuorescencia (será necesario emplear estrategias para evitar la reacción cruzada de los Ac secundarios mar­ cados con fluorocromos distintos). 11. Se ha estudiado la posible localización en el citoplasma de las mismas células de dos moléculas (X e Y). Para ello se ha aplicado una técnica de doble inmunofluorescencia sobre la misma muestra utilizando como antisueros primarios inmunoglobulinas (Ig) de ratón anti-X e Ig de ratón anti-Y. Como antisueros secundarios se han empleado Ig de cabra anti-Ig de ratón marcadas con isotiocianato de fiuoresceína (FITC; verde) e Ig de conejo anti-ratón marcadas con isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC; rojo). Tras analizar las imágenes, se ob­ serva que las mismas células presentan fluorescencia, tanto verde como roja. ¿Se puede asegurar que X e Y se localizan en el citoplasma de las mismas células? ¿Por qué? a . Sí, es lo que se ve. b. No, cada secundario se puede unir a los dos primarios. c. No, deberíam os haber utilizado mareaje enzimático. d. Sí, porque los secundarios están obtenidos en distinta especie. e. Sí, si hemos realizado el mareaje de forma secuencial. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: no podemos saber si X e Y se localizan en las mismas células. Los dos Ac secundarios (cabra anti-ratón y conejo anti-ratón) están obtenidos en distinta espe­ cie, pero reconocen Ig de la misma especie (ratón). Por tanto, los dos Ac secundarios se unirán a los dos Ac primarios y no podremos distinguir las señales de cada Ag. Cada Ag aparecerá marcado con fluorescencia tanto verde como roja. 1 2 .Se ha caracterizado un tumor de riñón mediante inm unofiuorescencia sobre un corte de parafina, utilizando un Ac

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primario frente a un marcador tumoral que no se expresa en riñón normal. Los pasos principales seguidos en la técnica han sido: 1) desparafinación e hidratación del corte; 2) recuperación antigénica con solución de Tris-EDTA (TE) a pH 9 a 95 °C durante 30 min; 3) bloqueo con seroalbúmina bovina (BSA); 4) Ac primario; 5) Ac secundario biotinado; 6) estreptavidina conjugada con Alexa Fluor® 568 (rojo), y 7) montaje en medio acuoso. La muestra se ha observado al microscopio de fluorescencia y, además de las células tumorales, aparecen marca­ dos los túbulos renales normales. ¿Cuál es la razón de que los túbulos renales aparezcan marcados? a. Autofluorescencia de los eritrocitos. b . Peroxidasa endógena. c. Hemos descubierto que el marcador tumoral se expresa también en células no tumorales. d . Biotina endógena. e. Reacción cruzada del Ac secundario. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: cuando se utilizan técnicas de detección basadas en el uso de la biotina, como es este caso, hay que realizar un bloqueo de la biotina endógena, que, en el caso expuesto, no se ha realizado. El riñón contiene abundante biotina endógena que se pone especialmente de manifiesto tras la apli­ cación de la recuperación antigénica con calor. 13. Acabamos de adquirir un Ac monoclo­ nal obtenido en rata frente a un Ag de ratón que se expresa en riñón. Debido a la abundancia de biotina endógena en riñón, hemos considerado más adecuado realizar una inmunohistoquímica enzimática utilizando un método polimérico. En nuestro laboratorio utilizamos los secun­ darios poliméricos de la casa comercial Dako, pero tenemos anti-conejo y anti­ ratón, que son los que se comercializan. ¿Podríamos aplicar, de alguna manera, un método polimérico? a. Sí, pero necesitaremos comprar un Ac secundario polimérico frente a rata, si existe. b . Sí, pero de todas formas tenemos que bloquear la biotina endógena.

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c. No, con los Ac secundarios polimé­

ricos anti-conejo y anti-ratón nunca podremos detectar un Ac primario obtenido en rata. d . Sí, podemos utilizar, por ejemplo, un Ac puente de conejo anti-rata bioti­ nado y después aplicar el antisuero polimérico anti-conejo. e. Ninguna respuesta es correcta. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: tras la incubación con el Ac primario de rata, podemos apli­ car un Ac secundario anti-rata obtenido en conejo y después incubar con el secundario polimérico anti-conejo. El hecho de que el Ac puente esté biotinado no impide que el Ac secundario polimérico lo reconozca y se una a él. Además, no será necesario bloquear la biotina endógena, puesto que no estamos utilizando la biotina para la detección. En este caso, es irrelevante que el antisuero anti­ rata esté biotinado. 14. Necesitamos obtener un Ac monoclonal frente a un péptido que presenta gran homología entre humanos y roedores. Disponemos de un modelo animal de ratón para estudiar su localización en diversos órganos mediante inmunohis­ toquímica. ¿Qué especie, en principio, seria la más adecuada para obtener el Ac monoclonal? a. Conejo. b . Rata. c. Ratón. d . Cabra. e. Cualquiera de las respuestas anterio­ res es correcta. Respuesta correcta: a. R espuesta razonada: no se pueden producir Ac monoclonales en cabra, solo policlonales. Obtener el Ac monoclonal en ratón no sería buena idea, porque lo vamos a utilizar en tejido de ratón y podríamos tener problemas de tinción inespecífica de fondo, debido a la unión del antisuero secundario anti-ratón que necesitaríamos emplear con las Ig endógenas presentes en las muestras de nuestro modelo de ratón. Además, al tratarse de una molécula de gran homología entre humanos y roedores, es posible que la molécula no resultara inmunogénica en

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ratón y rata. Por ello, la mejor opción, en principio, es obtenerlo en conejo, cuyo sis­ tema inmunitario responde mucho mejor a los Ag de roedores. 15. Se ha realizado una doble inmuofluorescencia con un Ac primario policlonal obtenido en cabra y otro Ac monoclonal ob­ tenido en ratón. Como Ac secundarios se utilizaron: Ig de conejo anti-cabra marcado con Alexa Fluor® 488 (verde) e Ig de cabra anti-ratón marcado con Alexa Fluor® 568 (rojo). El mareaje se ha realizado de forma secuencial: el Ac policlonal de cabra seguido del corres­ pondiente Ac secundario de conejo anti­ cabra 488 y después el Ac monoclonal de ratón seguido del Ac secundario de cabra anti-ratón 568. Valore el diseño del experimento. a . Es correcto: los dos Ac primarios es­ tán obtenidos en distintas especies, así que no hay problema.

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b. Al ser Ac primarios de distinta es­ pecie, hay que aplicarlos a la vez y no secuencialmente. c. Está mal diseñado, ya que habrá reac­ ción cruzada entre los Ac secundarios. d. Se han elegido mal los fluorocromos. e. Es correcto: los Ac primarios están obtenidos en distintas especies y, además, el mareaje es secuencial. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el experim ento está mal diseñado, ya que no se han ele­ gido correctam ente los Ac secundarios. El segundo se ha obtenido en cabra y se unirá a los sitios libres que hayan quedado en el prim er Ac secundario (anti-cabra). Utilizando, por ejemplo, como segundo Ac secundario uno de conejo anti-ratón no se daría esta reacción cruzada. No hay pro­ blema con los fluorocromos elegidos, pues absorben y emiten a distintas longitudes de onda.

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FIG U RA e6-1 Detección de panCK en hígado de ratón. A ) Detección con peroxidasa y diaminobencidina (DAB) como cromógeno. B) Detección con fosfatasa alcalina y W arp R ed™ como cromógeno. L a presencia de pigmento biliar de color pardo (flechas), de color semejante al precipitado de DAB, hace que, en este caso, sea más adecuado utilizar un crom ógeno d e u n color distinto, com o el rojo utilizado en B, p ara distinguir el pigm ento b iliar de la positividad.

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Técnicas en histología y biología celular

FIGURA e6 -2 Comparación entre imágenes de inm unohistoquímica enzimática (A) e inmunofluorescencia (B) con el m ismo anticuerpo primario (panCK) y sobre cortes del m ism o bloque de parafina de hígado de ratón. C on el marcado inmunoenzimático (A ), además de las células positivas (flechas), se pueden observar, gracias al contraste con hematoxilina, características y detalles del tejido circundante que no son visibles en la inmunofluorescencia, a pesar del contraste nuclear con D A PI (B).

FIG U RA e6-3 D oble m areaje inmunoenzimático con anticuerpos m onoclonales obtenidos en ratón frente a C D 31 (m arcad o r d e e n d o telio , re v elad o en rojo) y a-actina de músculo liso (a-SM A, revelado en marrón). La a-S M A m arca músculo liso, pericitos y miofibroblastos. En este caso, el objetivo era cuantificar los miofibro­ blastos del estrom a en tumores d e m ama. M ediante el doble m areaje se pueden diferenciar y descartar para la cuantificación las células a-SM A positivas que forman parte d e vasos sanguíneos (flechas negras) (pericitos y m úsculo liso) de lo s m iofibroblastos del estrom a del tumor (flechas rojas).

FIG U R A e6-4 Inm unohistoquím ica p ara CK 18 y tinción p ara lípidos (fat red) sobre el m ism o corte, en este caso congelado, ya que es un requisito imprescin­ dible p ara p reservar y poder teñir lípidos. El m areaje con CK18 perm ite m arcar h epatocitos hum anos tras­ plantados en un hígado de ratón (marcado en marrón con peroxidasa y DAB). Las gotas lipídicas se tiñen de color rojo. Se puede comprobar que los hepatocitos hum anos que han sido trasplantados acum ulan gotas lipídicas (esteatosis) con el paso del tiempo. También se observan gotas lipídicas en los hepatocitos de ratón.

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FIGURA e6-5 Células tumorales en cultivo a las que se añadieron liposomas marcados con un trazador fluores­ cente liposoluble (D il, em isión en rojo) (A ). Tras una incubación de 2 4 h, se fijaron las células y se realizó una inmunofiuorescencia con un anticuerpo frente a la Na+/K+-ATPasa, marcador de la membrana plasmática. S e utilizó un antisuero secundario marcado con el fluorocromo A lexa Fluor® 488 (emite en verde) (B) y los núcleos se contrastaron con D A PI (azul) (C). En la sum a digital de las tres im ágenes anteriores (D), se puede comprobar que algunos liposomas se han incorporado al interior de algunas células tumorales (flechas).

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FIG U RA e 6 -6 Aplicación de las técnicas de hibridación in situ de RNA mensajero (mRNA) de la proteína priónica (PrPc) con m areaje cromogénico (A) e inmunofiuorescencia para insulina (Ins) (B) sobre el mismo corte de parafina. En la sum a digital de las dos im ágenes anteriores (C), se observa que el mRNA de la P rPc se expresa en algunas células de insulina (puntas de flecha). (P or cortesía de la Dra. Zuberoa Marcos, Universidad de Navarra.)

Técnicas en histología y biología celular

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FIGURA e6-7 Efecto d e la recuperación antigénica (AR) e n la inmunorreactividad obtenida con un anticuerpo frente al receptor d e andrógenos. Cortes seriados d e parafina de próstata de ratón. A ) Sin A R (Sin). B ) Digestión enzim ática con proteinasa K (PK). C ) C alentamiento e n solución de citrato a p H 6 (Cit, p H 6), a 95 °C durante 30 min. D) Calentamiento en solución de Tris-EDTA a pH 9 (TE, pH 9), a 95 °C durante 30 min. El mareaje óptimo (intenso y en todos los núcleos del epitelio glandular) se obtiene con AR en T E a pH 9.

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FIGURA e6-8 Obtención y eliminación de tinción inespecífica de fondo al utilizar un anticuerpo (Ac) primario obtenido en ratón (CD68) en tejido de rata (hígado). A ) Con un método polimérico convencional (anti-ratón), además del m areaje específico en células de K upffer (flechas), se obtiene m areaje inespecífico en los sinusoides hepáticos (pu n ta s d e fle c h a ). E l polím ero a n ti-rató n p resenta reactividad cruzada con las inm unoglobulinas de rata. B) U tilizando un m étodo polim érico específico p ara el uso de Ac de ratón en tejido de rata no se observa inespecificidad en los sinusoides. E n este caso, el polímero anti-ratón no presenta reactividad cruzada con Ig de rata.

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Técnicas de localización in s it u de ácidos nucleicos: hibridación

in s it u

Luis M o n tu e n g a Badía, C a rm e n G arcía C o rc h ó n , Isabel Z u d a ire Ripa, A lb e rto O r ta Ruiz, Ja ck e lin e A g o rre ta A rrazubi

INTRODUCCIÓ N La técnica de hibridación in situ (ISH, in situ hybridization) es una técnica que nos permite localizar secuencias de ácidos nucleicos en estructuras anatómicas concretas. Actual­ mente, se ha convertido en una herramienta indispensable en cualquier laboratorio de investigación dedicado a la morfología mo­ lecular, así como en biología del desarrollo, neurobiología, medicina molecular, etc. La ISH se aplica para estudiar la expresión génica diferencial o las alteraciones genómicas en distintas patologías. En los laboratorios de anatomía patológica diagnóstica, la ISH es utilizada con frecuencia para analizar el origen de diversas infecciones. La hibridación de ácidos nucleicos se puede definir como una reacción mediante la cual se unen dos cadenas complementa­ rias para formar un ácido nucleico de doble cadena; la complementariedad se basa en la formación de puentes de hidrógeno entre las bases: adenina-timina (DNA) o uracilotimina (RNA) y citosina-guanina (DNA y RNA). En las reacciones de hibridación que se llevan a cabo en el laboratorio, se hace que un polinucleótido previamente m arcado, denom inado «sonda», hibride con su secuencia complementaria (diana), que es la secuencia que queremos demos­ trar in situ. Esta secuencia diana se hace visible al microscopio gracias al mareaje específico de la sonda, el cual puede ser de distinta naturaleza. Generalmente, la © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

secuencia diana está localizada en un corte histológico, en células aisladas, en cro­ mosomas, etc. Hay distintas variaciones de la técnica de hibridación, según las es­ trategias de mareaje, el tipo de sonda, el material en el que está localizada la diana o el tipo de hibridación que se establezca. En función de las moléculas implicadas en la hibridación, podemos encontrar tres tipos de moléculas híbridas: DNA/DNA, DNA/ RNA y RNA/RNA. Las aplicaciones de estas técnicas son muy variadas, tanto en el campo de la inves­ tigación básica como en el diagnóstico. La ISH para el RNA mensajero (mRNA) per­ mite demostrar la expresión de genes con­ cretos en células y tejidos, y confirmar los resultados obtenidos mediante otras técnicas, como la inmunohistoquímica, que demuestra la presencia de la proteína. La inmunohis­ toquímica y la ISH para los mRNA son, por tanto, técnicas que permiten la confirmación cruzada de resultados.

GENERALIDADES DE LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Las técnicas de hibridación están basadas en la característica que tienen los ácidos nu­ cleicos de formar híbridos, lo que permite detectar la presencia de un ácido nucleico concreto in situ en la muestra que se estudia. Todas las variantes técnicas de la hibridación 127

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de ácidos nucleicos tienen una serie de pasos en común: • La preparación de la muestra en la que se pretende detectar la presencia de la secuencia diana. • La preparación de la sonda, es decir, de la secuencia complementaria que se desea localizar y que debe estar marcada, para permitir su posterior reconocimiento. • El proceso de hibridación propiamente dicho, en el que se facilita la unión de las dos secuencias complementarias. • La detección de los híbridos. En general, las técnicas de hibridación pueden aplicarse tanto a extractos de áci­ dos nucleicos obtenidos de las células a partir de cultivos celulares, de órganos o tejidos, como a preparaciones en muy dis­ tintas variantes (cromosómicas, de células en cultivo y secciones histológicas) en las que los ácidos nucleicos se mantienen en su lugar de origen; en este segundo caso, se habla de «técnicas in situ». También es posible llevar a cabo la técnica de ISH en em briones com pletos y organism os de pequeño tamaño, en los que se pueda conseguir buena perm eabilidad para los reactivos, así como suficiente transparencia a la hora de visualizar el mareaje. En este caso, se puede hablar también de «hibrida­ ción in toto». Cuando se persigue identificar secuen­ cias en m aterial extraído del tejido, es necesario transferir el extracto de ácidos nucleicos, DNA o RNA, a un soporte sobre el que se realizará la hibridación; general­ mente se utilizan como soportes membranas de materiales diversos (nailon, nitrocelulosa, etc.). Si la transferencia a la membrana se hace directamente a partir de la extrac­ ción, la técnica será el dot blot y únicamente informa de la presencia o ausencia de una determinada secuencia. Si previamente a la transferencia se hace una separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis, estaremos aplicando la técnica del southern blot, si el ácido nucleico es DNA, y la del northern blot si es RNA; ambas nos permiten conocer, además, el tamaño de la secuencia diana en cuestión.

Por tanto, para el reconocimiento de ácidos nucleicos mediante la técnica de la hibridación necesitamos: • Un ácido nucleico diana (target). Puede haberse aislado de la célula mediante extracción y fijación en un soporte para la hibridación (dot blot, southern blot, northern blot) o puede encontrarse dentro del propio tejido, en células aisladas o en estructuras celulares (cromosomas). • Un ácido nucleico complementario mar­ cado o sonda (probe). Pueden variar en naturaleza (DNA, RNA o estructuras hí­ bridas), tamaño y tipo de mareaje. • Reacción de hibridación. Requiere la des­ naturalización previa del ácido nucleico diana y/o de la sonda en el caso de que alguno sea DNA de doble cadena. Se lle­ va a cabo a una temperatura y un tiempo determinados, en un medio o tampón de hibridación que contenga sales y agentes desnaturalizantes, como la formamida, y se continúa con lavados para eliminar uniones no específicas. • Sistema de detección y visualización de la molécula marcadora. Dependerá del tipo de marcado escogido para la sonda (radiactivo/no radiactivo) y de la molé­ cula marcadora.

Factores que condicionan la hibridación de ácidos nucleicos Desde hace muchas décadas se conoce la cinética de la reacción de hibridación entre cadenas de ácidos nucleicos complementa­ rias. Como consecuencia de este conocimien­ to se ha determinado que la estabilidad de los híbridos entre cadenas complementarias de ácidos nucleicos depende de una serie de factores, que resumimos a continuación: • Tipo de híbridos formados: los híbridos RNA/RNA son más estables que los híbridos DNA/RNA o DNA/DNA. • Composición de bases de la secuencia (%G-C): una secuencia rica en bases G-C será más estable. • Longitud de la sonda. Cuanto más larga sea la sonda, mayor será la estabilidad del híbrido; sin embargo, si la longitud

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

de aquella es demasiado grande se pre­ sentarán problemas de accesibilidad en el tejido. • Concentración de sales y formamida en el tampón de hibridación. Una concen­ tración de sales elevada da mayor es­ tabilidad a los híbridos debido a que los cationes monovalentes interactúan elec­ trostáticamente con los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, disminuyendo así la repulsión electrostática entre las dos cadenas del dúplex. Sin embargo, la pre­ sencia de disolventes orgánicos como la formamida reduce la estabilidad térmica de la doble cadena, desnaturalizando los híbridos. • Tem peratura de hibridación. Cuanto mayor sea la temperatura, menor será la estabilidad de la hibridación. • La temperatura de fusión (Tm o melting temperature) es la temperatura a la que el 50% de las cadenas están unidas a la secuencia diana. Se puede calcular apro­ ximadamente mediante una fórmula en la que intervienen, además de las carac­ terísticas del tampón de hibridación, la secuencia diana y la longitud de la sonda. A continuación se muestra la fórmula pa­ ra calcular la Tm de los híbridos DNA/ DNA: Tm = 81,5+16,6x (log([Na+])+0,41 X(%GC) —600/longitud de la sonda A la hora de diseñar experimentos de hibri­ dación, hay que tener en cuenta todos estos factores. Se han de identificar las condiciones en las que la unión de sondas complementa­ rias a la secuencia diana es máxima (máxima sensibilidad) y aquellas en las que la unión no específica a otras secuencias o a otras es­ tructuras es mínima (máxima especificidad). En el trabajo de rutina del laboratorio, y en especial en el caso de la ISH, la composición de la solución de hibridación generalmente es estándar y raramente se modifica. En rea­ lidad, los factores que se controlan son, fundamentalmente, las características de la sonda y su concentración en la solución de hibridación, así como la temperatura y el tiempo de hibridación. Lógicamente, la tem­

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peratura de hibridación deberá ser inferior a la Tm para que los híbridos sean estables. G eneralmente, para hibridaciones RNA/ RNA, se suelen utilizar temperaturas entre 42 y 45 °C durante 16-20 h. Una vez que se ha llevado a cabo la re­ acción de hibridación, es necesario eliminar las uniones inespecíficas debido a las inte­ racciones de la sonda con moléculas de baja homología o a interacciones inespecíficas con las moléculas del tejido (membranas ce­ lulares, proteínas, etc.). Para eliminar las moléculas de sonda que no han hibridado es­ pecíficamente, deben realizarse una serie de lavados posthibridación, con los que nos ase­ guraremos que solo los híbridos específicos permanezcan unidos. Estos lavados se rea­ lizan en condiciones de elevada temperatura y baja concentración de sales, de forma que cualquier unión de la sonda a una secuencia de forma inespecífica es eliminada: solo per­ manecerán los híbridos más estables.

HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH) Trabajar con extractos de ácidos nucleicos permite determinar si un gen se expresa o no en un determinado tejido o si una secuencia de DNA se halla presente en el extracto y en qué proporción. Sin embargo, la hibrida­ ción de extractos no permite obtener datos de distribución anatómica o de localización celular de esas secuencias. Cuando se pre­ tende identificar el tipo celular que expresa un gen, su distribución dentro de un tejido o la presencia de copias únicas o múltiples de secuencias de DNA, es necesario llevar a cabo técnicas de ISH. Estas permiten localizar se­ cuencias concretas de ácidos nucleicos en un corte histológico o en una extensión celular, así como dar respuesta a estas cuestiones. El protocolo de las técnicas de ISH es similar al que se sigue con las de hibridación en ex­ tractos, señaladas anteriormente, con algunas modificaciones. Los aspectos específicos de las técnicas de ISH derivan del hecho de que el soporte del ácido nucleico diana ya no es una membrana de nitrocelulosa sino el en­ tramado macromolecular propio de un tejido, una célula o un cromosoma. Asimismo, es peculiar de estas técnicas in situ el hecho de

Técnicas en histología y biología celular

que el resultado final ha de ser visible al mi­ croscopio. En las próximas secciones vamos a centramos en describir algunos aspectos relativos a la ISH para RNA, pues es la téc­ nica más compleja. En el caso de la ISH para DNA, los protocolos son más sencillos, como se verá, al final de este capítulo, en el aparta­ do dedicado a la técnica FISH (fluorescence in situ hybridization) para cromosomas.

Como se ha indicado, el ácido nucleico diana está localizado en un material celular prepa­ rado de diversas maneras:

interfásicos en secciones de tejido o ex­ tensiones de células. • Organismos pequeños o en fa se em­ brionaria: la ISH se realiza in toto sobre el organismo entero, tras su fijación. En este tipo de hibridación es clave lograr que los reactivos tengan la permeabilidad mínima necesaria y que el organismo sea suficientemente transparente para poder visualizar la hibridación (fig. 7-IB). • Células vivas: la detección de las molé­ culas de RNA en células vivas y la visualización del transporte de las mismas han constituido dos de los mayores avances de esta técnica.

• Tejidos: se someten al procesamiento his­ tológico usual hasta la obtención de los cortes, que han de ser algo más gruesos de lo habitual. Puede utilizarse tanto ma­ terial congelado como fijado (fig. 7-1 A). • Células aisladas: requieren el manejo de técnicas de cultivo de tejidos o células. Una vez que tengamos el cultivo, debe­ remos realizar una suspensión/extensión para la realización de la ISH. • Cromosomas: se aplican técnicas citogenéticas. La ISH se realiza sobre una sus­ pensión celular de células en mitosis, des­ pués de un choque hipotónico. También se puede realizar ISH para cromosomas

En función del tipo de material que vayamos a emplear, el procesamiento del material re­ querirá técnicas diferentes. Cuando el soporte de la hibridación en la ISH es una preparación histológica, el tejido puede ser procesado de varias formas. Lo más común es fijar el tejido con un agente fijador que preserve su morfología y sus com­ ponentes biológicos, aunque otra opción es utilizar material congelado y someter los cor­ tes de criostato a un breve paso de fijación. La fijación es un paso crucial en la ISH, puesto que debemos conservar tanto la mor­ fología celular como los ácidos nucleicos del tejido. Al contrario del DNA, que es

Procesamiento del material

FIG U RA 7-1 A) Hibridación in situ de un corte de estómago de rata con una sonda para la sintasa de óxido nítrico. B) H ibridación in toto de un embrión de pez cebra en la fase de cinco somitos que demuestra la expresión del gen FOXD3 en las células de la cresta neural. El m areaje oscuro de ambas im ágenes demuestra dónde se ha producido la hibridación de la sonda con el mRNA diana. (A, p o r cortesía de la Dra. M.aÁngela Burrell, Universidad de Navarra; B , p o r cortesía del Dr. Roberto M ayor, University College London.)

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

bastante estable, la vida media de la mayoría de los RNA es muy corta (p. ej., el mRNA de c-MYC dura solo 10 min). Además, el RNA es una molécula muy lábil y se degrada muy fácilmente por la acción de las RNasas, que son enzimas ubicuas. Por estos motivos, para la calidad de las técnicas de ISH de RNA, el tiempo de fijación del tejido es crítico. En el caso de muestras experimentales, si es posible, conviene llevar a cabo fijación por perfusión. Si se trata de muestras hu­ manas, hay que estar muy atentos al tiempo transcurrido desde la anoxia tisular o, en su caso, al tiempo post mortem. Hay que conservar los tejidos no fijados mediante crioprotección en nitrógeno líquido o en un congelador a -120 °C. Las muestras se embeben como para cortes de criostato en un compuesto denominado OCT (optimum cutting temperature). También se pueden conservar a -80 °C, pero, en tal caso, se de­ berá prestar atención a posibles fluctuaciones de temperatura, puesto que el RNA puede ser sensible a estos pequeños cambios. De todos modos, la técnica de ISH se puede llevar a cabo en tejidos preservados a -80 °C después de bastantes años, si la preservación se ha realizado adecuadamente. Los fijadores entrecruzantes de proteí­ nas ofrecen buenos resultados para lograr simultáneamente una correcta preservación de ácidos nucleicos y una buena morfolo­ gía. Los más utilizados son el formaldehído tamponado al 4% y el preparado a partir de paraformaldehído sólido al 4% (v. capítu­ lo 3, apartado «Fijadores entrecruzantes. Formaldehído y glutaraldehído»). El tiempo de fijación óptimo depende tanto del fijador elegido como del tejido en estudio y hay que determinarlo experimentalmente. El tiempo de fijación es fundamental, ya que, si es ex­ cesivo, el acceso de la sonda podría resultar imposible. Por ejemplo, cultivos celulares y preparaciones con cortes en criostato de material congelado necesitan unos minutos, mientras que piezas de determinados tejidos, como el hígado, pueden fijarse hasta 24 h. Cuando lo que se pretenda localizar sean dia­ nas poco abundantes en el tejido (pocas co­ pias de la secuencia en cada célula) o cuando la preservación del material sea subóptima,

131

será preciso diseñar el protocolo de la técnica de hibridación para mejorar la sensibilidad, modificando las condiciones de hibridación y de los lavados o aplicando sistemas de amplificación en la fase de detección del marcado. En el caso de la hibridación en células vivas, el reto consiste en introducir sondas marcadas que no alteren la viabilidad celular. Cuando se hace necesario conocer la localización subcelular de una determinada molécula de RNA, esta técnica también se puede realizar en cortes finos y observar los resultados en el microscopio electrónico de transmisión. No obstante, es más habitual disponer de material fijado y, posteriormente, incluido en parafina. También se pueden uti­ lizar extensiones celulares o de cromosomas, en función del tipo de técnica que se lleve a cabo. Todos los pasos del protocolo de corte, de la desparafinación y de la hidratación de­ ben ser llevados a cabo en condiciones libres de RNasas. Para la ISH de RNA, todo el material de vidrio que se utilice desde la fijación ha de haberse limpiado a fondo y pasado por la estufa de aire caliente (270 °C) durante 6 h. El resto del material (pipetas, puntas, etc.) debe ser autoclavado. Todo reactivo en medio acuoso que se vaya a utilizar en el protocolo hasta el comienzo de los lavados posthibrida­ ción deberá estar libre de RNasas. Para ello se utilizan inhibidores de RNasas. Los más utilizados son la heparina, el inhibidor de RNasas placentario, el RNA de transferencia (tRNA) de levaduras, así como una serie de inhibidores comerciales, que se pueden usar para volúmenes pequeños (p. ej., RNAsin N2111, Promega®). Para inhibir las RNasas en el material de trabajo y los reactivos, se preparan volúmenes grandes de dietilpirocarbonato (DEPC), generalmente a baja concen­ tración (0,1%). Si se quiere combinar la ISH con un técnica de inmunocitoquímica, hay que tener en cuentaque el DEPC a concen­ traciones elevadas puede degradar inmunoglobulinas y antígenos proteicos. Debido a las interacciones que ejerce el fijador con las proteínas del tejido, es nece­ sario que este sea procesado, para facilitar la penetración de la sonda. Para aumentar la permeabilidad del tejido y la accesibilidad

Técnicas en histología y biología celular

de los ácidos nucleicos se utilizan soluciones detergentes (Triton X-100) y tratamientos con proteasas (proteinasa K). En el primer caso, se mejora la penetración de la sonda a través de las membranas y, en el segundo, se rompen los puentes que el fijador haya for­ mado o las uniones a proteínas que puedan tener los ácidos nucleicos. La intensidad de estos tratamientos (concentración y tiempo de tratamiento) depende directamente de las características de la fijación, del tejido y de la sonda, por lo que hay que ajustarla para cada situación experimental. La opti­ mización del pretratamiento es un aspecto decisivo para que los resultados tengan una calidad y una reproducibilidad adecuadas. Cada vez que se pone a punto la técnica de ISH con una sonda o un material nuevo, es preciso invertir tiempo en diseñar muy bien los experim entos piloto necesarios para optimizar el pretratamiento. Esto es aplicable no solo a la ISH para mRNA en secciones sino para las diversas variantes de esta técnica. Puesto que la reacción de hibridación ocurre a un pH cercano a la neutralidad, al cual una gran cantidad de grupos amino de las proteínas se encuentran protonados (NH3+), es posible producir interacciones electrostáticas entre las cargas negativas de la sonda y las proteínas del tejido, lo que provo­ cará la aparición de un mareaje inespecífico. Para evitarlo, podemos bloquear las cargas positivas del tejido mediante la adición de grupos acetilo, cargados negativamente. El agente bloqueante que cede los grupos acetilo es el anhídrido acético.

ubicuo de las RNasas, enzimas activas en condiciones muy extremas.

Preparación de la sonda

5P- s i r s

Para localizar secuencias de DNA se utilizan sondas de DNA, ya que el RNA es más lábil. En la detección de RNA se pueden usar tanto sondas de RNA como de DNA. Aunque el empleo de las primeras (ribosondas) presen­ ta numerosas ventajas (v. más adelante), su obtención es más laboriosa y requiere que el laboratorio esté preparado para llevar a cabo una serie de técnicas básicas en biología mo­ lecular. Además, el manejo y la conservación del RNA son delicados, debido al carácter

Tipos de sondas según el ácido nucleico • DNA bicatenario o de doble cadena (dsD N A , double stra n d DNA). La sonda se obtiene mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de secuencias de DNA clonadas en un vector. Se utiliza habitualmente en ISH para detectar DNA. La sonda de doble cadena requiere la desnaturalización de la secuencia para su hibridación, nor­ malmente por calor, que puede llevarse a cabo previa o simultáneamente a la del DNA diana. Los procesos de desnatura­ lización del dsDNA requeridos para la hibridación tienen el inconveniente de que, en función de las condiciones del experimento, puede haber un porcentaje de sonda o de DNA diana que se asocie de nuevo antes de la hibridación. Existen diversos tipos de mareaje de las sondas de dsDNA, aunque las técnicas más uti­ lizadas son nick translation (fig. 7-2) y random priming (fig. 7-3), que se des­ criben más adelante. • DNA monocatenario (ssDNA, single strand DNA). De este tipo son, por ejemplo,

5'p ............................................3'

J

i

DNasa 1

........ l u S - '

DNA polimerasa 1 dTTP, dATP, d C P 2P, dGTP

5P FIG U RA 7-2 Esquema del mareaje de la sonda por el método d e nick translation con un nucleótido marcado radiactivamente (dCT32P).

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

3T i i i i | rr

ni

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133

3

Desnaturalización

s’p -rn n iT T T iirn m n m rm jjJiU JJ üii iMii iu lli

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DNA polimerasa 1 dTTP, dATP, dCT“ P, dGTP

i-pTTiiiiT^mm iiin rrrrm^3' 1111111111 11111

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m ^rrrrTri 5’ I I 1 l l l l l l I I H ' l | | | | | | | | l l |

U J < - P 3'

Desnaturalización

■p-mrrmTTTTTTTmuí 11nrm3' Mili. .11 •'

MI 111-^ 1u 1

Sondas marcadas

FIGURA 7-3 Esquem a del m areaje d e la sonda por el m étodo d e random prim ing con un nucleótido m arcado radiactivamente.

las sondas de oligonucleótidos. Han de ser diseñadas previamente y se obtienen mediante síntesis artificial de los oligonu­ cleótidos. Su tamaño suele ser pequeño (20-50 bases) y el mareaje puede hacerse durante la síntesis del oligo (utilizando nucleótidos marcados) o por end-labelling (fig. 7-4; v. más adelante). • Ribosondas (sondas de RNA). Se obtie­ nen a partir de una secuencia de DNA clonada en un vector que posea los pro­ motores para su transcripción. La trans­ cripción in vitro de estas secuencias en uno u otro sentido origina ribosondas sentido (sense) y antisentido (antisense) (fig. 7-5). La transcripción ocurre a partir de plásmidos que contienen el inserto apropiado y se basa en la acción de RNA polimerasas dependientes de RNA. El

5'p-rriii^HTrni mu rrrrrrn3' 1

Transferasa terminal d C F'P

5'p - jt i i ittttii m || mu m u i itttti i

Transferasa terminal dCT32P

s'p ~n 1 1 1 1' i i i i i m i i i i i i i i i i n ||TTr|i i m r FIGURA 7-4 Esquem a del m areaje d e la sonda por el m étodo d e end-labelling con un nucleótido marcado radiactivamente.

tamaño de la ribosonda para ISH oscila entre las 400 y las 1.000 bases, aunque se han utilizado ribosondas más cortas y más largas sin mayores problemas. La principal desventaja de este tipo de

Técnicas en histología y biología celular

Sitio de clonaje múltiple (MCS)

n

A

Linearizar en el sitio «aguas abajo» del inserto, elegido en función del promotor deseado

i

4-V

17

SP5 3'

RNA polimerasa de SP6 y mezcla de nucleótidos marcados y no marcados Sentido

y V 5' 3' I 1

--------

B

3'T7

SP6

5 'J I 1

RNA polimerasa d e T 7 y mezcla de nucleótidos marcados y no marcados 5' — — —

Transcritos de RNA marcados de longitud Antisentido y secuencia definidas (ribosondas para íSH)

FIGURA 7-5 Esquem a del m areaje de la sonda por el m étodo d e transcripción in vitro. ISH, hibridación in situ; MCS, m ultiple cloning site, «sitio de clonaje múltiple».

sondas es la labilidad del RNA. También existe la posibilidad de la hibridación en­ tre secuencias de la misma sonda forman­ do una estructura terciaria que impida la hibridación con la sonda diana. Sus principales ventajas son las siguientes: • Las ribosondas son monocatenarias, lo que evita el problema de la renaturali­ zación de las sondas, que ocurre cuando se usan sondas de DNA bicatenarias. • Para detectar mRNA, la unión RNA/ RNA es más estable que la unión RNA/DNA, lo que permite la aplica­ ción de condiciones más restrictivas para aumentar la especificidad. • La sonda que no se haya unido al mRNA puede ser destruida tras la hi­ bridación con RNasa, enzima que no afecta a los híbridos bicatenarios.

• Se pueden obtener sondas de longitud uniforme. • Si se dispone del plásmido adecuado, será posible obtener sondas con secuen­ cia antisentido (antisense) y secuencias idénticas (sense) a la secuencia diana. Es decir, se pueden obtener a la vez la sonda y su control negativo sense a partir del mismo plásmido. • Ácidos nucleicos de conformación res­ tringida (LNA, locked nucleic acids). Los LNA son oligonucleótidos cons­ tituidos por nucleótidos cuya confor­ mación está restringida por un enlace con un grupo metileno [4’C-CH2-2’0 ] entre el carbono en posición 4’ y el oxí­ geno en posición 2’ del ribonucleósido (fig. 7-6). Esta restricción conformacional dota a estas moléculas de una rigidez

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

FIG U RA 7 -6

135

M onómero de ácidos nucleicos de conformación restringida (LNA).

mediante ISH, de micro-RNA (fig. 7-7) y otras secuencias en cortes de tejidos, y de variaciones (SNP, mutaciones, etc.). • H íbridos péptidos-ácidos nucleicos (PNA, peptide nucleic acids). Los PNA son oligonucleótidos compuestos por una estructura poliamídica aquiral formada por residuos de N-(2-aminoetil)-glicina que lleva incorporada una base purínica o pirimidínica en su estructura. La molécu­ la resultante no contiene ninguna pentosa, motivo azucarado o grupo fosfato, lo que la hace muy similar a una cadena polipeptídica (Nter-R-R-R-Cter) (fig. 7-8). La ausencia de grupos fosfato confiere neutralidad a estas moléculas, lo que po­ sibilita su gran estabilidad en el medio celular. Esta estructura tan peculiar goza de características muy apropiadas para su aplicación como sondas para ensayos de

publicación MASSON. Fotocopiar:

estructural que se traduce en caracterís­ ticas peculiares, como una excelente capacidad de hibridación con moléculas complementarias de DNA y RNA y un aumento en la Tm de los híbridos, lo que confiere una gran especificidad a la hibridación. Por otra parte, también tienen la capacidad de formar triples hélices de DNA con dsDNA y gene­ rar una estructura que impedirá llevar a cabo la transcripción, con lo que se originarán moléculas muy útiles para estudios de genética funcional. Gracias a sus características termodinámicas y a su alta especificidad, estas moléculas son de elección a la hora de diseñar arrays de genotipado de polim orfis­ mos de nucleótido simple (SNP, single nucleotide polym orphism ) y ensayos para la detección de microorganismos

FIGURA 7 -7 Hibridación in situ con sondas de ácidos nucleicos de conformación restringida (LNA) marcadas con fluoresceína. L a detección d e la fluoresceína se llevó a cabo m ediante anticuerpos específicos y para el revelado se utilizó el sistema EnVision™ y diaminobencidina (revelado en color marrón). A) Se ha detectado la expresión del RNA U6 en los núcleos del epitelio normal del colon. B) La expresión de miR-451 se localiza en las glándulas del tumor de colon. (Por cortesía de la Dra. Jackéline Agorreta, Universidad de Navarra.)

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FIGURA 7-8

Estructura de un polipéptido y de un híbrido péptido-ácido nucleico (PNA).

ISH. Presentan una unión fuerte y de alta especificidad con moléculas complemen­ tarias de DNA y RNA, generando molé­ culas de alta estabilidad biológica que también pueden inhibir los procesos de transcripción o traducción de las mismas. Son altamente resistentes a nucleasas y proteasas, por lo que son tres veces más estables que los oligonucleótidos de DNA o RNA «no protegidos» utilizados para el mismo fin en el interior de la célula. Actualmente estas moléculas se utilizan en investigación para distintos fines: son muy eficaces como cebadores para las PCR que tienen la finalidad de incorporar residuos radiactivos, fluorescentes o biotinados (sondas). Se usan también para la incorporación de secuencias resistentes a nucleasas por PCR o para la detección de ácidos nucleicos para diagnóstico. En la práctica clínica, se utilizan con gran frecuencia, dada su alta especificidad (fig. 7-9). Asimismo, las sondas de PNA reducen problemas de fondo y requieren bajas concentraciones y tiempos de hi­ bridación relativamente cortos.

Obtención y mareaje de la sonda Las distintas modalidades de mareaje de las sondas se basan en el uso de nucleótidos mar­ cados en la síntesis de la sonda. Las sondas de PNA o LNA son comerciales y están dis­ ponibles con diversos tipos de mareaje como biotina, fluoresceína o digoxigenina. Para marcar sondas de DNA o RNA durante su síntesis existen cuatro técnicas básicas de mareaje (v. figs. 7-2 a 7-5): • • • •

Nick translation. Random priming. End-labelling. Transcripción in vitro.

N ick tra n s la tio n

Se utiliza con las sondas de dsDNA. Consis­ te en producir numerosas mellas con una DNasa I. Posteriormente, la actividad de la DNA polimerasa I con actividad exonucleasa incorpora nucleótidos, algunos de los cuales estarán marcados, de modo que la sonda final quede marcada (v. fig. 7-2). El mareaje puede ser isotópico, como en la figura, o no radiactivo (biotina, digoxigenina

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

137

FIG U RA 7-9 H ibridación in situ para la detección del mRNA del virus E pstein-Barr con sondas PNA en una m uestra de biopsia humana. E l revelado se realizó con N BT (nitro blue tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate), p o r lo que se observa un precipitado azul oscuro en las células positivas (flechas).

o fluoresceína); aunque actualmente el mar­ eaje no radiactivo es más frecuente (v. más adelante). Las desventajas de esta técnica son la posible reasociación de las hebras de DNA y el difícil ajuste de la acción de la DNasa, cuya actividad puede variar entre experimentos. R a n d o m p rim in g

Se emplea tanto para sondas de dsDNA como de ssDNA (v. fig. 7-3). Utiliza una mezcla de hexámeros de secuencia aleatoria que van emparejando al azar con las secuencias complementarias que encuentren en el DNA diana. El resto de la cadena de DNA no emparejada se irá completando con la DNA polimerasa (fragmento Klenow). La síntesis de DNA se hace en presencia de nucleótidos marcados. E nd -la b e llin g

Utiliza la transferasa terminal (TdT, terminal deoxynucleotil transferase) para incorporar nucleótidos marcados al extremo terminal 3’OH en las dos cadenas (v. fig. 7-4). La ventaja de esta técnica es su sencillez; sin embargo, solo se obtiene una secuencia terminal marcada por sonda, por lo que la detección de la señal puede ser mucho menos

sensible que una sonda con mayor proporción de nucleótidos marcados distribuidos a lo largo de su secuencia.

Transcripción in v itro . Obtención de ribosondas (sondas de RNA) El procedimiento normalmente utilizado para la obtención de ribosondas es la trans­ cripción in vitro (y. fig. 7-5). Se parte de DNA complementario (cDNA) obtenido a partir de la secuencia de mRNA que bus­ camos. Ese cDNA se inserta en un plásmido bacteriano. En general, el inserto se encuen­ tra flanqueado por dos promotores para la transcripción de RNA por medio de RNA polimerasas. Son dos promotores diferentes que inician la transcripción en sentido inverso en dirección al inserto. Previamente es nece­ sario linearizar el plásmido para que solo se transcriba el cDNA en un sentido; es decir, para que solo uno de los dos promotores de RNA polimerasa funcione adecuadamente. Cada RNA polimerasa se une a su promotor específico. A partir de uno de los promotores, se produce la sonda antisentido (antisense), complementaria al mRNA de la célula, lo que posibilita su unión. Para transcribir la sonda sentido (sense), en una dirección distinta, hay que utilizar el otro promotor y la RNA

Técnicas en histología y biología celular

polimerasa correspondiente, de modo que se inicie la transcripción en sentido opuesto al anterior. La secuencia de la sonda sense es idéntica a la del mRNA de la célula, por lo que no hibridará. Esta ribosonda se utiliza como control negativo en la reacción de hi­ bridación. Por tanto, para la obtención de riboson­ das, es necesario llevar a cabo los siguientes pasos sucesivos: • Introducción del inserto (dsDNA), obte­ nido habitualmente por PCR, en la caja de clonado de un plásmido (vector de clonación) con un promotor para la trans­ cripción en ambos extremos del inserto. Los promotores para la RNA polimerasa más utilizados son T7, T3 y SP6. • Transformación con dicho plásmido de bacterias que crecerán en cultivo. • Purificación del plásmido y linearización con una enzima de restricción en la parte opuesta al promotor del que se va a hacer la transcripción. • Transcripción con la RNA polimerasa correspondiente en presencia de nucleó­ tidos marcados. En función del promotor empleado para la transcripción, obtendremos bien el RNA anti­ sentido (que tiene secuencia complementaria al mRNA que estamos buscando y, por tanto, hibridará perfectamente con él: sonda especí­ fica), bien la sonda sentido (sense) (que tiene secuencia idéntica al mRNA que estamos buscando y, por tanto, no hibridará con él y se usará como control negativo).

Tipos de mareaje de la sonda Independientemente de la técnica de síntesis que se utilice y del tipo de sonda (DNA, RNA o moléculas híbridas), los nucleóti­ dos marcados que se incorporan a la sonda pueden tener mareaje distinto: radiactivo (isotópico) o no radiactivo. Los marcadores no isotópicos pueden también ser diversos: biotina, digoxigenina, fluorocromos, etc. La discusión sobre si las sondas isotópicas o las no isotópicas son mejores para la ISH viene de lejos. Hubo argumentos a favor y en contra de los dos tipos de aproximación.

Las sondas radiactivas se han usado desde que se empezó a aplicar la técnica de ISH, hace casi 40 años. Desde entonces, el debate en relación con el uso de sondas isotópicas se centra en cuestiones relativas a sensibilidad, resolución y seguridad.

Sondas isotópicas Consiste en la incorporación de átomos radiactivos a la sonda. Un ejemplo es la sín­ tesis de la sonda en presencia del nucleótido CTP marcado con fósforo radiactivo. Los isótopos que se emplean más frecuentemente son los siguientes: 35S, 32P, 33P, l25I y 3H. El 32P es el que tiene más energía y la vida me­ dia más corta, lo que requiere una exposición más breve en el revelado autorradiográfico (v. más adelante). Sin embargo, la desventaja de este isótopo es que, precisamente, su alta energía hace que la resolución sea más pobre y a veces sea difícil localizar secuencias a nivel de célula única. En el extremo opuesto está el tritio 3H, que tiene una vida media muy larga y una energía muy baja, lo que permite la localización de secuencias a gran resolución (incluso ultraestructuralmente). Sin embargo, los experimentos que usan tritio son muy largos, ya que se requiere un tiempo de exposición de semanas e in­ cluso meses, en lugar de unos días o pocas semanas, como ocurre con otros isótopos. El 35S es el isótopo de compromiso, pues tiene una resolución razonable en el plano tisular y tiempos de exposición mucho más cortos que el tritio. De hecho, el 35S es el isótopo más utilizado en ISH radiactiva. En general, las ventajas del mareaje iso­ tópico consisten en una mayor sensibilidad y la posibilidad de llevar a cabo análisis cuantitativos (mediante el recuento de granos precipitados sobre las células marcadas en el gel autorradiográfico). Los inconvenientes se relacionan, principalmente, con la seguridad (radiactividad: manejo, residuos, laboratorio especial), la corta vida media de los isótopos que condiciona el trabajo y la complicada, y a veces lenta, técnica de detección (tabla 7-1). Todo esto ha estimulado el desarrollo y la aplicación de técnicas no isotópicas. Poco a poco, la ISH con sondas no radiactivas se va imponiendo en la mayoría de los laboratorios.

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

139

TABLA 7-1 Características de los isótopos radiactivos utilizados en el mareaje de las sondas

Isótopo

Partícula

Energía máxim a (MeV)

Vida media

Resolución (p,m)

Tiem po de exposición (aprox.)

3H

P

0,018

12,4 años

0,5-1

2-12 semanas

7

0,004 0,167 1,71

60 días 87,4 días 14,3 días

1-10 10-15 20-30

12-20 días 12-20 días 2-5 días

0,25

28 días

15-20

10-20 días

125|

35S 32p 33p

P P P

Sin embargo, en muchos de ellos todavía se lleva a cabo la ISH con técnicas radiactivas, sobre todo cuando se busca alta sensibilidad en el caso de genes de muy baja expresión.

Sondas no isotópicas

publicación MASSON. Fotocopiar:

En los últimos años se han desarrollado dife­ rentes métodos de detección no radiactivos. El mareaje no radiactivo presenta dos grandes ventajas sobre el radiactivo: a) los híbridos pueden ser detectados en un período corto de tiempo, menos de 24 h, mientras que para detectar el mareaje radiactivo se requieren exposiciones que varían de 3 días a varios ó meses, en función del isótopo utilizado, y H b) la resolución que se obtiene con el mar§ caje no isotópico es excelente, compatible «5 con el nivel celular. No obstante, en algunas ;§ aplicaciones, sobre todo cuando se quiere •! aumentar la sensibilidad, conviene llevar | a cabo el protocolo radiactivo. En el mar•I caje no radiactivo más utilizado, se realiza la síntesis de la sonda marcada en presen­ cia de una mezcla de nucleótidos en la que una fracción de los uracilos (normalmente alrededor del 30%) tiene unida una molécula de origen vegetal denominada «digoxigenina» (D ig-ll-UTP). No todos los uracilos están marcados, debido a que la digoxigenina es de gran tamaño y, si el 100% de los uracilos estuviesen marcados, se producirían impe§ dimentos estéricos entre nucleótidos marw cados muy próximos. Aunque existen otras moléculas marcadoras, como, por ejemplo, Jj la biotina, la digoxigenina presenta una gran © ventaja para su detección ya que, al ser de

origen vegetal, no da reacciones cruzadas, como a veces ocurre con la biotina que puede existir de modo endógeno en algunos tejidos (p. ej., en el hígado). A continuación resumi­ remos las características de los marcadores no isotópicos más frecuentes. • Biotina (vitamina H). Existen nucleótidos marcados con biotina comerciales, como el Biotin-ll-U TP o el Biotin-16-dUTP. Para evitar interferencias con los puentes de hidrógeno, se utilizan brazos o molé­ culas espaciadoras para permitir el acceso a los reactivos de detección (fig. 7-10). Las sondas marcadas que han hibridado se detectan mediante anticuerpos antibiotina o por la técnica de los complejos avidina-biotina peroxidasa (ABC, avidinbiotin-complex) o estreptavidina-biotina peroxidasa. • Digoxigenina (esferoide vegetal). Los nu­ cleótidos se pueden unir covalentemente a la digoxigenina (fig. 7-11). Los más frecuentes son el Dig-ll-UTP o el Dig-11 -dUTP que se utilizan con la técnica del end-labelling o en la producción de ribosondas mediante transcripción in vitro. La detección de digoxigenina en los tejidos se realiza también mediante anticuerpos específicos disponibles comercialmente. • Fluorocromos. Consiste en marcar los nucleótidos con un fluorocrom o que se detectará posteriormente mediante el microscopio de fluorescencia. Uno de los fluorocromos más utilizado es la fluoresceína (fig. 7-12). Se utilizan de modo rutinario en la técnica de FISH

Técnicas en histología y biología celular

FIGURA 7-1 0

Estructura de la m olécula de biotina unida al nucleótido.

FIG U R A 7-11

Estructura de la m olécula de digoxigenina unida al nucleótido.

FIG U RA 7-12

Estructura de la m olécula de fluoresceína unida al nucleótido.

(v. más adelante el apartado «Hibrida­ ción in situ con fluorescencia (FISH)») para secuencias genómicas. Su principal inconveniente es que a medio plazo tien­ den a perder la fluorescencia (fading), especialmente por efecto del tiempo de visualización bajo el microscopio de fluo­ rescencia. También se pueden detectar mediante anticuerpos contra el fluorocromo correspondiente.

Factores que determinan las condiciones de hibridación in situ C ondiciones d e hibridación Las condiciones de hibridación para la téc­ nica in situ dependerán de diversos factores, entre los que se encuentran los siguientes: a) los factores citados anteriormente que in­ fluyen en las reacciones de hibridación de los ácidos nucleicos en general (v. apartado

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

«Factores que condicionan la hibridación de ácidos nucleicos» de este mismo capítulo); b) el número de copias de la secuencia dia­ na: si en el tejido o las células hay muchas copias de la secuencia de nucleótidos que buscamos, la sensibilidad de nuestra técnica será menos importante que si tratamos de identificar una diana presente en el tejido a niveles muy bajos; c) la preservación de los ácidos nucleicos tras la manipulación de los tejidos; d) el efecto de los pretratamientos en relación con la retención del ácido nu­ cleico diana y la accesibilidad de la sonda (fijación, proteasas, etc.); e)él tipo de sonda, la eficacia del mareaje y la sensibilidad del método de detección, y f) la concentración de la sonda. Normalmente, las condiciones ópti­ mas para la hibridación han de determinarse empíricamente para cada experimento nuevo que se lleve a cabo (nueva sonda o nuevo tipo de tejido diana). Para que la reacción de hibridación tenga lugar correctamente, la sonda debe estar en un medio adecuado (solución de hibridación) que favorezca la unión de las secuencias complementarias. También es clave la tem­ peratura a la que se realiza la hibridación. El tiempo de la incubación generalmente oscila entre 16 y 20 h. La temperatura de hibridación, en teoría, debe ser unos 5 °C inferior a la Tm de la son­ da, aunque en la práctica se determina em­ píricamente. Los factores que aumentan la estabilidad de los híbridos tienden a subir la temperatura de hibridación, y viceversa. La temperatura de hibridación depende de varios factores: a) el porcentaje guanina/citosina: si el porcentaje es alto, la temperatura de hibri­ dación también lo será, pues la unión G-C es más estable que la de A-T; b) la longitud de la sonda aumenta la estabilidad: debe ser lo suficientemente grande como para que se den uniones específicas, pero debe permitir una penetración máxima en el tejido (el tamaño medio recomendado es de 200-1.000 bases); c) la concentración de sales (citrato sódico) aumenta la estabilidad, y d) los disolventes orgánicos (formamida) desnaturalizan los híbridos. Por lo general, la temperatura de hibridación para sondas de RNA se encuentra alrededor de 42 °C.

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Entre los componentes de la solución de hibridación se encuentran diferentes reacti­ vos, que, dada su importancia, describiremos brevemente: • Dextrán sulfato. Es un polímero iónico que aumenta la formación de los híbri­ dos: 3-4 veces en el caso de hibridación RNA/RNA y hasta 10 veces en el de DNA/DNA. Contribuye a la disminución del volumen que ocupa el ácido nucleico en la disolución, por retención de agua, lo que produce un incremento relativo de la concentración de la sonda. • Citrato de sodio. Favorece la formación de los híbridos y mantiene la estabi­ lidad de los mismos al establecer una fuerza iónica elevada. El citrato de sodio es una sal que cede iones positivos (Na+) que bloquean las cargas negativas de las hebras de RNA, impidiendo así que se repelan. • Formamida. Agente desnaturalizante que desestabiliza los híbridos. Tiene tenden­ cia a disminuir la Tm y, por tanto, permi­ te realizar la hibridación a temperaturas más bajas, lo que implica un aumento en la especificidad de los híbridos que se formen. Su acción sobre los dúplex RNA/ RNA es menor que sobre los de DNA/ DNA. • Solución de Denhardt. Mezcla de Ficoll®, polivinilpirrolidona, albúmina y seroalbúmina que disminuye las uniones inespecíficas de la sonda.

Lavados posthibridación Durante la reacción de hibridación, la son­ da puede unirse a secuencias con diferente grado de homología, por lo que es necesario modificar los parámetros de la reacción de hibridación para crear unas condiciones más rigurosas que eliminen las uniones inespecíficas y mantengan las uniones de alta homología. Esto se consigue con los lavados posthibridación, en los que generalmente se aumenta la temperatura y se disminuye la concentración de sales (citrato sódico). Al su­ bir la temperatura conseguimos que se deses­ tabilicen los enlaces poco estables (entre la sonda marcada y hebras de ácidos nucleicos

Técnicas en histología y biología celular

del tejido con poca homología). Los iones cedidos por el citrato sódico aumentan la es­ tabilidad de los híbridos; por tanto, al dis­ minuir la concentración iónica, las moléculas de sonda unidas inespecíficamente también se sueltan. Posteriormente, en las hibrida­ ciones in situ para RNA se añade un paso para eliminar las moléculas de sonda que no han formado híbridos con un tratamiento de RNasas, que no actúa sobre los RNA bicatenarios. Este tratamiento con RNasas puede omitirse en algunos casos, si los lavados son suficientemente eficaces.

Sistemas de detección del mareaje Las técnicas de detección del mareaje depen­ derán del tipo de marcador empleado: mien­ tras que los métodos radiactivos requieren técnicas de autorradiografía para su detec­ ción, en los no radiactivos la visualización de la reacción de hibridación se lleva a cabo mediante técnicas inm unohistoquím icas o m ediante la observación directa de la fluorescencia. En el caso del revelado por inmunohistoquímica, se utilizan anticuerpos específicos contra la molécula con la que se ha marcado la ribosonda.

Técnicas autorradiográficas: microautorradiografía La detección de sondas marcadas radiactiva­ mente es conceptualmente sencilla, aunque en la práctica requiere una técnica muy cui­ dadosa. La preparación, una vez hibridada y tras los lavados posthibridación, se pone en contacto por inmersión con una emulsión fotográfica a una temperatura que la mantiene líquida (fig. 7-13). A continuación, se retira la preparación y se deja gelificar la película de emulsión que la recubre. Todo este proce­ so hay que hacerlo en cámara oscura. El corte queda, por tanto, recubierto por una capa fi­ na de gel fotosensible, que es impresionado por las emisiones radiactivas procedentes de la sonda. Las emisiones radiactivas de los isótopos quedan marcadas en la película fotográfica y originan la imagen latente que luego se revela, como cualquier negativo fotográfico. La resolución de la imagen y el tiempo de exposición dependerán de la energía del isótopo.

Detección de mareaje no isotópico Para localizar el mareaje no isotópico con moléculas como biotina o digoxigenina, se

FIGURA 7-13 A) Esquema d e la técnica d e microautorradiografía tras la hibridación con una sonda radiactiva. Tras la aplicación d e la sonda radiactiva, la hibridación y los lavados, se aplica la emulsión fotográfica en forma de gel sobre la preparación. Tras la exposición en oscuridad durante un tiempo variable en función del isótopo de elección, la preparación se observa al microscopio. B) Ganglio raquídeo de rata tras la hibridación in situ radiactiva con una sonda para la proteína de los neurofilamentos. Se pueden individualizar los somas neuronales que acumulan el m RNA para esta proteína por la densa acumulación de precipitados de plata.

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

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Anticuerpo contra la molécula de mareaje conjugado a un sistema que produce la señal

Mareaje incorporado en el híbrido

Anticuerpo secundario conjugado a un sistema que produce la señal

Anticuerpo contra la molécula de mareaje

Mareaje incorporado en el híbrido

FIGURA 7 -1 4 A) E squema de la detección por métodos inmunocitoquímicos e n la que se utiliza un anticuerpo con tra la m olécu la d e m areaje que, a su vez, está c onjugado a una enzim a. B ) Puede em plearse tam bién un anticuerpo secundario.

utilizan técnicas de inmunohistoquímica que permiten amplificar la señal. Para detectar la molécula de mareaje que ha quedado incor­ porada en el híbrido, se emplean anticuerpos especiales anti-biotina, digoxigenina o fluo­ resceína, según sea el caso (fig. 7-14). Estos anticuerpos están conjugados a una enzima o a un fluorocromo. En uno de los protocolos de ISH no iso­ tópica más utilizados, la sonda está marcada con digoxigenina, y el anticuerpo anti-digoxigenina, conjugado a fosfatasa alcalina, que se demuestra mediante técnicas histoquí­ micas (v. capítulo 4). La fosfatasa alcalina utiliza como sustrato un compuesto de fos­ fato que se añade al medio de revelado, que, al ser hidrolizado por la fosfatasa, modifica un cromógeno y provoca un precipitado azul oscuro mediante una reacción de oxidaciónreducción. En uno de los protocolos más comunes de esta variante técnica, la solu­ ción de revelado contiene un sustrato, BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), y un cromógeno, el nitro blue tetrazolium

chloride (4-nitro blue tetrazolium chloride o NBT). Como consecuencia de la actuación de la enzima sobre el BCIP, el NBT se reduce y precipita, de modo que se muestra de color azul oscuro; en su estado inicial oxidado, el NBT es soluble y de color amarillo. De este modo conseguiremos visualizar la loca­ lización de los híbridos con el microscopio. Como el NBT precipitado se solubiliza con el paso por alcoholes, el medio de montaje de elección ha de ser compatible con el me­ dio acuoso: por ejemplo, glicerol/PBS (1:1) (figs. 7-15 y 7-16). El continuo desarrollo de sistemas de amplificación de las técnicas inmunocitoquímicas (v. capítulo 6) ha aumen­ tado significativamente la sensibilidad y es­ pecificidad de este tipo de mareaje y permite detectar moléculas de RNA de bajo número de copia (v. fig. 7-7). En general, se trata de aplicar los recursos de amplificación de señal desarrollados para la inmunohistoquímica al revelado de la ISH. Algunos ejemplos son la amplificación mediante tiramida, la técnica EnVision™, etc.

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Reducción del NBT (cromógeno)

OCH,

X2t|-

Incoloro,soluble

H,CO

OCHj

H,CO Precipitado azul

FIGURA 7 -15 Esquem a de la reacción quím ica de oxidación-reducción que se produce en el revelado cuando se utiliza el anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina. El sistema acopla dos reacciones. E n prim er lugar, por acción de la fosfatasa alcalina se produce la hidrólisis del BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), formando un interm ediario q ue se oxida y dim eriza produciendo un com puesto d e color azul índigo (el azul que se usa para teñir las telas tipo denim d e los pantalones vaqueros). A l m ismo tiempo, el N BT (nitroblue tetrazolium) se reduce por los dos equivalentes reductores generados por la dim erización y forma un precipitado insoluble negro-azulado llamado formazán.

FIGURA 7 -1 6 Ejemplo de revelado d e la técnica de hibridación in situ no isotópica en dos colores basada en la reacción de la fosfatasa alcalina sobre dos cromógenos distintos. A ) Hibridación in situ para sintasa de óxido nítrico (NOS) en el fondo de glándulas gástricas de rata con un revelado de la fosfatasa alcalina basado en el cromógeno NBT (nitroblue tetrazolium), que da una señal de color azul oscuro. B) Neuronas del plexo digestivo de rata en las que se detecta m RNA de la NOS neuronal, puesta de manifiesto m ediante la utilización del cromógeno denominado New Fuchsin, que da una señal de color fucsia. Las flechas señalan las mismas neuronas que se ven marcadas en la figura 7-17A. (P or cortesía de la Dra. M .aÁngela Burrell y la Dra. M ontserrat García Vitoria, Universidad de Navarra.)

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

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FIGURA 7-1 7 A) Análisis simultáneo de la expresión del m RNA de la sintasa de óxido nítrico (NOS) neuronal y de la proteína correspondiente en la m isma preparación histológica en la que se observan marcadas neuronas de los plexos nerviosos d e estómago de rata. L a hibridación in situ (ISH) de m RNA fue revelada en color fucsia y la inm unocitoquím ica se reveló e n color negro m ediante la técnica de precipitación de sales de níquel. E n algunas neuronas se v e acum ulación del RNA (fucsia) pero no de la proteína (negro). E sta figura corresponde a u n corte seriado de la figura 7-16B. h a s flechas señalan las m ismas neuronas en una y otra figura. B) Doble ISH (in toto) en un embrión de Xenopus. En violeta oscuro (usando el cromógeno NBT) se m arca la expresión el gen PAX3, y en rosa, la del gen D K K (la sonda que reconoce este segundo m RNA es visualizada utilizando el cromógeno New Fuchsiri). PAX3 se expresa en las células de la cresta neural, mientras que D K K se expresa en la placa mesodérmica precordal (o m esodermo anterior). (A, p o r cortesía d e las Dras. M .aÁngela Burrell y M ontserrat García Vitoria, Universidad de Navarra; B , p o r cortesía d el Dr. Roberto Mayor, University College London.)

Asimismo, es posible combinar dos cro­ mógenos con sus correspondientes técnicas de revelado para demostrar simultáneamente la expresión de dos genes. Los dos cromóge­ nos pueden ser NBT y New Fuchsin. Esto se utiliza más frecuentemente en biología del desarrollo (fig. 7-17). La tabla 7-2 resume las características generales de los dos tipos básicos de revelado de la ISH.

Resumen del protocolo de ISH para mRNA En los siguientes párrafos, resumimos los pa­ sos que se llevan a cabo en el protocolo de ISH

no isotópica para RNA, que es el más utilizado en el estudio de la expresión génica diferencial: • Preparación de la sonda de mRNA: transcripción in vitro y obtención de las sondas sentido (sense) y antisentido (antisense) marcadas con digoxigenina. • Preparación del material: tanto los reac­ tivos como el material de vidrio a em­ plear en estas técnicas deben ser libres de RNasas. Durante su manipulación es imprescindible emplear guantes para evitar la contaminación. • Preparación del tejido: tratamientos de permeabilización del tejido con detergen­ tes (tritón) y proteasas. El tejido puede ser sometido también a una acetilación

Técnicas en histología y biología celular

TABLA 7-2 Tipos de revelado de ISH Métodos radiactivos

Métodos no radiactivos

Resolución

Baja (32P < 35S < ,25l < 3H)

Alta

Tiempo de exposición Sensibilidad Cuantificación

Grandes tiempos de exposición (3H > ,2SI > 35S > 32P) Alta Posible

Media (salvo técnicas de intensificación) D ifícil

que evita la unión electrostática de la sonda a moléculas cargadas del tejido. • Una vez preparados la sonda, el material y el tejido, se procede a la hibridación propiamente dicha, durante la cual es preciso controlar tanto la temperatura y el tiempo de hibridación como la concen­ tración de la sonda y de los componentes de la solución de hibridación. • Lavados posthibridación en condiciones de baja salinidad y elevada temperatura, que permitirán eliminar las uniones inespecíficas de la sonda al tejido. También se realiza un tratamiento con RNasas con el fin de eliminar las sondas de RNA monocatenario marcado que no hayan hibridado. • El último paso es la detección y la visualización de la sonda unida a su diana, que se llevan a cabo mediante un anticuerpo antidigoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina, cuyo revelado se controla al mi­ croscopio.

Análisis simultáneo de proteína y mRNA mediante técnica combinada ISH e IHQ En ocasiones es conveniente localizar si­ multáneamente una proteína y el mRNA que codifica para la misma o llevar a cabo es­ tudios de expresión combinados de dos genes a nivel de mRNA y proteína. Existen técnicas para realizar simultáneamente ambos análisis (v. fig. 7-17; fig. 7-18). Lo más importante que hay que tener en cuenta es que los pretratamientos necesarios para la ISH pueden afectar a la antigenicidad

Rápido (horas)

de la proteína que se quiere localizar mediante anticuerpos, por lo que siempre es aconseja­ ble llevar a cabo la inmunohistoquímica antes que la ISH. Hay diversas combinaciones posi­ bles en relación con las técnicas de detección para estos protocolos simultáneos. Por ejem­ plo, se puede realizar una inmunolocalización basada en peroxidasa o fosfatasa alcalina y la ISH con mareaje isotópico; también se pue­ den llevar a cabo dos mareajes no isotópicos con revelado en colores distintos y con buen contraste. Por último, es posible diseñar una técnica simultánea basada en mareaje fluores­ cente con dos fluorocromos de espectro de emisión diferente. En el caso de la ISH al microscopio elec­ trónico, el anticuerpo secundario se marca con partículas de oro coloidal y se observa directamente en el microscopio electrónico de transmisión (fig. 7-19A). En los protocolos de detección de RNA en células vivas, las sondas fluorescentes se introducen en las células mediante un pro­ cedimiento de microinyección, y mediante programas especializados se puede seguir el movimiento de una determinada molécula de RNA a lo largo del tiempo (fig. 7-19B).

Controles para las técnicas de ISH (cuadro 7-1) Los protocolos de ISH son relativamente complejos y requieren realizar un cuidadoso diseño de los controles. Los factores que pueden condicionar la aparición de falsos positivos o falsos negativos son muy diversos, como la preservación del tejido, la especifi­ cidad de la sonda o los fallos en el sistema

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

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FIGURA 7-1 8 Técnica com binada de hibridación in situ con sondas fluorescentes para la detección del mRNA del gen ZBP1 (rojo) e inmunofluorescencia para la detección d e actina (verde). Los núcleos se contrastaron con D A PI (azul). (Reproducido a partir de Weil TT, Parton RM, Davis I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends C ell Biol 2010; 20: 380-90.)

B

FIGURA 7-19 A) Hibridación in situ (ISH) al microscopio electrónico de transmisión para la detección del mRNA del gen OSKAR en células de Drosophila Melanogaster. La sonda se marcó con digoxigenina, y el anticuerpo frente a digoxigenina se conjugó a partículas de oro coloidal (cabezas de flecha). B) ISH en células vivas. Im agen de contraste de fases y de microscopio de fluorescencia de la m ism a célula a la que se le ha aplicado la técnica de ISH en células vivas para la detección d e moléculas de mRNA d e (B-actina (rojo). En b ’, b” y b’” se muestra en azul el recorrido de cada m olécula del m RNA de (3-actina. (Reproducido a partir de Weil TT, Parton RM, Davis I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol 2010; 20: 380-90.)

de detección. De ahí la necesidad de que los experimentos se acompañen siempre de una serie de controles distintos, positivos y nega­ tivos. En los siguientes párrafos resumimos

algunos controles posibles para la técnica de ISH para mRNA. En el caso de la ISH para DNA habría que adaptar algunos de ellos o añadir otros.

Técnicas en histología y biología celular

Cu ad ro 7-1 Controles para la técn ica de hibrid ación in s itu (ISH) En la IS H , la rea liza ció n de controles es esen­ c ia l p ara v e rific a r la ve ra c id a d de los resu l­ tad o s. Es n e c e sa rio re a liz a r c o n tro le s tanto positivos com o negativos de la té cn ica .

Controles positivos • R e a liza r un n orthern b lo t • A p lica r la té cn ica en un tejido de p o sitivi­ dad con o cid a • Solapamiento de los resultados con té cnicas in m unocitoquím icas

Controles positivos para ISH de mRNA • Northern blot. Se emplea para compro­ bar que la sonda reconoce la secuencia de mRNA que buscamos y, en algunos casos, para verificar si en extractos del tejido existe el RNA que queremos de­ tectar. • Utilizar un tejido de positividad co­ nocida; es decir, emplear un tejido en el que tengamos la certeza de que el gen que queremos estudiar se está ex­ presando y que, por tanto, en ese tejido existirán algunas células que contengan copias suficientes de la secuencia que se quiere localizar. Idealmente, debe usarse un corte de material en el que previamen­ te (en el propio laboratorio o en otro) se haya conseguido una ISH positiva para el gen de interés. • Estudio del solapamiento de resultados con la inmunocitoquímica: es de esperar que allí donde aparece la proteína se en­ cuentre también el RNA. En condicio­ nes normales, la ISH sirve de «control positivo» para la inmunohistoquímica, y viceversa: en principio, es de esperar que la señal positiva para la ISH para RNA se localice en las mismas células en las que se encuentra la proteína. Es­ ta situación (expresión simultánea de mRNA y pro teína) no se da siempre. En ocasiones puede ocurrir que en una célula haya mRNA sin presencia de su correspondiente proteína o que haya proteína sin ninguna copia del respec­ tivo mRNA.

Controles negativos • Tratam iento del tejido con RNasas • O m isió n de pasos c la ve del protocolo • U tiliza c ió n de la sonda sentido (s e n se ) o de una sonda dirigida frente a un ácid o nu­ cle ic o de negatividad con o cida en el tejido • ISH en célu la s tratadas con siR N A

Controles negativos para ISH de mRNA • El tratamiento previo del tejido con RNasas degrada completamente el mRNA dis­ ponible. En esas condiciones, si el RNA ha sido degradado, debería ser imposible detectarlo mediante ISH. • Omisión de alguno de los pasos clave del protocolo de hibridación. Normalmente, se omite el uso de la sonda o se utiliza una no marcada. • Sonda sentido (sense): consiste en rea­ lizar paralelamente en otra preparación una ISH con la sonda sense en la misma concentración y condiciones que la anti­ sentido (antisense). Esta hibridación no debería dar positividad alguna (fig. 7-20). • Utilizar una sonda de la que sepamos po­ sitivamente que su RNA no se expresa en el tejido de estudio (genes específicos de especies muy alejadas, que no se encuen­ tran en la especie de trabajo, etc.). • Bloqueo de la expresión del mRNA me­ diante la tecnología de RNA de interfe­ rencia. Cuando se trabaja con células en cultivo se puede realizar la técnica de ISH en células en las que se ha bloqueado la expresión del mRNA de estudio mediante RNA pequeño de interferencia (siRNA).

HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA (FISH) Las técnicas de hibridación in situ con fluo­ rescencia (FISH, fluorescence in situ hybri­ dization) se basan en el estudio del número

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

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F IG U R A 7-2 0 Controles de la técnica de hibridación in situ (ISH) de m RNA m ediante la utilización de la sonda sentido (sense). Las figuras m uestran el resultado de la realización de una técnica d e ISH de mRNA para el gen M AG E en células en cultivo. A ) Utilización de la sonda antisentido (antisense). B ) Utilización de la sonda sentido (sense) com o control negativo.

y la localización de una secuencia genómica mediante el uso de una sonda fluorescente. Fueron descritas por primera vez por Rudkin y Stollar en 1977, y desde entonces se ha convertido en una herramienta muy utilizada para múltiples aplicaciones.

FISH convencional 2

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Como se ha explicado anteriormente, las técnicas de hibridación se basan en el principio de complementariedad de bases DNA/DNA, DNA/RNA o RNA/RNA. La particularidad de la FISH radica en que la forma de detectar la hibridación sonda-diana aprovecha las características fluorescentes del mareaje de la sonda. El esquema básico de la técnica de FISH convencional es: • Preparación de la sonda: mareaje fluores­ cente del fragmento de DNA que actúa como sonda. • Preparación del DNA diana. Puede tra­ tarse de: • Cromosomas en metafase. • Núcleos en interfase obtenidos de: - Suspensiones de células en cultivo, de tejidos frescos, congelados o fijados en formol e incluidos en parafina. - Cortes de tejido congelado o fijado. • Fibras de DNA.

•

• • •

• Pequeñas secuencias de DNA inmovi­ lizadas sobre una superficie (chips de DNA). Para la hibridación es necesaria la des­ naturalización de las moléculas de DNA, tanto de la sonda como de la diana. Esta puede llevarse a cabo de forma indepen­ diente o conjunta. Hibridación de las secuencias. Procesos de lavado para elim inar las uniones inespecíficas de las sondas. Análisis con el microscopio o escáner fluorescente (fig. 7-21).

La técnica de FISH ha revolucionado el mun­ do de la citogenética desde sus primeras apli­ caciones a finales de los años ochenta, dado que permite llevar a cabo el estudio cromosómico sin la necesidad de tener células en cultivo. Con esta técnica es posible detectar no solo ganancias y pérdidas sino también translocaciones en interfase (fig. 7-22A y B). Además, dado que permite llevar a cabo el análisis célula a célula, puede describir la posible heterogeneidad celular de la mues­ tra. Es una técnica bastante rápida (24 h para una FISH estándar y unos 4 días para otras aplicaciones, como la hibridación genómica comparada [CGH, comparative genomic hybridization]', v. más adelante) y de una elevada sensibilidad y especificidad.

Técnicas en histología y biología celular

A Marcado indirecto

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Marcado directo

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Diana

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nnj^ "llll'í|in

V Hapteno • Fluoróforo FIGURA 7-21 Fundamento de la técnica FISH. A ) Elementos básicos de la técnica FISH son la sonda y el DNA diana. B) El m areaje de la sonda puede ser directo (derecha) o indirecto (izquierda). C) Desnaturalización de la sonda y del DNA diana. D ) Hibridación. E ) Revelado fluorescente de la hibridación en el m areaje indirecto. (Reproducido con autorización a partir de Speicher MR, Carter NP. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. N at Rev G enet 2005; 6(10): 782-92.)

• EG FR • 5p15 • CMYC

• CEP6 A

B

C

FIGURA 7 -2 2 Ejem plos d e aplicaciones de la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) convencional. A) Estudio de la translocación B CR-ABL en un paciente con leucemia mieloide crónica. B) Estudio de una muestra de cáncer de pulmón con la sonda LAVysion™ en la que se aprecia una amplificación del gen EGFR (rojo). C ) FISH tridimensional para el estudio de la organización nuclear. (A, por cortesía de la Dra. M .aDolores Odero, Universidad de Navarra; B , p o r cortesía de la Dra. Isabel Zudaire, Universidad de Navarra; C, Reproducido con autorización a partir de Speicher MR, Carter NP. The new cytogenetics: blurring the boundaries with m olecular biology. Nat Rev G enet 2005; 6(10): 782-92.)

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

Su principal desventaja es que no se trata de una técnica de cribado: requiere conocer de antemano cuál es la región que se va a estudiar para poder disponer de la sonda que se va a utilizar. Además, tanto las sus­ tancias fluorescentes como el microscopio de fluorescencia (v. capítulo 2) que se precisan para el análisis son bastante costosos. La visualización de los resultados resulta labo­ riosa, puesto que consiste en contar señales fluorescentes, célula a célula, algo que debe ser realizado por personal cualificado. En la actualidad existen algunos intentos por automatizar el análisis aunque todavía no se utilizan de modo rutinario en el diagnóstico.

Mareaje de las sondas de FISH El mareaje fluorescente de una sonda de FISH puede llevarse a cabo de forma directa o indi­ recta (v. fig. 7-21). En el primer caso, la sonda lleva incorporados nucleótidos unidos a una sustancia fluorescente, y en el segundo, los nucleótidos están unidos a haptenos como bio­ tina o digoxigenina que son reconocidos pos­ teriormente con un anticuerpo unido a una sus­ tancia fluorescente. El mareaje directo es, en principio, más específico pero menos intenso que el indirecto, donde la cantidad de fluores­ cencia detectada puede amplificarse añadiendo sucesivos anticuerpos secundarios marcados. Sin embargo, en la actualidad las reacciones de mareaje directo son altamente eficientes y la mayor parte de los ensayos de FISH se llevan a cabo con sondas de mareaje directo.

Tipos de sondas En la actualidad se pueden utilizar múlti­ ples tipos de sondas en la técnica de FISH (v. fig. 7-22). La mayor parte de ellas son sondas de DNA marcadas de forma directa dirigidas frente a secuencias de DNA pre­ sentes en el núcleo de la célula. Los distintos tipos de sondas de DNA pueden agruparse en tres clases: sondas para secuencias repeti­ das, sondas para regiones de secuencia única y sondas de pintado cromosómico: • Sondas para secuencias repetidas: están dirigidas a regiones que contienen se­ cuencias cortas presentes en varios cien­ tos de copias. Ejemplos de ello son las

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secuencias presentes en los centrómeros de los cromosomas, las sondas panteloméricas, las sondas para DNA ribosomal y las sondas para secuencias repetidas dispersas, como las de tipo SINE (short interspersed nuclear element) o LINE (long interspersed nuclear element). • Sondas de secuencia única: este tipo de sondas permite describir el número y la localización de secuencias presentes en una única copia. Puede tratarse de pro­ ductos de PCR, fragmentos de cDNA o fragmentos de DNA clonados en distintos tipos de vectores, como cósmidos, BAC, PAC o YAC. • Sondas de pintado cromosómico: este ti­ po de sondas son resultado de una mezcla compleja de secuencias de DNA que cu­ bren la región de interés (un cromosoma entero, un brazo de un cromosoma o una banda concreta). Son producidas median­ te PCR a partir de cromosomas aislados por flow-sorting o por microdisección. Son muy utilizadas para la identificación de reordenamientos cromosómicos com­ plejos, la identificación de marcadores cromosómicos de origen desconocido y para estudios tridimensionales de la organización de la cromatina en núcleos en interfase (fig. 7-22C). Son muchas las empresas destinadas a la producción y venta de sondas para FISH. Sin embargo, gracias al desarrollo del lla­ mado «Proyecto Genoma Humano» en el año 2003, prácticamente cualquier secuencia de DNA puede ser clonada y marcada de forma fluorescente en el laboratorio (lo que se suele denominar «home-made probes»). Aunque las sondas utilizadas en la téc­ nica de FISH son principalmente moléculas de DNA, se han diseñado sondas sintéticas que mejoran la hibridación de las sondas de DNA como los LNA y los híbridos PNA, ya descritos anteriormente en este capítulo. Es­ tas moléculas sintéticas son más resistentes a nucleasas, más permeables a las membranas biológicas, tienen mayor especificidad, re­ ducen problemas de fondo y requieren bajas concentraciones y tiempos de hibridación relativamente cortos. Por ejemplo, son útiles

Técnicas en histología y biología celular

F IG U R A 7-2 3 Demostración de los telómeros de las células bronquiolares de rata utilizando una sonda PNA contra la secuencia telomérica. E sta técnica permite la cuantificación de la longitud del telómero. (Por cortesía del Dr. Jo sé Ignacio Fernández, CIMA, U niversidad de Navarra.)

para la cuantificación de telómeros por FISH (fig. 7-23).

Aplicaciones de la FISH convencional La FISH convencional se ha convertido en una herramienta imprescindible para el diagnós­ tico citogenético de enfermedades humanas. Entre sus aplicaciones se encuentra el diagnós­ tico prenatal y posnatal de enfermedades cons­ titucionales causadas por alteraciones en el número de cromosomas, como el síndrome de Down, el de Turner o el de Klinefelter, y enfermedades consecuencia de microdeleciones, microduplicaciones o translocaciones cromosómicas. Para muchas de estas patolo­ gías, se comercializan sondas de FISH que permiten realizar el estudio de la enfermedad a partir de muestras de sangre periférica u otros tejidos biológicos. La FISH ofrece la ventaja de que el estudio se puede llevar a cabo en interfase, sin necesidad de recurrir al cultivo in vitro, pudiendo así cuantificar varios cientos de células y definir el posible mosaicismo de la enfermedad. La FISH se ha convertido en una he­ rramienta imprescindible para el estudio

citogenético de neoplasias hematológicas, en combinación con otras herramientas como la citogenética de bandas G y el diagnóstico por PCR. Es utilizada para la identificación de translocaciones, deleciones o amplificaciones de genes que pueden definir el subtipo es­ pecífico de una neoplasia, el pronóstico del paciente o la respuesta a un determinado tratamiento (v. fig. 7-22); además, la técnica se ha utilizado para controlar la progresión de la enfermedad o el éxito de un trasplante de médula ósea. En el contexto de tumores sólidos como el cáncer de mama, de vejiga, de pulmón, o los sarcomas de Ewing, la técnica de FISH tiene un papel importante en la toma de decisiones terapéuticas. Por otro lado, la técnica de FISH es muy utilizada para llevar a cabo estudios taxo­ nómicos en plantas y bacterias. Las sondas utilizadas para ello son, principalmente, se­ cuencias complementarias al RNA ribosomal. Las secuencias diana son específicas de enti­ dades taxonómicas concretas desde serotipos bacterianos a especies, géneros, familias u órdenes. En microbiología, las aplicaciones son múltiples, como el estudio de la presencia de comunidades microbianas en alimentos, en muestras clínicas o en entornos medioam­ bientales, como las aguas residuales, etc.

Técnicas derivadas de la FISH La FISH es una técnica de diagnóstico rápida, que permite realizar un análisis cromosómico sin necesidad del cultivo de células, pero presenta como principal limitación que no se trata de una técnica de screening, ya que únicamente da información de la secuencia para la que se ha diseñado la sonda. Con el fin de resolver las principales limitaciones de la técnica FISH, se han ido desarrollando nuevas técnicas derivadas de ella.

Hibridación genómica comparada (CGH) La técnica de CGH consiste en mezclar en cantidades equimoleculares dos DNA (un DNA problema y otro normal de referencia) marcados con fluorocromos diferentes, rojo y verde. Estos DNA compiten por hibridar sobre un DNA diana normal en forma de

Capítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

153

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FIGURA 7 -2 4 Análisis mediante SK Y de la línea de pulmón NCI-H720. (Por cortesía de la Dra. Isabel Zudaire, Universidad de Navarra.)

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cromosomas en metafase (CGH sobre cro­ técnica muy utilizada para el estudio de plan­ mosomas) o sobre soportes donde se han tas híbridas de especies diferentes. inmovilizados cientos de miles de secuencias FICTION de DNA con información de todo el genoma (arrays de CGH). La diferencia de material La técnica denominada «FICTION» (Fluo­ entre el DNA problema y el de referencia rescence Immunophenotyping and Interphase manifiesta en una diferencia de intensi­ se Cytogenetics as a Tool fo r the Investiga­ dad rojo-verde en cada región. La imagen tion o f Neoplasms) consiste en la detección obtenida en el microscopio de fluorescencia simultánea de antígenos celulares mediante o en el escáner es cuantificada por un pro­inm unofiuorescencia y de alteraciones grama informático, que calcula el cociente cromosómicas mediante FISH en un único de las intensidades de cada fluorocromo en experimento de hibridación. En comparación cada región. La gran ventaja de la CGH es con la técnica FISH, el FICTION aporta la que es una técnica de cribado para todo el ventaja de poder identificar el tipo celular genoma, aunque únicamente es capaz de que lleva la alteración citogenética, en medio detectar ganancias y pérdidas. Para analizar de una población heterogénea de células. alteraciones en el número de copias, también se utilizan otro tipo de arrays que han sido Fiber-FISH desarrollados con el fin de analizar polimorLa técnica de FISH se puede llevar a cabo fismos de nucleótidos a lo largo del genoma también sobre fibras de DNA obtenidas a completo (SNP arrays). En la actualidad se partir del núcleo de las células. La Fiberhan incorporado al arsenal de herramientas FISH permite aumentar la resolución desde para el biólogo molecular y celular otras alrededor de 5 megabases (Mb) (si hablamos tecnologías de análisis masivo del genoma de cromosomas), de 50 Kb a 2 Mb (en el caso completo (whole genome sequencing) o de de núcleos en interfase) y hasta un límite de todo el exorna (exorne sequencing). Estas 5 Kb en el caso de utilizar una fibra de DNA técnicas de secuenciación de alta resolución como diana. Esta técnica ha sido de gran uti­ y alta eficiencia son cada vez más asequibles lidad para el mapeo de genes y el estudio de y probablemente sustituirán por completo los algunas translocaciones. arrays de CGH y de SNP. Existe una técnica similar a la CGH, la denominada GISH (geCariotipado por FISH de 24 colores: nomic in situ hybridization), muy utilizada SKY, M-FISH y COBRA FISH en plantas. Consiste en utilizar el genoma completo de una especie vegetal como sonda Una de las principales limitaciones en los para hibridar sobre cromosomas en metafase primeros tiempos de la técnica FISH era la pero de otra especie vegetal diferente. Es una imposibilidad de detectar simultáneamente

Técnicas en histología y biología celular

varias secuencias diferentes, debido al limi­ tado número de marcadores fluorescentes disponibles. En los comienzos de la FISH, únicamente era posible trabajar con tres co­ lores (rojo, verde y azul); en la actualidad, la posibilidad de combinar varios fluorocromos en concentraciones diferentes y el desarrollo de sistemas de análisis digital permiten pintar cada par cromosómico de un color. Existen principalmente tres técnicas que han utilizado distintos métodos para conseguir un cóctel de 24 sondas fluorescentes: el cariotipo espec­ tral (o SKY), la técnica de FISH multicolor (M-FISH) y la COBRA FISH (Combined Binary Ratio labeling FISH) (fig. 7-24). Estas técnicas han resultado de gran utilidad para el estudio de reordenamientos cromosómicos complejos. Sin embargo, estas técnicas no se utilizan en el diagnóstico clínico de rutina debido a que necesitan metafases de alta calidad (por tanto, tejido fresco), y debido al elevado coste de la mezcla de fluorocromos y a la complejidad del análisis.

Bandeo de color Una de las desventajas del cariotipado de 24 colores es que no es capaz de detectar alte­ raciones estructurales complejas que ocurren dentro del mismo cromosoma, ya que cada par cromosómico está pintado de un único color. Con el fin de resolver este problema han aparecido distintas técnicas que generan

un patrón de bandas fluorescentes típico de cada cromosoma, bien utilizando secuencias grandes clonadas en YAC o secuencias de DNA de diferentes especies de primates ho­ mologas a regiones del ser humano (técnica denominada «Rx-FISH», rainbow cross spe­ cies FISH). Presenta las mismas desventajas que las anteriores, por lo que únicamente se utiliza en investigación. Estas son algunas de las técnicas más co­ nocidas derivadas de la FISH, pero continua­ mente se generan nuevas variantes en función de las necesidades de la investigación. Ejem­ plos de ellos son la FISH multicolor solo para los telómeros (M-TEL) o la FISH con sondas complementarias a regiones intrónicas para el estudio del RNA inmaduro (RNA-FISH), entre otras.

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C apítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

154.e1

Actividades t . C a lc u le la tem peratura de fusión (Tm ) b ajo las siguientes con d icio n es experim en­ tales: a. [Na+] = 0 ,1 M • 5 0 % de G -C . • 5 0 % de form am ida. • Sonda de 2 5 0 pares de bases.

b.

C on las m ism as con d icio n es, pero con una sonda de 25 pares de bases de lon­ gitud, com pare y discuta los resultados de ambos casos. 2 . U n a ap licació n terapéutica de la inves­ tig ació n con c é lu la s m adre consiste en la d iferen ciació n , a partir de estas, de células productoras de in su lin a . En la actu alid ad , varios grupos de investigación han publicado diferentes artículos que describen cóm o han sido capaces deform ar in vitro poblaciones celulares similares a islotes. A l principio, con­ sideraban dichas célu las com o productoras de insulina al ser positivas con el uso de an­ ticuerpos específicos frente a esta hormona. S in em barg o, c u a n d o o tro g ru p o de científicos quiso reproducir los experimentos descritos fue in cap az de detectar (por reac­ ció n en cadena de la polim erasa con trans-

AUTOEVALUACIÓN

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1. ¿Qué técnica elegiría como prueba de rutina para diagnosticar la infección por virus Epstein-Barr en una biopsia humana? a. Visualización del virus al micros­ copio electrónico de barrido. b . Visualización del virus al micros­ copio electrónico de transmisión. c. Inmunocitoquímica para detectar el DNA del virus. d . Hibridación in situ para detectar el RNA del virus. e. Visualización del virus al micros­ copio de luz. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: aunque el microscopio electrónico de transmisión permite la visualización directa de las partículas virales,

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criptasa inversa [RT-PCR]) R N A m ensajero (m RN A) de insulina 1 y solo identificó una señal m uy débil de m RN A de in sulin a 2 , a p e sa r d e la tin c ió n in m u n o c ito q u ím ic a (IC Q ). Repasando los protocolos y el material utilizado, observaron que en uno de los pa­ sos de los cultivos se utilizaban medios libres de suero (de uso habitual en experimentos de diferenciación celular de cultivos de células madre) ¡suplementados con insulina! a. D iseñe un experim ento de IC Q e hib ri­ d ación in situ (ISH ) que pueda constatar la presencia o no de m RN A de insulina en las m ism as célu la s diferenciadas en un cu ltivo de célu la s m adre. b. ¿Q ué m ecanism os fisiológicos cree que p ueden estar o cu rrien d o p ara qu e las c é lu la s sean p ositivas para la proteína in su lin a pero no expresen su m RN A ? ¿ Q u é té c n ic a s h isto ló g ic a s u tiliz a r ía para demostrarlo? c . ¿Q ué otras técn icas histológicas a p lica ­ ría para averiguar si las célu las diferen­ ciadas presentan un fenotipo propio de célu la s productoras de insulina?

la detección del RNA del virus mediante hi­ bridación in situ es una técnica más rápida y fiable, que permite identificar la infección aún en el caso de que los virus no se hayan encapsulado todavía. 2. ¿Qué paso del protocolo de hibridación in situ de DNA considera que es más crítico para obtener un resultado óptimo? a. Poner a punto la concentración y el tiempo de incubación con proteinasas. b . Ajustar el tiempo y la temperatura de hibridación de la sonda. c. Determinar la temperatura adecuada del lavado posthibridación. d. Desnaturalizar el DNA antes de rea­ lizar la hibridación. e. Todas las respuestas anteriores son correctas.

154.e2

Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: en las respuestas a esta pregunta se enumeran los puntos críticos que se deben tener en cuenta en la hibrida­ ción in situ, por lo que todas son correctas. 3. En la hibridación in situ de DNA: a. En los lavados posthibridación, se aumentan la temperatura y la concen­ tración de sales. b. En los lavados posthibridación, se au­ menta la temperatura y se disminuye la concentración de sales. c. La concentración de sodio y citrato es determinante, ya que el citrato se une a las histonas. d. Los lavados posthibridación no al­ teran la unión de la sonda al DNA diana. e. Solo se realizan lavados posthibrida­ ción en la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: los lavados posthi­ bridación son un paso determinante en todas las técnicas de hibridación in situ, tanto si la visualización es mediante fluorescencia (FISH) como con métodos colorimétricos. El aumento de la temperatura y la disminución de la concentración de sales aseguran una unión específica de la sonda al ácido nucleico diana. 4. Determine la afirmación correcta sobre la técnica de hibridación in situ de RNA: a. La técnica se puede revelar en diver­ sos colores en función de la enzima marcadora. b. El marcado nunca puede estar basado en la fluorescencia. c. El tipo de sonda no influye en la tem­ peratura de hibridación. d. Se necesita un microscopio de con­ traste de fases para la visualización de los resultados. e. Se necesita un microscopio de fuerza atómica para la visualización de los resultados. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la técnica de hi­ bridación in situ es muy versátil, y se pue­ de utilizar una gran cantidad de moléculas marcadoras para revelar la técnica en colores

Técnicas en histología y biología celular

diferentes, en función de las necesidades del tejido. 5. ¿Qué tipo de procesamiento elegiría si tiene que detectar la expresión del RNA mensajero (mRNA) de la albúmina en biopsias humanas de hepatocarcinoma? a. Fijación con glutaraldehído e inclu­ sión en resinas epoxi. b . Fijación por calor mediante microondas. c. Congelación de las muestras directa­ mente en nitrógeno líquido. d. Fijación por congelación e inclusión en resinas. e. Fijación con agentes entrecruzantes (formaldehído) e inclusión en para­ fina. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: los fijadores entre­ cruzantes ofrecen buenos resultados para lo­ grar simultáneamente una buena preservación de ácidos nucleicos y una buena morfología. 6. Señale un factor determinante en las condiciones de la hibridación de ácidos nucleicos: a. La presencia de peroxidasa endógena. b . La concentración de albúmina del buffer. c. La longitud de la sonda. d. La homología entre el anticuerpo y el epítopo. e. El medio de montaje. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la longitud de la sonda es un factor determinante para las con­ diciones de la hibridación, ya que cuanto más larga sea la sonda, mayor será la estabilidad de los híbridos. 7. ¿Cuál de estas moléculas NO es un tipo de sonda de hibridación in situ? a. De DNA monocatenario (ssDNA). b . De híbridos péptidos-ácidos nuclei­ cos (PNA). C . De random priming. d. De ácidos nucleicos de conformación restringida (LNA). e. Ribosonda. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el random priming hace referencia a un tipo de marcado de las sondas de DNA y no al tipo de sonda.

C apítulo | 7 Técnicas de localización in situ de ácidos nucleicos: hibridación in situ

8. ¿Qué controles de la técnica de hibrida­ ción considera importantes? a. Control negativo utilizando la sonda sense o sentido. b . Control negativo utilizando el suero preinmune. c. Control negativo utilizando un tejido de positividad conocida. d . Control negativo utilizando la técnica de western blot. e. En esta técnica no es necesario el uso de controles. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la hibridación con la sonda sense es un buen control negativo, ya que su secuencia es idéntica al mRNA de la célula, por lo que no debe dar positividad alguna. 9. ¿Qué son los LNA? a. Sondas de ácidos nucleicos con una estructura extremadamente flexible. b . Oligonucleótidos con una conforma­ ción muy restringida. c. Sondas de ácidos nucleicos utilizadas en la técnica del SKY o cariotipo es­ pectral. d . Son híbridos entre péptidos y ácidos nucleicos. e. Ribosondas monocatenarias. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: los LNA son oli­ gonucleótidos constituidos por nucleótidos cuya conformación está restringida por un enlace con un grupo metileno. 10. ¿Cuál de las siguientes técnicas derivadas del FISH convencional permite la detec­ ción simultánea de proteínas y ácidos nucleicos? a. Hibridación genómica comparada (CGH). b . FISH en hebra (fiber-FISH). c. SKY o cariotipo espectral. d. Bandeo de color. e. Inmunofenotipado y análisis citogenético en interfase fluorescente como herramienta para la investigación de neoplasias (FICTION). Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: la técnica denomi­ nada «FICTION» consiste en la detección simultánea de antígenos celulares median­

154.e3

te inmunofiuorescencia y de alteraciones cromosómicas mediante FISH en un único experimento. 11. Se desea conocer si las células A549 de carcinoma de pulmón en cultivo son ca­ paces de producir la proteína VEGF o si, por el contrario, estas células incorporan del medio de cultivo la proteína y luego la liberan lentamente. ¿Qué técnica uti­ lizaría? a. Detección de la proteína VEGF me­ diante inmunohistoquímica. b. Detección de la proteína VEGF me­ diante inmunofiuorescencia. c. Hibridación in situ para la detección del mRNA de VEGF. d. Visualización de las células mediante el microscopio confocal. e. Hibridación in situ para la detección de la secuencia de DNA de VEGF. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: si detectamos la pro­ teína VEGF en el citoplasma de las células mediante inmunodetección, no podremos concluir cuál es el origen de la misma. Sin embargo, la detección de mRNA de VEGF en las células nos indicará que son capaces de producir esta proteína. 12. Se ha realizado la técnica de hibridación in situ para la detección del micro-RNA m ir451 en pulmón de ratón utilizando sondas PNA marcadas con fluoresceína. Al visualizar las preparaciones al mi­ croscopio de fluorescencia, se observa marcado en los neumocitos de tipo I y en el parénquima pulmonar. ¿Qué ex­ perimento diseñaría para completar su estudio? a. Control negativo para determinar si existen estructuras autofluorescencentes. b. Detección de la proteína mediante inmunofiuorescencia. c. Realización de la técnica de hibrida­ ción en otros tejidos. d. Análisis de la presencia de biotina endógena. e . Hibridación para la detección de otros micro-RNA. Respuesta correcta: a.

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Respuesta razonada: cuando se utilizan sondas marcadas con fluoresceína, es nece­ sario realizar siempre controles negativos que determinen la presencia de estructuras autofluorescentes y nos ayuden a llegar a una conclusión adecuada. 13. Se recibe una muestra de un tumor de pulmón de tipo adenocarcinoma y se propone detectar la translocación entre los genes EML4 y ALK. ¿Qué tipo de técnica diseñaría para detectar esta trans­ locación? a. Hibridación RNA/DNA en núcleos en interfase.

Técnicas en histología y biología celular

b. Técnica FISH con dos sondas para EML4 y ALK marcadas en distintos colores. c. Técnica de hibridación con la sonda sense. d. Hibridación in situ para la detección del mRNA de EM U . e. Hibridación in situ para la detección del mRNA de ALK. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la técnica FISH con sondas de dos colores permite detectar la translocación de genes al identificar muy cercanos los puntos de ambos colores.

Microscopía confocal M aría C. M o n to y a S á n c h e z, A lvaro Piera F e rn án d e z , M aría C alvo A d am u z

INTRODUCCIÓ N La investigación basada en técnicas de microscopía ha estado restringida durante mucho tiempo a muestras teñidas con colo­ rantes que generan contraste entre los dife­ rentes componentes celulares. Sin embargo, la especificidad de este tipo de tinciones no es suficiente para localizar proteínas indi­ viduales. La introducción de las técnicas de inmunodetección, basadas en la altamente específica interacción antígeno-anticuerpo, ha permitido localizar proteínas con alta resolución y especificidad. Las técnicas de detección basadas en fluorescencia son de gran interés, debido a la linealidad entre la señal de fluorescencia y la concentración del fluorocromo, así como por su gran sensibili­ dad. La técnica de inmunofluorescencia, que consiste en la utilización de un anticuerpo marcado con fluorescencia para definir la lo­ calización de una proteína de interés, supuso un gran avance en la microscopía analítica. Posteriores avances en biología molecular, con el descubrim iento de las proteínas fluorescentes, han permitido la aplicación generalizada de técnicas de microscopía a estudios cinéticos en células vivas. En la última década, el desarrollo tec­ nológico ha ido encaminado a incrementar la resolución del microscopio óptico, lo que ha dado lugar a la aparición de la micros­ copía confocal. Esta se basa en el escaneo de la muestra mediante un haz de láser y la eliminación de la señal de fluorescencia emitida por la muestra proveniente de fuera del plano de foco. Mediante la iluminación y la detección de una región limitada de la © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

muestra se obtiene una imagen de gran re­ solución espacial. El microscopio confocal supuso una revolución en este ámbito, ya que ofrece un gran número de ventajas sobre la microscopía de fluorescencia convencional (v. capítulo 2 dedicado a la microscopía óptica convencional), entre las que des­ tacan su mayor resolución, su alto nivel de sensibilidad y su capacidad de obtener información tridimensional del espécimen in situ sin necesidad de seccionarlo, así como imágenes de múltiples mareajes per­ fectamente alineadas. Estas ventajas hacen del microscopio confocal un instrumento de gran utilidad para estudios de micros­ copía cuantitativa y, por todo ello, ha pasado a formar parte del instrumental básico de los laboratorios de investigación, aunque, debido al elevado coste y a la dificultad en el manejo de estos equipos, habitualmente se encuentra ubicado en servicios comunes de apoyo a la investigación.

FUNDAMENTOS DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL Una manera de entender los fundamentos de la microscopía confocal es comparar los mi­ croscopios confocales con los microscopios ópticos convencionales. En microscopía óptica convencional, cuando el objetivo se enfoca en un plano focal específico de la muestra, el volumen de la misma está iluminado uniforme y si­ multáneamente, mientras que en microscopía confocal la iluminación suele estar restringi­ da a un punto de la muestra que va rastreando 155

Técnicas en histología y biología celular

la misma hasta obtener información completa del campo de interés (fig. 8-1). En la microscopía óptica convencional se recoge la mayoría de la luz emitida; parte de la luz recogida para formar la imagen proce­ derá de las regiones superiores e inferiores respecto al plano focal seleccionado, lo que producirá el emborronamiento de la imagen final, que resultará degradada en gran medida al reducir su contraste. En microscopía confocal, el emborronamiento que producen las regiones que se encuentran fuera del plano focal es eliminado mediante un diafragma (pinhole). Este, convenientemente colocado delante del detector de la señal, bloquea la luz proveniente de las citadas áreas fuera de foco, como se puede observar en la figura 8-2. Lo

mismo sucederá al iluminar cualquier otro punto que esté en el plano focal de la lente. Con lo cual, si observáramos una muestra tridimensional con la configuración óptica en cuestión, veríamos de forma nítida todos aquellos puntos que conformaran su estruc­ tura y que estuvieran en el plano focal (al ser bloqueados por el diafragma la luz de todos aquellos puntos de la muestra que no estuvieran en el plano focal). Esto simula lo mismo que realizamos con un microtomo cuando obtenemos un corte de tejido, pero aquí lo hacemos ópticamente y por ello a es­ te método se le denomina «seccionamiento óptico». Las ventajas y los inconvenientes de la microscopía óptica confocal frente a la microscopía de campo ancho o convencional se presentan en el cuadro 8-1.

Componentes de un microscopio confocal

FIGURA 8-1 Com paración de la ilum inación de la m uestra entre la m icroscopía óptica convencional (iz­ quierda ) y la microscopía confocal (derecha).

En la figura 8-2 se ilustra un esquema básico de los componentes del arquetipo de micros­ copio confocal, el de barrido punto a punto, que, lógicamente, se basa en los principios ópticos expuestos en el apartado anterior. En términos prácticos, la fuente de ilu­ minación puntual se consigue mediante un láser que atraviesa un diafragma de ilumi­ nación. El haz de luz puntual que sale del citado diafragma de iluminación se dirige a

F IG U R A 8 - 2 C o m p o ­ n entes d e un m icroscopio confocal.

Capítulo | 8 Microscopía confocal

C u a d ro 8-1 V entajas d e la m ic ro sc o p ía co n fo c a l fre n te a la d e c a m p o a n c h o co n v e n cio n a l 1 S e c c io n a m ie n t o ó p tic o de m uestras

biológicas fijadas e in vivo que se logra mediante la exclusión de la mayor parte de la luz de la muestra que no proviene del plano focal del microscopio. • Mejora la relación señal-ruido, permite reducir el fondo obteniendo una imagen de mayor contraste y definición, mien­ tras que con el microscopio convencio­ nal se obtienen imágenes más borrosas debido a la señal de fondo. • Ofrece la posibilidad de llevar a cabo un seccionamiento perpendicular/trans­ versal de las muestras al permitir realizar reconstrucciones tridimensionales (3D) de un volumen de la muestra. • Elim in a artefacto s producidos por el seccionamiento físico de las muestras y

permite realizar reconstrucciones 3D en muestras vivas. 1 Zoom confocal. Permite aumentar la reso­ lución mediante la disminución del área barrida por el láser y manteniendo el for­ mato de adquisición de la imagen, con lo que se toma un mayor número de puntos en áreas más pequeñas (o, dicho de otra forma, los detalles se ven aumentados). 1 Detección espectral. Si el equipo incorpora este sistema, le conferirá las siguientes ven­ tajas: • Captación de la emisión real de la mues­ tra. • Fácil adaptación a nuevos fluorocromos. • Medida del espectro de fluorescencia

(lambda scan).

la muestra mediante un divisor de haz (que refleja totalmente la luz que incide con un ángulo de cerca de 45°) y se enfoca sobre la misma gracias al objetivo. Solo la luz reflejada o la fluorescencia emitida por el plano focal del espécimen pasa a través del diafragma de detección y forma una imagen puntual en el detector. Los fotones que capte este detector, FIG U RA 8-3 Barrido en xy. El haz de luz proveniente que es comúnmente un fotomultiplicador, los del láser barre la im agen en el plano xy mediante un convertirá en electrones, que darán lugar a una sistem a d e e spejos de barrido, con lo que se obtiene señal analógica que, posteriormente, será digiuna sección óptica. talizada para ser procesada por un ordenador, en cuya pantalla visualizaremos, finalmente, permitirá visualizar una representación bidila imagen digital «confocal». mensional (fig. 8-4) y/o tridimensional de la Para obtener la imagen completa de una muestra con elevada nitidez. sección óptica de la muestra es necesario El espesor de la sección óptica depende mover el punto de iluminación, en aras de barrer toda el área de la muestra que se de­ del tamaño del diafragma, ya que la cantidad de información fuera de foco que es elimi­ sea observar (fig. 8-3). Es por ello que este tipo de microscopio confocal se denomina nada por el microscopio confocal depende «microscopio confocal de barrido punto a del diámetro del diafragma que permite la punto». Como resultará obvio, para cons­ llegada de la señal al sistema de detección. truir una imagen es necesario recorrer toda Por esta razón, en la mayoría de los micros­ copios confocales comercialmente disponi­ la muestra de manera uniforme. Coordinando el barrido en xy con sucesi- bles, la apertura del diafragma de detección es vos desplazamientos de la muestra en el eje z, variable y ajustable, lo que nos permite con­ podrán adquirirse un conjunto de secciones trolar la confocalidad. Abriendo el diafragma, se aumenta el espesor de la sección óptica y, ópticas de la misma. Un procesamiento comen consecuencia, se obtienen imágenes más putacional posterior de las secciones ópticas

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Técnicas en histología y biología celular

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S flJ a £ ? fK 3 tp). Los electrones pueden ser desviados por los átomos de la muestra de una manera elástica (sin perder energía) o inelástica (con pérdida de energía). • Dispersión elástica. Ocurre cuando los electrones son desviados por los núcleos

FIGURA 9 -1 0 Causas d e la dispersión electrónica: interacción electrostática. L a d esviación de los elec­ trones provocada por la gran densidad de carga positiva del núcleo es m ucho m ayor que la repulsión electros­ tática causada por la nube electrónica.

de los átomos de la muestra en un ángulo amplio (v. fig. 9-10). Cuanto mayor es el número atómico del átomo, más proba­ ble es que ocurra una dispersión elástica con mayor ángulo de desviación, lo que proporcionará un buen contraste. • Dispersión inelástica. Se produce cuando los electrones interaccionan con los orbita­ les electrónicos de los átomos de la mues­ tra, con lo que pierden una energía que transmiten a los electrones de los átomos. Los electrones son desviados en un ángulo menor que en el caso de la desviación elás­ tica, por lo que generan un peor contraste. Habitualmente, la imagen final se forma con una mezcla de electrones dispersados elástica e inelásticamente. Los electrones no desviados por la mues­ tra, que atraviesan las aperturas del objetivo y de las lentes proyectoras, impactan en la pantalla fluorescente, que emitirá luz visible. Cuando se realizan electronografías, la pantalla fluorescente se retira y las placas fotográficas quedan expuestas a los elec­ trones (fig. 9-11). La emulsión de bromuro de plata (AgBr) de las placas se reduce en contacto con los electrones y precipita. Al revelar los negativos, esos precipitados negros se convertirán en zonas claras, que son por las que los electrones han atravesado la muestra.

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

191

Haz de electrones

Metal de contraste

’* Electrones dispersados Pantalla fluorescente

_ Los electrones no dispersados ‘ causan fluorescencia

Emulsión fotográfica del negativo

. Los electrones impresionan la emulsión fotográfica

Papel fotográfico ■

Áreas claras, causadas por las zonas de la muestra claras a los e(e- no dispersados)

i El negativo se positiviza en papel

Áreas oscuras,causadas por las zonas densas a los e~ (e' dispersados)

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FIGURA 9-11 Interacción d e los electrones (e~) con la muestra, la pantalla fluorescente y la emulsión de plata. L a imagen digitalizada sería la equivalente al positivo en papel fotográfico.

La dispersión electrónica origina densi­ dad a los electrones, o electrodensidad. Así se obtiene un contraste positivo: los átomos de la muestra se ven «dibujados» en negro (elec­ trones desviados, oscuridad en la pantalla). Donde no había átomos, se ve brillo (elec­ trones no desviados). En consecuencia, la imagen en la pantalla consiste en una mezcla de zonas claras y oscuras (fig. 9-12). En la actualidad, pueden obtenerse imágenes digitalizadas mediante cámaras digitales CCD adaptadas al ME. Aunque la resolución del papel fotográfico es todavía mayor que la de las cámaras digitales que suelen adaptarse a los ME, la resolución de estas cámaras mejora de año en año y está ya al nivel del negativo fotográfico.

Densidad electrónica del material biológico Las muestras biológicas están constituidas en su mayor parte por elementos poco pesados

(carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre), con algunas excepciones (hierro, cobre), por lo que, en general, dis­ persa poco los electrones. La observación directa de muestras biológicas al TEM daría imágenes muy poco contrastadas. Para que la m uestra biológica pueda visualizarse al TEM en imágenes de calidad es necesario darle contraste para incrementar su densidad electrónica. Para ello, es tratada con metales pesados como el osmio (Z = 76), plomo (Z = 82), uranio (Z = 92), etc. Siempre existe una interacción química entre la cé­ lula y los metales, de modo que los metales pesados reflejan la estructura de la muestra. Existen diversos protocolos para dar contras­ te al ME, que se estudiarán en otro apartado. En la dispersión de los electrones o en la densidad electrónica de las muestras biológi­ cas hay grados (fig. 9-13). En una imagen del ME se ven zonas negras (estructuras densas a los electrones o electrodensas), de color gris

Técnicas en histología y biología celular

B FIG U RA 9-12 A) Electronografía de una glándula endometrial tratada con contraste positivo. B) Detalle de las células epiteliales endometriales. Se observan estructuras densas y claras a los electrones. Son densos, por ejemplo, los granos de secreción (flecha corta), los filamentos del citoesqueleto (flecha fina) y los ribosomas (doble flecha), estructuras todas ellas ricas en proteínas. L a m ayor parte de la cromatina (C) y, especialmente, la luz del aparato de Golgi (punta de flecha) se observan claras a los electrones. (A, reproducido a partir de Burrell MA, Calvo A, Sesma M P. Atlas de ultraestructura celular. 2.a ed. Pamplona: Eunsa; 2011. Con autorización de Eunsa; B, reproducido a partir de Vázquez JJ, López D iez del Corral J. Citología práctica. 3.a ed. Pamplona: Eunsa; 1996. Con autorización de Eunsa.)

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

193

FIGURA 9-13 Electronografía de fibras nerviosas que muestran diferentes grados de densidad a los electrones. Los axones amielínicos (A), incluidos en oquedades superficiales de la célula de Schwann, presentan un citoplasma muy claro. El núcleo (N) de la célula de Schwann, la mielina (M) y las fibrillas de colágena (C) son estructuras densas. La lámina extema de las fibras (flecha) y el citoplasma de la célula de Schwann (S) presentan una densidad intermedia. (Reproducido a partir de Vázquez JJ, López D iez del Corral J. Citología práctica. 3.aed. Pamplona: Eunsa; 1996. Con autorización de Eunsa.)

oscuro y gris claro, y casi blancas o blancas (estructuras claras o transparentes a los elec­ trones o electrolúcidas). La dispersión de los electrones en las diferentes zonas de la muestra dependerá de: • Tamaño de los átomos presentes en la muestra (Z). • Concentración de los átomos (número/ volumen). Cuanto m ayores sean el tam año de los átomos y/o la concentración de los átomos, mayor será la dispersión que se generará.

Algunos factores que influyen en la formación de la imagen en el TEM Una serie de ejemplos nos ayudará a entender los factores que influyen en la formación de las imágenes en el ME. Se trata de comparar

la imagen que se formaría por la incidencia de un haz de electrones en tres tipos de mues­ tra diferentes o en diversas condiciones téc­ nicas. Son factores tanto de la propia mues­ tra (grosor, composición atómica) como del microscopio utilizado (voltaje, diafragmas). Factores dependientes de la m uestra • Grosor de la muestra. Supongamos que un haz de electrones incide sobre una primera muestra, que consiste en una lámina de átomos de carbono de 10 nm de espesor. Los electrones atravesarán fácilmente la muestra, salvo aquellos que interfieran con los átomos de carbono de la muestra. Si esa misma muestra tuviera un grosor mayor (p. ej., 20 nm) y, por tanto, un ma­ yor número de átomos de carbono en la trayectoria de los electrones, el número

Técnicas en histología y biología celular

de electrones desviados, lógicamente, también sería mayor. • Composición de la muestra. En una muestra de diferente composición, como una lámina de plomo, incluso en el caso de un espesor mínimo, como el de la muestra (10 nm), el número de electrones desviados sería mucho mayor, ya que el plomo es un metal pesado, de mayor número atómico, y las interaccio­ nes de los electrones del haz con los átomos de plomo son mucho más probables. Así pues, se deduce que el espesor de la mues­ tra y su composición condicionan el número de electrones transmitidos y desviados, y, por tanto, influyen en la formación de la imagen. Factores dependientes del m icroscopio El voltaje con el que los electrones son acele­ rados influye en el contraste y en la resolución. Si el voltaje es bajo, el contraste será me­ jor, ya que los electrones atraviesan la muestra a menor velocidad, y, por tanto, la interacción con los átomos de la muestra será más potente (se desvían más) que si los electrones viajaran más acelerados por utilizar un mayor voltaje. Sin embargo, su poder de resolución será peor, ya que la longitud de onda del haz es mayor. Si el voltaje es alto, se obtiene una me­ jo r resolución (haz más energético, menor longitud de onda) pero peor contraste (los electrones viajan más deprisa, interaccionan menos con la muestra y se desvían menos). Por tanto, a 80 kV obtenemos un mayor contraste, pero a 120 kV el poder de penetra­ ción y la resolución son mejores, lo que es útil para muestras gruesas o grandes aumentos. A pertura del diafragma del objetivo Cuanto menor es el diámetro del diafragma, menor es la cantidad de electrones dispersados

que se recogen, por lo que se obtiene un mejor contraste (pero peor resolución, porque dis­ minuye el sena). Y, al contrario, cuanto mayor es el diámetro del diafragma, más electrones dispersados se recogen, por lo que disminuye el contraste (pero mejora la resolución).

PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA TEM El grosor máximo de una muestra para poder ser visualizada en el TEM ordinario es de 500 nm (0,5 |xm). Por encima de este valor, los electrones tienen mucha dificultad para atravesar la muestra y son detenidos. Pa­ ra muestras más gruesas (hasta 3-5 |xm) se puede utilizar el ME de alto voltaje (HVTEM, high-voltage transmission elec­ tron microscopy). En el TEM convencional, las secciones que dan imágenes de calidad están entre 10 y 100 nm (0,1 (xm). Por tanto, la mayor parte del material biológico no puede estudiarse intacto en el TEM que se utiliza de forma rutinaria. Los orgánulos, y las células procariotas y eucariotas son mayores que 0,1 (xm y, por tanto, deben ser procesados para que puedan ser visualizados. Existen tres posibilidades de procesamiento del material biológico (fig. 9-14): • Inclusión y corte fino. • Desintegración y obtención de extensio­ nes de material particulado (mitocondrias, ribosomas, ácidos nucleicos, pro­ cariotas y virus). • Réplicas de superficie. En los tres casos, se requiere la fijación pre­ via del material. En los siguientes apartados nos centraremos en estas técnicas de proce­ samiento.

3. Réplica

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2.Extensión de partículas

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v. FIG U RA 9 -1 4 Posibles formas de obtención de muestras delgadas para su observación al microscopio electrónico de transmisión.

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

Técnicas convencionales de procesamiento Fijación La fijación es el primer paso del procesamiento. Su finalidad es la misma que en el microscopio de luz (estabilizar las estructuras celulares y preservar su morfología), pero ha de realizarse de forma más rápida y eficaz, ya que queremos preservar la ultraestructura del tejido. Los criterios para una buena conservación morfológica ultraestructural son: continuidad de las membranas, espacio perinuclear de an­ chura constante (si no se ha fijado bien, se producirán dilataciones entre las membranas nuclear externa e interna), ausencia de huecos en el citoplasma (los huecos son síntoma de una fijación defectuosa), cambios dimensiona­ les mínimos y mitocondrias conservadas. Las mitocondrias son el orgánulo más sensible a la fijación por sus propiedades osmóticas. La fijación más utilizada en microscopía electrónica utiliza reactivos químicos. La criofijación suele introducir menos artefactos que la fijación química, se emplea en la técni­ ca de criofractura y da también muy buenos resultados en diversas técnicas histoquímicas. Fijación qu ím ic a

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publicación MASSON. Fotocopiar:

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En microscopía electrónica no se pueden usar fijadores precipitantes, ya que no preservan bien la ultraestructura de las células. Se utilizan fijadores entrecruzantes u oxidantes multifuncionales; es decir, que tienen más de un grupo reactivo, lo que les permite realizar enlaces cruzados (fig. 9-15). Los más utilizados son el glutaraldehído y el tetróxido de osmio. Destacamos el glutaraldehído como buen agente preservador de la morfología. Aunque su velocidad de penetración no es rápida, fija eficaz y rápidamente fragmentos pequeños y es el más utilizado en técnicas morfológicas de rutina. El glutaraldehído fija especialmen­

Glutaraldehído

FIG U RA 9 -15

% 1 1 c— C — C — y \1 |1 H

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C—C

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195

te bien las proteínas pero no los lípidos. Su introducción permitió detectar la existencia de los microtúbulos (fig. 9-16). En estudios inmunocitoquímicos se disminuye su concen­ tración y/o se combina con paraformaldehído en mezclas de menor potencial fijador, que preservan mejor la antigenicidad del tejido. El tetróxido de osmio es un potente fijador, poseedor de cuatro enlaces reactivos. Reaccio­ na especialmente con los dobles enlaces, co­ mo, por ejemplo, con los lípidos insaturados, y por eso estabiliza muy bien las membranas (fig. 9-17A). Forma fácilmente enlaces cruza­ dos (fig. 9-17B). Su elevado peso molecular hace que, además de fijar, sirva también como agente de contraste. Su principal desventaja es su escasa velocidad de penetración (por ello no se utiliza como fijador único). Dado que con frecuencia altera la antigenicidad de las moléculas y la actividad enzimática, no suele ser compatible con las técnicas inmunocitoquímicas y enzimohistoquímicas. Además, es tóxico y muy volátil, y puede generar alergias. La fijación más rutinaria para ME com­ bina las ventajas de ambos fijadores. En primer lugar, se hace una fijación primaria, o prefijación, con aldehidos (fijación rápida; se fijan bien las proteínas) y, a continuación, unafijación secundaria, o posfijación, con te­ tróxido de osmio (que acaba de fijar el tejido, especialmente los lípidos de membrana). La conservación del citoesqueleto (de los filamentos y, especialmente, de los microtúbu­ los) y de las mitocondrias son signo de buena fijación ultraestructural (v. figs. 9-12 y 9-16). O tro s fa c to re s q u e a fe c ta n a la fijación

Existen diversos factores que afectan a la calidad de la fijación, incluido el tampón en el que se disuelve el agente fijador: • Tamaño de la muestra. Para facilitar la pe­ netración de los agentes fijadores se tiende

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Tetróxido de osmioQs

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Fijadores m ás habituales en microscopía electrónica. Se han destacado en rojo los grupos reactivos.

Técnicas en histología y biología celular

FIGURA 9-16 Metafase en la que se aprecia el huso mitótíco, formado por microtúbulos (flechas), los centríolos en los polos del huso (punta de flecha) y los cromosomas (Cr) dispuestos en la placa ecuatorial. (Reproducido a partir de Burrell MA, Calvo A , Sesma MP. Atlas de ultraestructura celular. 2.aed. Pamplona: Eunsa; 2011. Con autorización de Eunsa.)

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FIGURA 9-1 7 A) R eacción del tetróxido d e osmio con dobles enlaces. B) F ormación d e puentes cruzados por el tetróxido de osmio.

a fijar el tejido en trozos muy pequeños (0,5-1 mm3). Se pueden hacer primero tro­ zos más grandes (con prefijador que pene­ tra más rápidamente) y después trocear el

material prefijado para la posfijación, más lenta, de trozos más pequeños. En el caso de extensiones de células o de material particulado la fijación se realiza antes y,

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

por tanto, se utilizan tiempos más cortos o soluciones menos concentradas. • pH. Es importante que el pH se mantenga constante. Variaciones bruscas del mis­ mo provocarían artefactos, por lo que es importante controlar el pH del tampón en el que se disuelva el fijador. • Osmolaridad. El fijador ha de ser lige­ ramente hipertónico para no provocar alteraciones en las estructuras celulares. Tras la fijación, lo más habitual es incluir la muestra para su posterior sección.

Inclusión Al igual que en microscopía óptica, la inclusión consiste en sustituir el agua de la muestra por una sustancia que endurezca el tejido, de forma que se pueda cortar. Ya que se deben realizar cortes muy finos, el medio de inclusión ha de ser mucho más duro que la parafina empleada en microscopía óptica. En general, se utilizan resinas plásticas, que son líquidas en su forma monomérica y que, tras su polimerización, dan al tejido la consistencia necesaria para que pueda ser cortado con el ultramicrotomo. Como la mayor parte de los medios de inclusión son hidrófobos, en primer lugar hay que deshidratar el tejido mediante el paso por alcoholes de gradación creciente hasta óxido de propileno, un medio ya miscible con el agente de inclusión. La deshidratación con disolventes orgánicos introduce bastantes alteraciones en las muestras, especialmente de pérdida de sustan­ cias y cambios dimensionales. Una vez que el tejido está embebido en el agente de transición, puede ser introducido en las cápsulas con la resi­ na líquida, que sustituye al óxido de propileno y, con ello, se finaliza la inclusión. Seguidamente las resinas son polimerizadas por medio de calor o de radiación ultravioleta (UV), lo que confiere a la muestra su dureza característica. El material de inclusión que se utilizaba inicialmente era el metacrilato, pero este pre­ senta dos inconvenientes: una polimerización heterogénea, que origina roturas en el tejido, e inestabilidad frente al haz de electrones. Actualmente se utilizan más las resinas epóxicas, que polimerizan homogéneamente a altas temperaturas, son estables al haz de elec­ trones y no modifican el volumen de la muestra.

197

También existen resinas acrílicas, con la ventaja de que muchas de ellas presentan grados diversos de hidrofilia y, por tanto, no requieren una deshidratación completa con disolventes orgánicos. Además, la polime­ rización puede realizarse con luz UV, por lo que no es necesario someter las muestras a elevadas temperaturas y, en consecuencia, preservan mejor la antigenicidad. Las resinas acrílicas más usadas son las de tipo Lowicryl® y London Resines® (LR White, LR Gold).

Ultramicrotomía Es la operación más delicada para la calidad de las imágenes y la principal fuente de ar­ tefactos. El ultramicrotomo tiene el mismo fundamento que un microtomo de tipo Minot, pero en aquel las cuchillas son de vidrio o diamante y el avance de estas se produce de forma mucho más controlada. Se pueden realizar dos tipos de cortes con el ultramicrotomo: • Cortes semifinos: 1 p,m de grosor. Se utilizan para su estudio mediante micros­ copía óptica y para seleccionar el área para realizar los cortes finos (fig. 9-18A). • Cortes finos: 10-100 nm. Para su estudio al ME (fig. 9-18B). El grosor del corte puede controlarse obser­ vando su color de interferencia: cuando se hace incidir la luz sobre el corte situado sobre una gota de agua, el reflejo varía de color en función de su espesor: • Gris: cortes de 60 nm. Idóneos para alta resolución. • Plateado: cortes de 90 nm. Aptos para el estudio ultraestructural. • Oro: cortes de 90-150 nm. Pocos aumen­ tos y autorradiografía. • Púrpura: cortes de 150-190 nm. Poca calidad: excesivo grosor. Seguidamente, los cortes obtenidos son tra­ tados con técnicas de contraste.

Contraste positivo Es la técnica de contraste más habitual (v. figs. 9-12 y 9-13). Se denomina «contraste positivo» a los métodos para intensificar la capacidad de dispersión de electrones de las

Técnicas en histología y biología celular

F IG U R A 9-18 A) Corte semifino teñido con azul de metileno. B ) Corte fino, que contiene la arteriola recuadrada en A . Ganglio linfático. (A, p o r cortesía de la Dra. A na Cristina Villaro, Universidad de Navarra; B , reproducido a partir de Villaro A C, Sesma P, Vázquez JJ. Innervation o f mouse lymph nodes: Nerve endings on muscular vessels and reticular cells. A m erican Journal o f Anatomy 1987; 179:175-85.)

diferentes estructuras de la muestra. Sería el equivalente a la tinción que se realiza en las técnicas para microscopía óptica. Se realiza añadiendo metales pesados (plomo, uranio, osmio, platino, manganeso, vanadio, oro, plata, etc.) en forma de sales o núcelas, que se unen a las estructuras biológicas. Tal como señalábamos anteriormente, las estructuras tisulares y celulares presentan dis­ tinta afinidad por los metales de elevado peso molecular. En función de la interacción de los tejidos con los metales, los electrones se des­ vían de forma diferente, lo que, al formarse la imagen, se traduce en estructuras electrodensas y electrolúcidas (oscuras y claras respectiva­ mente). El osmio, por ejemplo, tiene afinidad por las membranas, por lo que estas estructuras aparecerán gris oscuro o negro en la imagen. El contraste de las muestras puede rea­ lizarse antes o después de la inclusión: • Contraste en bloque: se realiza después de la posfijación con el osmio y antes de la inclusión. La muestra se trata con acetato de uranilo, que estabiliza las estructuras del tejido, al mismo tiempo que les da contraste. • Contraste en redes: se realiza tras la fija­ ción, la inclusión y el corte efectuados en las muestras. Constituye el método más frecuente de contraste. La técnica es más sencilla, eficaz y controlable que la del contraste en bloque. Consiste en colo­

car las redes en contacto con una gota de solución de contraste, para lo que se pue­ den utilizar dos soluciones consecutivas: • Acetato de uranilo (durante 30 min a 37 °C). Es una sustancia tóxica, por lo que han de tomarse las medidas de protección pertinentes. Presenta una fuerte afinidad por los ácidos nucleicos y las proteínas. • Citrato de plomo. Presenta una fuerte afinidad por ácidos nucleicos, pro­ teínas y fosfolípidos. Se utiliza para el contraste de membranas. Precipita fácilmente en contacto con dióxido de carbono, por lo que deben extremarse las medidas de limpieza. El contraste positivo en cortes finos de material incluido es el protocolo más rutinario en los la­ boratorios de microscopía electrónica. Permite un estudio detallado de los componentes celula­ res, incluidos los complejos macromoleculares, como ribosomas, filamentos, microtúbulos y otras estructuras similares (fig. 9-19). Sin em­ bargo, existen muchas otras técnicas y diversos protocolos para el estudio ultraestructural.

Estudio de extensiones Las extensiones de material particulado, bien sean microorganismos intactos (virus, bac­ terias) o fracciones subcelulares o tisulares

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

199

FIGURA 9 -19 Ejemplo de la gran resolución que aporta el microscopio electrónico. A) Célula epitelial excretora del üeon de un insecto. L a membrana plasmática apical forma numerosos pliegues (flechas). B) Detalle a más aumento de los pliegues apicales. Obsérvese que la membrana está recubierta en su lado citoplasmático de pequeñas estructuras densas, denominadas «portasomas» (flechas). Corresponden a un transportador (ATPasa de protones) presente en la m embrana apical de estas células. Se trata de un complejo proteico, de suficiente tamaño como para ser apreciado al microscopio electrónico. D e hecho, la imagen recuerda al retículo endoplasmático rugoso. C) Tinción inmunofluorescente del íleon al microscopio de luz, que detecta la misma ATPasa de protones apical. La región inmunoteñida corres­ ponde a los pliegues apicales. Compárese la diferente resolución que da la electronografía frente a la imagen de luz. (A y C, p o r cortesía de la Dra. M ercedes Garayoa, Universidad de Navarra; B, reproducido a partir de Villaro AC, Garay oa M, Lezaun MJ, Sesma P. L ight and Electron Microscopic Study o f the Hindgut o f the A nt (Formica nigricans, Hymenoptera): I. Structure o f the Ileum. J M orphol 1999; 242:189-204. Con autorización de John W iley and Sons.)

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(orgánulos, membranas, macromoléculas, fibras de tejido conjuntivo) son suficientemente finas como para que puedan ser estudiadas con diversos tipos de contraste. Los contrastes más habituales son el contraste negativo y el sombreado metálico, aunque en las extensiones también puede realizarse un contraste positivo, similar al de los cortes. Se trata de dos técnicas sencillas, desa­ rrolladas antes que las de inclusión y cortes finos, que permiten el estudio detallado de los componentes más pequeños de las células, incluidas las macromoléculas (proteínas y ácidos nucleicos). El contraste negativo faci­ lita la mejor resolución del material biológico estudiado con el TEM (1-2 nm).

Contraste negativo en extensiones Desarrollada en 1955, es, junto con el sombreado metálico, una de las técnicas más tempranas utilizadas con el ME. Tras la fijación, el material es embebido en un material de contraste en fase líquida, que rodea las

partículas. Al secarse, el material forma una película sólida, muy densa a los electrones, que rodea y delimita las partículas (fig. 9-20). En el TEM, las partículas se observan como estructuras claras (sin contraste) rodea­ das de una sustancia densa a los electrones (figs. 9-21 y 9-22), es decir, al revés que en el contraste positivo, en el que las estructuras se visualizan densas a los electrones. Por ello, es­ ta técnica se denomina «contraste negativo». Además, con esta técnica se consigue cierto aspecto tridimensional, ya que el ma­ terial de contraste se introduce en las oqueda­ des superficiales o internas de las partículas (humificación) y, con ello, resalta el relieve superficial de la misma y su estructura interna (v. figs. 9-21 y 9-22). Los materiales de contraste negativo son sales de metales pesados muy solubles en agua —para no cristalizar durante el proceso de secado— y de pequeño tamaño —para que puedan introducirse libremente en las oqueda­ des de la muestra—. Los más utilizados son

Técnicas en histología y biología celular

Partícula (virus, membranas, etc)

Capa seca de contraste

Película de soporte FIGURA 9 -2 0

Esquem a de la visión lateral d e una extensión de partículas tratada con contraste negativo.

Ha? de electrones

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Oquedad central,con algo de contraste

FIG U RA 9-21 Esquema de una partícula tratada con contraste negativo. A ) Vista lateral. B) V ista desde arriba, tal como se observa al m icroscopio electrónico. L a partícula aparece clara, rodeada del medio de contraste electrodenso.

FIG U RA 9-22 A ) M itocondria tratada con contraste negativo tras un choque hipotónico. Se observa la membrana mitocondrial externa (derecha), que ha dejado salir a la membrana interna, intacta, que contiene la matriz mitocondrial. Ambas m embranas se aprecian claras, rodeadas por el contraste, oscuro. B) B acteria (E. cotí) tratada con contraste negativo. El contraste rodea a la bacteria, de modo que delimita su contorno. S e aprecia que está en división, y a que el contraste tam bién se ha introducido en el surco que separará a las dos bacterias (humificación). (A, reproducido a partir de Vázquez JJ, López D iez del Corral J. Citología práctica. 3.a ed. Pamplona: Eunsa; 1996. Con autorización de Eunsa; B , p o r cortesía de D avid García Ros, Universidad de Navarra.)

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

sales de wolframio (fosfotungstato), aunque también son útiles las sales de uranio, cadmio y molibdeno.

Sombreado metálico Se desarrolló también muy tempranamente (1946). Se utilizan metales pesados, pero no sus sales sino en su forma metálica directa­ mente, es decir, evaporando el metal sobre la superficie de la muestra (fig. 9-23). Se evapora oblicuamente, por lo que el metal se acumula en el lado de la muestra próximo al foco de evaporación y queda una zona sin metal («sombra») en el lado opuesto. La imagen que se observa en el micros­ copio es la de un objeto oscuro junto a una «sombra» clara. Se pueden obtener imágenes invertidas, con el objeto claro y la sombra os­ cura. Para ello, se hace un segundo negativo a partir del negativo fotográfico original. Las fotografías obtenidas a partir del segundo negativo presentarán, por tanto, un contraste invertido respecto al original. Los metales más utilizados para el som­ breado son platino, paladio, iridio, tungsteno y tántalo. El sombreado puede ser unidireccional (a partir de un foco de evaporación, con la muestra fija) o rotatorio (haciendo girar a la muestra, por lo que va recibiendo el metal evaporado en to­ das direcciones). En este caso, el contomo de la estructura queda muy bien delimitado. También puede hacerse un sombreado bidireccional. El sombreado metálico se utiliza mucho para el estudio de macromoléculas (filamen­ tos proteicos, ácidos nucleicos, etc.).

FIG U RA 9 -2 3

201

Réplicas Una réplica es una copia de la superficie, suficientemente fin a y transparente como para que sea posible observarla en el TEM (v. fig. 9-14). ¿Cómo se hacen las réplicas? (figs. 9-24 y 9-25): • El primer paso es la confección de la ré­ plica (con plástico o carbono): • Plástico. Se baña en soluciones dilui­ das el objeto y se deja secar por evapo­ ración: el material plástico se deposita sobre la superficie. Con plástico se obtienen réplicas más resistentes que a partir de carbono. • Carbono y otros materiales similares. Se utilizan elementos más ligeros que los del sombreado, porque las réplicas deben ser transparentes a los elec­ trones. Se evaporan sobre la muestra, perpendicularmente. Se obtienen ré­ plicas más frágiles que con plásticos. • Separación de la réplica del material biológico (si la muestra es gruesa) por medios químicos (disolución, oxidación, digestión de la muestra). Las muestras finas (proteínas) no se separan, ya que no vuelven opaca la réplica. • Recogida de la réplica (en red). • Sombreado de la réplica. Las réplicas se suelen sombrear para resaltar los detalles de su superficie (el sombreado genera imágenes más tridimensionales) y para hacerlas más resistentes. Generalmente se sombrean antes de hacer la réplica

V ista lateral de una partícula tratada con sombreado metálico.

Técnicas en histología y biología celular Muestra biológica

1. Obtención de la réplica

2. Aislamiento de la réplica

3. Recogida de la réplica en red

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4. Sombreado de la réplica

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FIGURA 9 -2 4 V ista lateral de la obtención y tratamiento d e réplicas sombreadas (pasos 1-4). E n este caso, la réplica es sombreada después de su obtención. 1. Sombreado metálico (evaporación oblicua)

2. Obtención de la replica (película de carbono, evaporación perpendicular)

3. Disolución de la muestra biológica

4. Lavado de la réplica y recogida de la misma en red para su observación en el TEM

FIGURA 9 -25

En este caso, la m uestra es sombreada

(v. fig. 9-25), pero también puede reali­ zarse después (v. fig. 9-24). • Redes. Finalmente, se observan en el TEM.

Criotécnicas Las técnicas en frío buscan reducir los cam­ bios introducidos por los protocolos químicos convencionales. Todas ellas comienzan poruña criofijación, que sustituye a la fijación química. De esta manera se consiguen dos objetivos: • Evitar o reducir la pérdida de componen­ tes solubles o lábiles, ya que las criotéc­ nicas disminuyen la extracción de estos por los disolventes orgánicos.

tes de la obtención de la réplica.

• Conservar mejor la conformación de las moléculas y, por tanto, su reactividad quí­ mica. En consecuencia, las criotécnicas fa­ cilitan la detección de antígenos, enzimas, etc. mediante las técnicas citoquímicas. No obstante, las criotécnicas requieren apa­ ratos especiales, por lo que no se realizan de forma rutinaria en los laboratorios. En general, se aplican cuando los protocolos convencionales no dan resultados buenos. Pasos de las criotécnicas: • El primer paso es la criofijación. Consis­ te en una congelación muy rápida, con agentes criógenos. Seguidamente, puede

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

incluirse la muestra o cortarse directa­ mente: • Inclusión en resinas y corte. Se suelen elegir resinas polimerizables en frío (Lowycril®, LR White®), para mantener las condiciones de baja temperatura. • Crioultramicrotomía. La obtención de criocortes se realiza en aparatos es­ peciales y en criocámara.

Criofractura y criograbado Es una criotécnica que ha aportado una nueva perspectiva de las estructuras biológicas. El primer trabajo fue realizado por Moor et al. en 1961. Se trata de una criotécnica y, por tanto, elimina la fijación química. Sin embargo, ade­ más, sus imágenes son réplicas de superficie. En consecuencia, la criofractura consigue: • Eliminar los artefactos derivados de la deshidratación, de la inclusión y de los cortes finos. • Obtener imágenes con cierta tridimensionalidad (ya que son imágenes de réplicas). Pasos de la técnica (fig. 9-26): • C riofijación (paso común con otras enotécnicas). Seguidamente, se realizan

los pasos específicos que se indican a continuación. • «Fractura» por las superficies menos resistentes (frecuentemente, la superficie interna de las membranas). • Sublimación del hielo en vacío (etching). No siempre es necesario, pero suele hacerse. Los pasos finales tienen como objetivo obte­ ner una réplica sombreada: • Réplica. • Eliminar la muestra biológica. • Sombreado. Terminología: • Freeze-fracturing: «criofractura». Se rea­ lizan los pasos 1 ,2 ,4 , 5 y 6. No se lleva a cabo la sublimación del hielo (paso 3) (fig. 9-27A). • Freeze-etching o deep-etching: «criogra­ bado, criocorrosión». Se realizan todos los pasos (1-6), incluido el de la sublimación de hielo (fig. 9-27B). En sentido estricto, «criofractura» y «criograbado» o «criocorrosión» son términos diferentes, puesto que se refieren a procesos que generan imágenes distintas (v. fig. 9-27;

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Corte convencional

3 ®

5. Disolución de la muestra

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j.

6. bom breado de la répl ica

Nivel de hielo an terior

FIGURA 9 -2 6 Pasos de la técnica d e criofractura (1, 2, 4 , 5, 6) y criograbado (etching), que incluye el paso 3 (sublimación del hielo).

Técnicas en histología y biología celular

La criofractura pone al descubierto las caras internas de las membranas Partícula intramembranosa (proteina integral)

El criograbado pone al descubierto las superficies naturales de las membranas, ocultas antes por el hielo

Nivel de hielo: más bajo tras la sublimación

FIGURA 9-2 7 Comparación entre criofractura (A) y criograbado (B). (Modificado de Alberts B. Biología molecular de la célula. 4.a ed. Barcelona: Omega; 2004.)

Superficie interna (criofraccionada) d e la m em brana

FIGURA 9-2 8

Citoesqueleto

i

Superficies naturales de a m errb 'a n a

Comparación entre las estructuras celulares reveladas por criofractura y criograbado.

fig. 9-28). Sin embargo, como casi siempre se sublima el hielo, en la práctica a veces estas expresiones se utilizan indistintamente. La criofractura revela las superficies internas de las membranas, mientras que el criograbado muestra las naturales, así como la matriz citoplasmática (p. ej., citoesqueleto o ribosomas) o extracelular (p. ej., fibras de tejido conjuntivo).

Técnicas de mareaje en microscopía electrónica En microscopía electrónica pueden aplicarse todas las técnicas de mareaje desarrolladas primero al microscopio de luz. La mayor dificultad del procesamiento ultraestructural hace que, en general, sea más complicado obtener buenos resultados a este nivel. No obstante, la puesta a punto de dichas técnicas en microscopía electrónica produce, en gene­ ral, unos resultados mucho más informativos que en microscopía óptica.

Autorradiografía C onsiste en incorporar en células vivas un precursor radiactivo de una molécula (un aminoácido, un nucleótido, un azúcar, etc.), aprovechando la ruta biosintética de la misma (fig. 9-29). La célula incorporará en la molécula el precursor radiactivo, por lo que se podrá detectar radiactividad allí donde se localice dicha molécula. La muestra se cubre con una emulsión fotográfica. La radiación 3 emitida por la molécula radiactiva impresiona la emulsión que, tras su revelado, muestra marcas carac­ terísticas. Se suelen estudiar muestras fijadas a dife­ rentes tiempos tras la exposición al precursor radiactivo y así seguir la ruta metabólica de la molécula.

Métodos citoquímicos Consisten en la identificación de moléculas químicas específicas.

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

. Incubación. La radiactiv dad se detecta en el retículo rugoso, donde los ribosomas están sintetizando proteína.

I. Tras 20 min: marcas autorradiactivas en el aparato de Golgi.

205

3. Tras90 mimgranosde plata sobre los gránulos de secreción y en la luz.

FIGURA 9 -29 Esquem a representativo d e autorradiografías obtenidas en muestras de una célula secretora de proteínas, fijadas a diferentes tiempos: inm ediatamente después d e la incubación con aminoácidos radiactivos, a los 20 y a los 90 m inutos (min). E l desplazamiento de las m arcas revela la ruta biosintética de la proteína desde su biosíntesis en el retículo rugoso hasta su secreción por exocitosis.

Son métodos muy variados, según qué característica reconozcan de la molécula:

publicación MASSON. Fotocopiar:

• Métodos citoquímicos generales. Re­ conocen alguna característica química (carga, tipo enlaces, etc.). • Citoquímica de enzimas. Detecta activi­ dad enzimática mediante la incubación con sustratos. • Inmunocitoquímica. Reconoce antígenos mediante anticuerpos. • Hibridación in situ. Identifica secuencias de ácidos nucleicos mediante sondas complementarias. • Citoquímica de lectinas. Reconoce oli­ gosacáridos gracias a lectinas. También pueden identificarse receptores mediante ligandos. En todos los métodos citoquím icos es necesario contrastar los resultados con controles, que pueden ser ne­ gativos (los hay de diversos tipos) o positivos (consiste en incubar con tejido que posee la molécula a identificar). M étodos citoquím icos generales Existen técnicas adaptadas al ME que son más o menos específicas para la detección de: • Ácidos nucleicos (acetato de uranilo muy diluido). • DNA (Feulgen).

• RNA (acetato de uranilo + diferenciación con EDTA). • Algunas proteínas (metenamina plata para el grupo -SH). • Polisacáridos ácidos. Los polisacáridos con cargas negativas pueden contrastarse me­ diante la unión electrostática de cationes o partículas coloidales cargados positiva­ mente (soluciones de hierro [colorante de Hale], torio coloidal, rojo de rutenio, etc.), que son densos a los electrones. Se tiñen así el glicocálix, la matriz del cartílago, etc. • Lípidos. Más que teñir específicamente, lo que se intenta es reducir o evitar su extracción (reduciendo la deshidratación con alcoholes, utilizando bajas tempera­ turas, etc.). H istoenzimología ultraestructural El objetivo es la detección microscópica de enzimas al ME. La base conceptual es similar a la enzimohistoquímica aplicada al micros­ copio óptico (v. capítulo 5). La base de la técnica es la actividad in situ de la enzima: se incuba el tejido con un sustrato (S) adecuado, lo que origina un producto (P). Seguidamente se procede a la detección de este último. Dado que la mayoría de los productos de las reacciones enzimáticas son solubles,

Técnicas en histología y biología celular

habitualmente es necesario incubar también con un segundo reactivo (agente de captura). El agente de captura reacciona con el producto inicial y produce un precipitado insoluble (denominado «producto final de la reacción»). Sustrato

—» Producto —> Producto Enzima inicial Agente de final (PI) captura (PF)

Además, en el caso de que el producto final no sea denso a los electrones, hay que tratarlo para hacerlo denso y conseguir su visualiza­ ción al ME. Los agentes de captura pueden ser catio­ nes o moléculas orgánicas. Si los cationes son de metales pesados, las sales insolubles obtenidas son ya densas a los electrones. Si son moléculas orgánicas, suelen ser tratadas con tetróxido de osmio (fig. 9-30). Pasos de la técnica: • Fijación suave, para no alterar la activi­ dad de la enzima. La mayor parte de las enzimas son sensibles a los fijadores, por lo que es habitual que no se consiga una preservación ultraestructural tan buena como en los estudios convencionales. Se utilizan mezclas de aldehidos (fijación química) o criofijación. No se emplea tetróxido de osmio. • Incubación con el sustrato y el agente de captura. Es el paso más crucial de la técnica. Exige un control estricto de las condiciones de temperatura, del pH, etc. (que pueden influir en la actividad de la

enzima). De forma paralela, se llevan a cabo los controles (p. ej., incubación sin sustrato, para descartar falsos positivos). • Conservación y tratamiento del producto final de la reacción. Según sus caracterís­ ticas, puede necesitar o no un tratamien­ to. Algunos productos finales son densos, estables e inertes, por lo que no requieren un tratamiento especial. Este es el caso del ferrocianuro cúprico. Otros produc­ tos son menos estables (en tal caso es necesaria o aconsejable una posfijación antes de proceder a la deshidratación y a la inclusión) o bien claros a los electrones (en cuyo caso será necesario realizar la posfijación con osmio). La figura 9-31 ilustra la identificación ul­ traestructural de una enzima de membrana. Inm unocitoquím ica ultraestructural Los fundamentos de la inmunocitoquími­ ca ultraestructural son los mismos que los aplicados al uso del microscopio óptico (v. ca­ pítulo 6). Al igual que en las técnicas enzimohistoquímicas, se utilizan fijaciones suaves para lograr un equilibrio entre una buena conser­ vación antigénica y una adecuada preserva­ ción ultraestructural mediante las mezclas de aldehidos o la criofijación.

Marcadores para inmunocitoquímica al microscopio electrónico • Ferritina (fig. 9-32) (marcador parti­ culado; 1959): fue el primer marcador

FIGURA 9 -3 0 Ejem plo d e d etección d e la actividad enzim ática al m icroscopio electrónico. T ras la reacción enzimática, el producto inicial d e la reacción (PI) es transformado en una molécula insoluble (PF-1, producto final de la reacción 1). Si este no es denso a los electrones (e-), se le hace reaccionar con tetróxido de osmio ( 0 s 0 4), que lo fija y d a contraste, originando el PF-2.

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

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FIGURA 9-31 Epitelio excretor de un insecto. A ) Panorámica. B) Detalle del rectángulo. Identificación enzimohistoquímica de actividad A TPasa (flechas) en la membrana basolateral. (Por cortesía de la Dra. M ercedes Garayoa, Universidad de Navarra.)

utilizado en microscopía electrónica. Es una proteína que consta de un centro de hierro denso a los electrones (marcador propiamente), cubierto de apoproteína. Gracias a ella, puede unirse a proteínas (en concreto a anticuerpos), por lo que sirve de marcador en inmunocitoquímica. Enzimas (peroxidasa y diaminobencidina [DAB]; 1966): el marcador más frecuente es la peroxidasa, aunque se pueden utili­ zar diversas enzimas. El cromógeno con frecuencia es la DAB. Sus productos de reacción pueden difundir (más o menos), por lo que no se consigue un mareaje par­ ticulado. Esta difusión puede suponer una desventaja (si buscamos la localización fina) o una ventaja (si solo buscamos la detección del antígeno: se conseguirá una mayor superficie de mareaje). Oro coloidal (figs. 9-33 a 9-36) (marca­ dor particulado; 1971): es una técnica muy extendida en inmunocitoquímica ultraestructural, muy útil para cortes finos (v. fig. 9-33). El oro es muy denso a los electrones (más que la ferritina) y da un mareaje particulado, lo que origina una localización precisa del antígeno, y

Apoproteína

Anticuerpo (inm unoclobulina)

FIGURA 9-3 2 cuerpos.

Interacción de la ferritina c on anti­

permite realizar estudios semicuantitativos (al contrario que la DAB). El oro se une fácilmente a macromoléculas, por adsorción (v. fig. 9-34). Se puede unir a antígenos, a inmunoglobulinas (Ig) y a la proteína A (o G), que, a su vez, se unen a Ig. Existen, por tanto, muchas posibi­ lidades de amplificación de la señal. Se pueden utilizar partículas de oro coloidal de diferentes tamaños, lo que da posibili­ dades de doble y múltiple inmunotinción (v. fig. 9-35). Para más información, véa­ se el capítulo 6.

Técnicas en histología y biología celular

FIGURA 9 -33 D etalle de dos células endocrinas pancreáticas (A y D), tratadas con la técnica inmunocitoquímica de oro coloidal con anticuerpos específicos frente a somatostatina. L a célula D presenta m arcados sus granos de secreción, m ientras que la célula A, secretora de glucagón, no presenta mareaje. (Por cortesía del Dr. Juan Carlos Etayo, Universidad de Navarra.)

P ro ;e ir:i A

o" •

X

Oro

Antígenos

Oro ____________A n tígeno problema Inm unoglobina

FIGURA 9 -3 4

A

A

A n tin p n i

Interacción del oro coloidal con macromoléculas (antígenos, anticuerpos, proteína A).

B

FIG U R A 9-35 Las partículas de oro de diferente tamaño (A) permiten colocalizar diferentes antígenos presentes en la m isma m uestra (B). En este ejemplo, una enzima y un péptido regulador, presentes ambos en los m ismos granos de secreción. (P or cortesía del Dr. A lfredo Martínez, Universidad de Navarra.)

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209

FIGURA 9 -3 6 Epitelio de la ampolla rectal d e un insecto. Ambas imágenes corresponden a las interdigitaciones laterales (con mitocondrias) entre dos células adyacentes. A ) Contraste positivo rutinario. B) Técnica inmunocitoquímica con oro coloidal. E n A , se utilizó una fijación convencional (glutaraldehído al 4% y osmio), para preservar bien la ultraestructura. En B, se em pleó una fijación m uy débil (paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,1%) para preservar la antigenicidad d e la m olécula detectada (ATPasa de Na+/K+ de la membrana plasmática de las células). Aunque la ultraestructura está muy poco conservada, la reacción inmunocitoquímica es excelente. (Por cortesía de la Dra. M ercedes Garayoa, Universidad de Navarra.)

• Otros (hemocianina, anticuerpos mono­ clonales radiactivos [3H], etc.). ¿ 1 § | '■% ■I publicación MASSON. Fotocopiar:

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1 w ■| Jj ©

Algunos antígenos son resistentes y conservan su antigenicidad cuando se utilizan fijaciones relativamente fuertes. En otros casos, por el contrario, es necesario perder gran parte de la ultraestructura para conservar la inmunorreactividad del antígeno (v. fig. 9-36). Algunos antígenos muy lábiles solo pueden ser identificados en cortes de crioultramicrotomía.

OTROS TIPOS DE MICROSCOPIO ELECTRÓNICO: SEM, STEM, EFTEM Y FIB Fundamentos del SEM El SEM sirve para observar superficies en relieve (fig. 9-37) y analizar aspectos diversos de la composición de las muestras, En el SEM también existe un haz de electrones acelerados, enfocados hacia la muestra en una columna de vacío (fig. 9-38), pero, a diferencia del TEM, el haz no está fijo, sino

que se mueve y va rastreando continuamente la superficie de la muestra, de lo que deriva que se denomine «de barrido». Con la expresión «electrones primarios» se hace referencia a los emitidos por el ca­ ñón de electrones. Tras su interacción con la muestra, los electrones son recogidos por un detector y originan una imagen en un monitor de televisión.

Formación de la imagen en el SEM En el TEM, los electrones pueden atravesar la fina muestra (transmitidos) y originar, de este modo, la imagen (v. figs. 9-9 y 9-11). Por el contrario, en el SEM, la imagen no se forma a partir de los electrones transmitidos a través de la muestra, sino precisamente por los que no lo hacen (electrones retrodispersados), jun­ to con los electrones secundarios (v. fig. 9-8): • Electrones secundarios. Son los más im­ portantes. El impacto del haz primario de electrones sobre la muestra hace que los electrones situados en los orbitales periféricos de los átomos de la mues­ tra salgan despedidos. La cantidad de

Técnicas en histología y biología celular

FIG U RA 9 -3 7 Superficie del epitelio que reviste los bronquiolos vistos con el microscopio de barrido. Se diferen­ cian dos tipos de células: ciliadas (flecha roja) y secretoras (flecha blanca). Estas últimas poseen un abombamiento apical (asterisco), que se proyecta hacia la luz. (Por cortesía de D avid García Ros, Universidad de Navarra.)

Pantalla

Muestra

FIGURA 9 -3 8 D iseño del m icroscopio electrónico de barrido (v. texto). (Modificado de A lberts B. Biología m olecular de la célula. 4.a ed. Barcelona: Omega; 2004.)

electrones secundarios emitidos depen­ derá del ángulo de incidencia del haz de electrones primario. Los electrones secundarios son recogidos por un sensor capaz de relacionar la incidencia de los

electrones con el relieve de la muestra y de formar así una imagen de la superficie. • Electrones retrodispersados. Algunos de los electrones del haz primario «rebotan» en la muestra y también son recogidos

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

211

Haz incidente

FIG U RA 9 -39 Según el ángulo de incidencia del haz de electrones con la superficie de la muestra, se generan más o menos electrones (líneas punteadas gruesa y fina, respectivamente) y, por tanto, más o menos luz en la imagen del monitor.

por el sensor, lo que colabora a la forma­ ción de la imagen. El sensor de electrones va detectando diferen­ tes intensidades y ángulos de choque de los electrones secundarios en las diferentes zonas de la muestra a medida que el haz la recorre, lo que traduce a fotones. Cuanto más horizontal sea la superficie de incidencia, más señal se producirá y, viceversa, cuanto más vertical sea aquella, menos señal se generará (fig. 9-39). La imagen en relieve se visualiza en un mo­ nitor de televisión que recoge la señal am­ plificada de los impactos en el sensor. Para que la muestra em ita electrones tiene que estar recubierta por una capa de un material que tenga gran capacidad de trans­ misión de energía eléctrica (conductividad). De esa capa surgirán los electrones secunda­ rios que va a captar el detector. Por ello, los materiales inorgánicos, sobre todo los metálicos, son muy adecuados para ser observados con el SEM. En la mayoría de los casos, el material biológico necesita ser tratado para aumentar la conductividad.

Procesamiento de las muestras biológicas para el SEM El procesamiento de las muestras biológicas para el SEM es mucho más sencillo que para el TEM. Los pasos del protocolo para el SEM son los siguientes: • Limpieza de la superficie. Es muy impor­ tante, ya que justamente es la superficie la que se va a observar.

• Fijación. Su objetivo es evitar la distor­ sión u otros cambios estructurales. Suele servir la misma fijación que para el TEM (química o por frío). Si se requiere rea­ lizar un análisis de los elementos que forman la muestra, se deberá proceder a una criofijación. • Deshidratación. Se realiza con disolven­ tes orgánicos (alcoholes/acetona). • Secado. Se lleva a cabo para eliminar el medio deshidratante. Es una parte del proceso muy importante, en el que hay que evitar la distorsión de la superficie durante el paso de líquido a gas. El seca­ do al aire de las muestras suele generar distorsión. Normalmente se realiza en aparatos específicos, bien alcanzando una presión y temperatura en las que la tensión superficial es nula/cero (punto crítico), por lo que no se producirá distor­ sión, o bien mediante liofilización. Tras el montaje de la muestra, que se pega en un sustrato, se lleva a cabo el último paso. • Creación o aumento de la conductivi­ dad. En general, se realiza un sombreado metálico, que cubre la superficie de la muestra con un metal conductor (fre­ cuentemente oro/paladio). En algunos materiales (dientes, pelos, exoesqueletos, etc.), la fijación con osmio puede ser su­ ficiente.

Aplicaciones del SEM Se suele emplear para la observación tridi­ mensional de estructuras completas. Pueden observarse pequeños organismos a pocos

Técnicas en histología y biología celular

FIGURA 9 -4 0 Epitelio traqueal d e m amífero. Imágenes de barrido, original (A) y transformada a una versión coloreada (B) p o r una tabla de colores térmica (thermal-LUT). Obsérvese la superficie apical de células ciliadas y no ciliadas. (P or cortesía de D avid García Ros, Universidad de Navarra.)

aumentos, órganos o partes de órganos (cris­ talino, moldes vasculares), pequeñas estruc­ turas (esporas, polen) o células completas (eritrocitos, leucocitos, cultivos celulares, etc.). También pueden visualizarse orgánulos en células fraccionadas. Es relativamente frecuente colorear las imágenes digitalizadas del SEM mediante programas específicos, que transforman en colores las diferentes intensidades de gris de la imagen original (fig. 9-40). De esta mane­ ra, se resaltan las diferencias estructurales de las diversas regiones de la muestra. Además, con el SEM también se puede realizar un análisis de los elementos que componen la muestra (fig. 9-41). Para ello, se utiliza la emisión de rayos X, que ocurre tras la interacción del haz de electrones con la muestra (v. fig. 9-8), que son recogidos en un microanalizador.

EFTEM Se ha desarrollado recientemente un sistema (filtro de energía) para mejorar el contraste obtenido por los TEM convencionales. En el TEM con filtro de energía (EFTEM, energy filter transmission electron microscope), los

Si P

FIGURA 9-41 E spectro de em isión de un m uestra biológica (hueso humano prehistórico).

electrones que atraviesan la muestra pueden ser discriminados no solo por su grado de dispersión sino también por su energía. En este microscopio, los electrones que han experimentado una cierta dispersión inelástica, con pérdida de energía, son fil­ trados, de modo que no intervienen en la

Capítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

formación de la imagen. Se consigue así una mejora notable en el contraste y, por tanto, en su calidad. Además, según qué átomo haya producido la dispersión del electrón, la pér­ dida de energía será distinta. Si está equipado con el software oportuno, el EFTEM puede discriminar la composición química de las diversas zonas de la muestra, permitiendo así asociar la visualización directa con el análisis de los distintos elementos presentes en cada estructura.

STEM (scanning transmission electron microscope) Se trata de un microscopio que combina as­ pectos tanto del TEM como del SEM. Se utiliza en análisis de materiales y en aplica­ ciones biológicas. El STEM comparte con el TEM la recogida y el análisis de elec­ trones transmitidos a través de la muestra, pero también procesa y utiliza otras señales que no se analizan en el TEM convencional y que sí se recogen en el SEM: electrones secundarios y dispersados, rayos X, etc. Otro rasgo similar al SEM es que en el STEM se enfoca un haz de electrones muy fino sobre la superficie de la muestra y se va rastreando (scanning) sobre ella hasta recorrer toda la zona de interés. En los equipos de STEM fabricados solo para esa aplicación, la fuente de iluminación genera un haz de electrones finísimo, prácticamente monoatómico. En los equipos con función de STEM prácti­ camente todos los electrones que salen de la muestra (transmitidos, retrodispersados, etc.) son recogidos por uno de los detecto­ res especiales altamente optimizados. Estas señales se correlacionan con la posición cambiante del foco incidente para generar una imagen virtual. Uno de los rasgos más importantes del STEM es la fuente de emi­ sión del haz. El filamento de emisión de campo proporciona un brillo mucho mayor que el de tungsteno convencional y gene­ ra un haz finísimo subnanométrico que es enfocado sobre la muestra. Los detectores reconstruyen un mapa de alta resolución de la muestra, cada uno con la información específica que recoge de los diversos tipos de electrones que salen de la muestra. La

213

potencia del STEM hace que este sea consi­ derado una herramienta analítica de especial sensibilidad y capacidad de cuantificación. El hecho de que el haz incidente sea muy fino y que los detectores sean muy sensibles es importante pata el análisis de muestras biológicas, que normalmente resultan daña­ das por la radiación. Además, la adquisición secuencial de la señal procedente del rastreo de la superficie de la muestra permite utili­ zar métodos de procesamiento digital y de reconstrucción de la imagen. La resolución de este microscopio, cuando se usa un haz suficientemente fino y la corrección de la aberración de las lentes es adecuada, puede ser muy alta, de hasta 0,05 nm. En la rutina habitual, el STEM llega a una resolución de 2 nm, dados los lím ites derivados de la preparación de la muestra y los efectos sobre ella de la radiación. La gran ventaja del STEM sobre el TEM es que proporciona distintos tipos de información de la muestra, desde la distribución de masas de agrupa­ ciones supramoleculares hasta la concen­ tración de iones en orgánulos pequeños. En la práctica, el STEM no se utiliza para es­ tudiar la estructura primaria o secundaria de las proteínas (un objetivo que sí está den­ tro del campo de trabajo del TEM de alto voltaje), pero sí, por ejemplo, para analizar su estructura cuaternaria y distintos tipos de asociaciones supramoleculares.

Microscopio de FIB (focused ion beam) Este tipo de microscopía es casi idéntica al SEM, pero con una diferencia fundamental. Hasta ahora, el sistema de iluminación de los ME que hemos estudiado es un haz de elec­ trones acelerados y enfocados. Sin embargo, además de los electrones, en el átomo hay otras partículas cargadas (p. ej., el núcleo, que tiene carga positiva). Los núcleos ató­ micos con carga positiva, sin electrones, también pueden ser acelerados, desviados y enfocados. La diferencia fundamental es que la masa de estas partículas acelera­ das es mucho mayor y la interacción con la muestra tiene efectos mucho más notables. En concreto, los iones cargados acelerados

Técnicas en histología y biología celular

sobre la muestra desplazan átomos ioniza­ dos, moléculas, etc. de la superficie de la muestra mediante un proceso denominado «sputtering». Estos átomos desplazados de la muestra (iones secundarios) pueden ser usados para formar una imagen o para analizar la composición de la muestra. La capacidad de interacción de los átomos acelerados y la muestra también es aprove­ chada como herramienta de modificación de la superficie de la muestra. El microscopio de FIB modifica directamente la superficie de la muestra (milling) con un efecto similar al producido por una fresadora de superficie. Este efecto de dibujo superficial puede ser controlado con niveles de precisión nanométricos. De este modo, es posible manipular cualquier muestra con una precisión asom­ brosa. Asimismo, a través de ciertas modi­ ficaciones técnicas, sobre la superficie de la muestra se pueden depositar materiales diversos con un grado de precisión similar. De ahí que el sistema de FIB se utilice muy frecuentemente en procesos industriales en

el ámbito de la nanotecnología o de la pro­ ducción los microcircuitos y nanocircuitos integrados.

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C apítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

214.e1

Actividades t . Entre las p o sib ilid a d es señ alad as a la d e re c h a (A -J), e lija la té c n ic a de m ic ro s­ co p ía idónea para la identificación o visua­ lizació n de las siguientes estructuras (1 -10). 1.

Virus

Criofractura

2.

Lípidos insaturados

M icroscopio de barrido (SEM)

3.

Estructura de las mitocondrias

Crioultramicrotomía

4.

Forma de los eritrocitos

Contraste negativo

5.

Ácidos nucleicos in to to

Inmunocitoquímica

6.

Proteínas integrales de membrana

Criofijación/ resina hidrófila e inmunocitoquímica

7.

Hormonas de células endocrinas

Inclusión, corte y contraste positivo

8.

Detección de antígenos lábiles

Fijación con tetróxido de osmio

9.

Gotas de lípidos saturados

Detección de rayos X (SEM)

10. Análisis de elementos químicos

Sombreado metálico

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Respuesta: 1 -D (o J), 2 -H , 3 -G , 4-B, 5-J, 6-A, 7-E, 8-F, 9-C , 10-1.

I w 3

2. ¿Se ha utilizado tetróxido de osm io para o btener esta imagen? R azone su respuesta.

FIG U RA e9-1 Interdigitaciones de dos células trans­ portadoras de agua e iones. (Por cortesía de Ana Ortiz de Zarate, Universidad de Navarra.) Respuesta: s í, porque las m em branas se ven densas a los electrones. El tetróxido de o sm io ha re a c cio n a d o co n los dobles enlaces de los fosfolípidos de la m embrana, dando adem ás densidad electró n ica por el elevado peso atóm ico del osm io.

Técnicas en histología y biología celular

214.e2

3 . Las cuatro electronografías correspon­ den a panorám ica (arriba) y detalle (abajo) de dos c é lu la s secretoras de in su lin a (iz ­ q uierda y derecha). ¿Cuál de las dos células (A/B o C /D ) tien e una fija ció n m ás ligera? ¿Por qué?

FIGURA e9-2 A-B) Célula beta de renacuajo. (Por cortesía de Ana Ortiz de Zarate, Universi­ dad de Navarra.) C-D) Célula beta de ratón. (Por cortesía de Oihana Garmendia, Universidad de Navarra.)

Respuesta: la cé lu la de la derecha está m enos fijada: no se ven bien las membranas y hay más pérdida de m aterial. Corresponde a una té cn ica in m u n o citoq u ím ica con oro c o lo id a l: por eso se fijó m ás d éb ilm ente, p ara c o n serva r m ejo r la a n tig en icid ad de la insulina.

C apítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

214.e3

4 . Identifique las técn icas utilizadas en las siguientes imágenes.

FIGURA e 9 -3 A ) C élula endocrina de la hipófisis de una rana. (Por cortesía de M aría Collantes, Universidad de Navarra.) B ) Corte transversal de m icrovellosidades d e los tubos de M alpigio de una hormiga. (Por cortesía de Mercedes Garayoa, Universidad de Navarra.)

R e sp u e sta : am bas corresponden a téc­ n ica s de m areaje.

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publicación MASSON. Fotocopiar:

§ 8 :§ I

I w 3

5 . Identifique los artefactos (cam b ios en la estru ctu ra c e lu la r) in tro d u cid o s po r el procesam iento histológico. • Mareaje particulado (doble inm unocito­ R esp u e sta: q u ím ica con oro colo id al). Corresponde al m areaje de dos hormonas peptídicas A. D estrucció n celular. M ala fija ció n . d iferentes, que co lo ca liza n en los misB. Extracció n de sustancias (huecos en el m os granos de secre ció n . Los dos anticitoplasm a). cuerpos utilizad o s se han m arcado con C . Rotos en el tejido. Fallos en la inclusión oro de 2 0 y 10 nm , respectivam ente. o en el m anejo del ultram icrotom o para • Mareaje difuso. Se trata de una reacción rea liza r el corte fino. d e e n zim o h isto q u ím ica, p o siblem ente D . R ayas en el corte. Producidas con el ul­ con m arcador en zim ático. Se observa el tram icrotom o. C u ch illa en m al estado. m areaje sobre m icro vellosid ad es. Se ha d etectado un a e n zim a de m em brana.

214.e4

C

Técnicas en histología y biología celular

D

FIG U RA e 9 -4 Electronografía de secciones de diversos epitelios. (Por cortesía del Departamento de Histología, Universidad de Navarra.)

C apítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

6 . ¿A q u é corresp o nd e la im agen? ¿Con qué técn ica se ha realizado? ¿Q ué informa­ c ió n nos da? ¿Q u é d iferen cia hay entre la parte superior y la inferior de la imagen? R esp u e sta : la imagen muestra viru s con la té c n ic a de con traste ne g ativo . El c o n ­ traste, denso, rodea a los viru s. Adem ás, el contraste tam bién se ha introducido entre lo s c a p só m e ro s q u e fo rm a n la c u b ie rta

publicación MASSON. Fotocopiar:

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FIGURA e9 -5 Navarra.)

214.e5

del v iru s (h u m ific a ció n ). Esta té c n ic a nos reve la la form a del v iru s, su tam año y los capsóm eros. La m itad inferio r de la imagen tiene la cantidad de contraste adecuado , mientras que en la parte superior hay un exceso , que tap a p a rc ia lm e n te a los v iru s o los h a ce parecer algo más pequeños.

V irus observados con contraste negativo. (Por cortesía d e D avid G arcía Ros, U niversidad de

Técnicas en histología y biología celular

214.e6

7.

¿Cóm o se ha obtenido esta imagen?

R e s p u e s ta : la im agen se ha obtenido con un m icroscopio electrónico de barrido, y a q ue es u na im agen trid im e n sio n a l, en la qu e se o b se rva m uy b ien el v o lu m en de la muestra biológica. Corresponde a pul­ m ón de m am ífero. Se aprecian los alvéolos p ulm o nares (flecha azul), y eritro citos de un va so fra c cio n a d o (flecha roja). Puede apreciarse la m orfología tridim ensional de los alvéolo s y de los eritrocitos.

FIGURA e 9 -6 Imagen de barrido de alvéolos pulmo­ nares. (Por cortesía de D avid García Ros, Universidad de Navarra.)

AUTOEVALUACIÓN 1. Los electrones del m icroscopio elec­ trónico de transmisión (TEM): a . Surgen del ánodo. b. Son desviados por el cañón de elec­ trones. c . Son desviados por los átomos de la muestra. d. Generan campos electromagnéticos en las lentes. e . Son proyectados desde la lente proyectora a la lente objetivo. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: los electrones sur­ gen del filamento metálico (cátodo) incluido en el cañón de electrones y son desviados al atravesar la muestra, especialmente por los núcleos atómicos de elevado peso molecular que se han utilizado como contraste. Las lentes generan los campos electromagnéticos que dirigen al haz de electrones en su reco­ rrido por la columna del TEM, hasta alcanzar la lente proyectora, que proyecta el haz de electrones sobre la pantalla. 2. Señale cuál de los siguientes elementos no sirve para dar contraste al TEM:

a.

Oro.

b. Carbono. c.

Platino.

d. Uranio. Plomo. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el carbono, ya que tiene un peso atómico pequeño y, por tanto, desviaría muy poco los electrones. 3. El fijador ideal para las membranas bio­ lógicas es: a . El formol. b. El tetróxido de osmio. c . El glutaraldehído. d. La combinación de tetróxido de os­ mio y glutaraldehído. e . Cualquiera de los anteriores. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: dado que la mem­ brana contiene lípidos insaturados y pro­ teínas, la mejor fijación se obtendrá combi­ nando el tetróxido de osmio (que reacciona con los dobles enlaces de los lípidos) y el glutaraldehído (que reacciona con grupos reactivos de las proteínas). e.

C apítulo | 9 Técnicas básicas de microscopía electrónica en biología

4. ¿Cuál de las siguientes técnicas serviría para observar el citoesqueleto de las cé­ lulas? a. Fijación, inclusión y corte fino. b. Aislamiento y contraste negativo o sombreado metálico. c. Criograbado. d. Técnicas inmunocitoquímicas con oro coloidal. e. Cualquiera de las anteriores. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: todas ellas nos mos­ trarían el citoesqueleto: los cortes (seccio­ nados sus componentes de modo longitudi­ nal, transversal u oblicuo), las extensiones (delimitados sus filamentos por el contraste negativo o resaltados por el sombreado), el criograbado (expuesto al sublimarse el hielo) o los anticuerpos frente a sus componentes (que quedarían decorados por las partículas de oro). 5. ¿Cuál de las siguientes técnicas sería la idónea para cuantificar los poros nuclea­ res? a. Cortes finos seriados. b. Cortes finos seriados con inmunoci­ toquímica. c. Criofractura. d. Microscopio electrónico de barrido (SEM). e. Contraste negativo. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la criofractura, ya que, al fracturarse las células espontáneamen­ te por las superficies membranosas, muchas de ellas lo harán por la envoltura nuclear, lo que originará una imagen tridimensional, relativamente completa, de los núcleos. El estudio de los cortes finos seriados es, teóricamente, posible, pero tiene dos des­ ventajas: que parte de los cortes habitual­ mente no son útiles (grosor excesivo al cortar, pliegues, precipitados del contraste, etc.) y que, además, resultaría un trabajo mucho más largo y tedioso. 6. Para estudiar la ruta biosintética y el des­ tino de una nueva proteína, utilizaría: a. Inmunocitoquímica. b. Autorradiografía. c. Aislamiento de la proteína y contraste negativo.

214.e7

d. Criofractura. e. Criograbado. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la autorradiografía permitirá ver, a lo largo del tiempo, los mo­ vimientos de la proteína desde su biosíntesis (ribosomas libres o retículo rugoso y aparato de Golgi) hasta su localización final (cito­ plasma, lisosomas, membrana plasmática, etc.). 7 . La ferritina: a . Es una proteína natural formada por hierro y apoproteína. b. Es un marcador enzimático. c. Origina mareaje difuso. d. Se utiliza en técnicas enzimohistoquímicas e inmunocitoquímicas. e. Se une a los antígenos por la apo­ proteína. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: es una proteína sin actividad enzimática, que origina mareaje particulado y que se utiliza en técnicas in­ munocitoquímicas por su capacidad de unirse a los anticuerpos mediante su apoproteína. 8. Los electrones retrodispersados del mi­ croscopio electrónico de barrido: a . Surgen del cañón de electrones y for­ man el haz que incide en la muestra. b. Provienen de la muestra estudiada. c. Se transforman en electrones prima­ rios. d. Generan, junto con los electrones secundarios, las imágenes de barrido. e. Son electrones transmitidos. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: los electrones re­ trodispersados son aquellos del haz primario que, al llegar a la muestra, rebotan y contribu­ yen, junto con los secundarios (provenientes de la muestra), a formar la imagen, si bien con menor importancia que estos últimos. No son, por tanto, electrones transmitidos, ya que no atraviesan la muestra. 9. Para el análisis de la composición atómi­ ca de una muestra, utilizaría: a . Un SEM (microscopio electrónico de barrido). b. Un TEM (microscopio electrónico de transmisión). c. Técnicas inmunocitoquímicas.

214.e8

d. Técnicas autorradiográficas. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta: la microscopía electróni­ ca no permite el análisis atómico. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: los SEM, además de generar imágenes tridimensionales, con­ tienen un microanalizador que estudia la emisión de rayos X proveniente de la muestra tras su interacción con el haz de electrones. Dicha emisión de rayos X es diferente según la composición atómica de la muestra. 10. En el microscopio de barrido y trans­ misión (STEM): a. Se recogen electrones secundarios y retrodispersados. b. El haz de electrones es más fino que en el TEM convencional.

Técnicas en histología y biología celular

c. El haz de electrones rastrea la super­ ficie de la muestra. d. La resolución puede llegar a 0,05 nm. e. Todas las respuestas anteriores son correctas. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: el STEM comparte con el TEM la recogida y el análisis de elec­ trones transmitidos a través de la muestra, pero también utiliza otras señales, como electrones secundarios, electrones retrodis­ persados, rayos X, etc. Un rasgo similar al SEM es que en el STEM se enfoca un haz de electrones muy fino, subnanométrico, sobre la superficie de la muestra y se va rastreando (scanning) sobre ella.

Microscopio de fuerza atómica: fundamentos y aplicaciones en biología y biomedicina Jordi Alcaraz C asadem unt

INTRODUCCIÓ N El microscopio de fuerza atómica (MFA), conocido también como microscopio de ba­ rrido de fuerzas (SFM, scanning force mi­ croscopy), es una nanotécnica de sonda local que pertenece a la extensa familia de micros­ copios de barrido de sonda (SPM, scanning probe microscopies). El MFA fue introducido por Binnig, Quate y Gerber en 1986, y es el más versá­ til de la familia de los SPM, ya que puede utilizarse como instrumento de visualiza­ ción, sensor/actuador de fuerzas o sensor biomolecular. El MFA perm ite visualizar muestras con reso lución nanom étrica y detectar fuerzas intermoleculares tan débiles como un solo puente de hidrógeno. Además, el MFA permite examinar muestras en am­ biente líquido. Todo ello hace que el uso de este instrumento sea una nanotécnica muy útil para la biología y la biomedicina (cuadro 10-1). El M FA se ha usado para exam inar muestras de todos los grados de compleji­ dad biológica, incluidos biomoléculas, virus, microorganismos, células eucariotas y, más recientemente, tejidos. Por otro lado, sus aplicaciones biomédicas van en aumento, entre las que destaca el desarrollo de biosensores para el diagnóstico del cáncer y otras patologías. © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA Requerimientos básicos de un MFA Los principales componentes de un MFA son cuatro (fig. 10-1A): • Sonda del MFA o sensor de fuerzas: consiste en una punta afilada de cerca de 3 |xm de altura cuyo extremo es apro­ ximadamente esférico, con un radio de cerca de 10 nm. La punta está localizada en el extremo de una diminuta viga en voladizo flexible (cantilever en inglés, también denominada «micropalanca»), muy delgada y de unos 100 fim de lon­ gitud, hecha de silicio o nitruro de sili­ cio. Con ello, el aspecto de las sondas es parecido al de una aguja de tocadiscos a escala micrométrica (fig. 10-IB). La tabla 10-1 muestra un resumen de propie­ dades físicas de las sondas de MFA. La mayoría de puntas tienen una geometría piramidal, aunque también pueden en­ contrarse esféricas o cilindricas. Cuando la fuerza de interacción entre la punta y la superficie de la muestra supera cierto umbral, el extremo de la micropalanca se flexiona verticalmente una distancia d. Para pequeñas flexiones, la micropalanca se comporta como un muelle elástico, lo cual permite aplicar la ley de Hooke para calcular la fuerza F causante de la flexión como F = k X d, donde k es la constante 215

Técnicas en histología y biología celular

Cu ad ro 10-1 M ensajes clave • Los componentes esenciales de un m i­ croscopio de fuerza atómica (MFA) son el sensor de fuerzas y el microposicionador piezoeléctrico. • El MFA permite visualizar la superficie de muestras biológicas por «palpación» me­ diante una punta nanométrica localizada en el extremo de una micropalanca flexible, que actúa como sensor de la fuerza puntamuestra. • Rastreando la punta sobre la superficie de la muestra manteniendo la fuerza puntamuestra constante con un sistema de con­

trol, permite obtener un mapa de la topo­ grafía de la muestra. La elevada resolución espacial y de fuerzas del MFA permite visualizar y manipular muestras biológicas de todos los grados de complejidad, desde moléculas de DNA individuales hasta fragmentos de tejidos. El MFA permite examinar muestras biológi­ cas en su ambiente fisiológico acuoso. Funcionalizando la punta del MFA, se pue­ den medir las fuerzas que median los pro­ cesos de reconocimiento molecular de tipo ligando-receptor o antígeno-anticuerpo.

CONTACTO

CONTACTO INTERMITENTE Microposicionador

FIGURA 10-1 Principio de funcionam iento de un m icroscopio de fuerza atómica (MFA). A) Esquema con los componentes básicos de un MFA. B) Imagen de microscopía electrónica de barrido de un grupo de sondas con geome­ tría triangular y rectangular de M FA (izquierda). D etalle de la punta de una de las sondas (derecha). C) Esquema del uso del M FA para obtener imágenes topográficas en modo de contacto (arriba) o de contacto intermitente (abajo).

elástica de la micropalanca. Para aque­ llas con geometría rectangular, k puede calcularse como: Ewt3 ~ 4L3 donde E es el módulo de Young, t es el grosor, w es la anchura y L es la longitud

de la micropalanca. El rango disponible para k es 0,01 - 10 N/m. En función de la sonda, la fuerza mínima detectable puede ser tan pequeña como la de un solo puen­ te de hidrógeno (~10 pN), o tan grande como ~0,1 p-N. ' Sistema óptico de detección de la flexión de la micropalanca: para medir la flexión

Capítulo | 10 M icroscopio de fuerza atómica

TABLA 10-1 Resumen de propiedades físicas de las sondas de un m icroscopio de fuerza atóm ica Propiedad

Nitruro de silicio (Si3N 4)

Silicio

Módulo elástico de Young (Gpa) Densidad (kg/m3) Carga Longitud (jim) Grosor (jtm) Anchura (jjim) Radio del extremo de la punta (nm) Altura de la punta (jim) Constante elástica (N/m) Frecuencia de resonancia (kHz)

150 3.000 Negativo 100-200 1. e. Solo en imágenes de color. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la inversión de la imagen no afecta de manera alguna a la lumi­ nosidad de los píxeles de una imagen. 11. Asuma una imagen de tamaño 100 X 100 píxeles y profundidad de color de 8 bits en la que la densidad óptica (DO) de to­ dos los píxeles tiene el mismo valor = 1. El valor de la densidad óptica integrada (DOI) de la imagen es igual a: a. El valor medio de la DO de los píxe­ les de la imagen. b . La suma de la DO de todos los píxe­ les de la imagen.

c. 1. d. 100. e. 80.000. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la DOI se define como el sumatorio de las DO de cada punto de la región considerada. 12. Se ha detectado la localización de la pro­ teína PCNA (proliferating cell nuclear antigen) en criosecciones por medio de

249.e4

técnicas de inmunofluorescencia utilizan­ do un anticuerpo marcado con fluoresceína. Deseamos cuantificar la cantidad de PCNA en cada célula del tejido pre­ sente en la sección. A la hora de salvar las imágenes capturadas para su posterior análisis, ¿cuál de las siguientes opciones sería más apropiada? a. Salvar las imágenes en color (RGB) y con profundidad de 32 bits. b. Salvar las im ágenes en escala de grises con una profundidad de 8 bits. c. Salvar las imágenes en escala de gri­ ses con una profundidad de color de 32 bits. d . Salvar las imágenes en formato JPEG con compresión 1:100. e. No se pueden realizar mediciones densitométricas en imágenes obteni­ das en microscopios de fluorescencia. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: las mediciones den­ sitométricas son más precisas en imágenes con profundidades de color más altas. 13. Con objeto de estudiar el efecto de un nuevo fármaco para la fibrosis hepática, se exponen ratones con esta patología a concentraciones crecientes de dicho fárm aco. Posteriorm ente se realizan secciones de parafina de hígado que se tiñen con la tinción tricrómica de Masson, la cual tiñe las áreas afectadas con fibrosis de azul y el tejido hepático sano con una tonalidad rojiza. ¿Qué técnica de análisis de imagen sería más adecuada para evaluar si el fármaco es efectivo en el tratamiento de la fibrosis hepática? a. Salvar imágenes en alta resolución y realizar densitometría de tejido hepático sano. b. Realizar segmentación por el método de Otsu y cuantificar la densidad óp­ tica. c. Realizar segmentación por colores de áreas fibróticas (azul) y de tejido sano (rojizo) y compararlas. d. Realizar segmentación por colores de áreas fibróticas (azul) y de tejido sano (rojizo) y calcular sus números respectivamente.

Técnicas en histología y biología celular

e. Comparar la dimensión fractal de imágenes de hígados de ratones trata­ dos con diferentes dosis del fármaco. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: dado que las re­ giones de interés en la imagen pueden ser claramente diferenciadas por su color, la segmentación por colores (áreas fibróticas azules y tejido sano rojizo), seguida de la medición de las correspondientes áreas, pro­ vee el método más eficiente para evaluar si el fármaco reduce la fibrosis hepática. 14. ¿Qué técnica utilizaría para separar dos objetos circulares que se solapan en una imagen binaria? a. Aumento de contraste de la imagen. b. Erosión. c. Dilatación. d. Opening. e. Closing. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la erosión consiste en la eliminación de una capa de un pixel (o más) al borde de un objeto en una imagen binaria. Esta operación se utiliza para separar objetos que se encuentran unidos en la imagen binaria. 1 5 .Utilizando anáfisis de imagen en seccio­ nes histológicas, ¿qué técnica(s) utilizaría para evaluar de la manera más completa posible el efecto de bevacizumab en la vasculatura tumoral de melanomas? a. Segmentar capilares por medio del cálculo de tubeness. b. Medición del área y la tortuosidad de los capilares. c. Cuantificar la dimensión fractal de los capilares. d. Calcular la distribución de frecuen­ cias de los diámetros de los capilares. e. Todas las respuestas son correctas. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: todas las respuestas son correctas. La segmentación de capilares se realiza de manera eficiente calculando el valor de tubeness de los objetos de la imagen. Asimismo, varias métricas pueden ser utiliza­ das para describir efectos de un fármaco en la vasculatura tumoral como el área, el diámetro o la tortuosidad de los capilares, así como su dimensión fractal.

P á g in a d e li b e r a d a m e n t e e n b la n c o

Métodos estereológicos en histología y biología celular Luis Santamaría Solís

INTRODUCCIÓ N Aunque la ciencia morfológica fue inicial­ mente descriptiva, desde siempre se vio la necesidad de comprender la realidad física mediante «figuras y movimientos» (René Descartes) y, de hecho, en cualquier des­ cripción anatómica o histológica existe un componente cuantitativo (una estructura es más grande que otra, parece haber más células en esta región que en aquella, los nu­ cléolos de estas células sometidas a un deter­ minado tratamiento son más evidentes que en las células control, etc.)- Se hace necesario pasar de la descripción semicuantitativa a la estimación propiamente cuantitativa, que siempre es de naturaleza estadística (por eso se denomina «estimación»), ya que habitual­ mente solo se tiene acceso a una porción de la población objeto de estudio (muestra), ya sean neuronas, próstatas, biopsias o animales de experimentación. Hay que precisar que con alguna fre­ cuencia la cuantificación es irrelevante (p. ej., cuando una colección de estructuras pasa de todo a nada o cuando las diferencias de tamaño, número, etc. entre dos poblacio­ nes celulares son tan grandes que no tiene sentido obtener «números» que las diferen­ cien). Es necesario tener muy claro que las grandes listas de parámetros morfométricos que a veces ofertan los sistemas de análisis de imagen pueden no tener ningún sentido a la hora de explorar un aspecto experimental o patológico en el terreno de la morfología. Los números, los datos, por muy precisos © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

que sean, pueden ser perfectamente pres­ cindibles o, lo que es peor, no indicar nada sobre la realidad biológica que estudiamos: aunque las diferencias sean significativas, los números pueden ser insignificantes (Al­ berto Sois). Por ello, lo primero que hay que hacer a la hora de abordar un estudio presuntamente cuantitativo es preguntarse si merece la pe­ na cuantificar o solo describir, y si la cuanti­ ficación morfológica no puede ser sustituida con ventaja por algún otro tipo de abordaje bioquímico o de biología molecular. Una vez sentado el interés de la cuantifi­ cación nos podemos hacer las preguntas que se indican a continuación. ¿Qué nos interesa cuantificar? En general se plantean cuatro tipos de propie­ dades físicas susceptibles de cuantificación morfológica: • Tamaño: ya sea de poblaciones celulares (número absoluto, densidad numérica) o volúmenes celulares, de compartimentos histológicos, de órganos, etc. • Forma: irregularidad nuclear, factores de forma, contornos nucleares o celulares. • Topología: relaciones de distancia entre elementos, orientación y posición. • Función: toda cuantificación morfológica tiene que dar razón, en última instancia, de la función, normal o patológica, y plantearse correlaciones histofisiológicas. En este capítulo nos vamos a centrar en la cuantificación del tamaño, ya sea de la can­ tidad de elementos (número de células) o del 251

Técnicas en histología y biología celular

volumen ocupado por estructuras (núcleos, células, órganos). ¿Cómo cuantificar? La cuantificación es una metodología que se viene practicando desde los albores de la histología; no es el momento de hacer historia de las diversas técnicas morfométricas, planimétricas, etc. que se han venido utilizando desde hace dé­ cadas. Muchas de ellas han sido útiles para un mejor conocimiento de la estructura celular y tisular; sin embargo, con mucha frecuencia no están libres de errores sistemáticos (sesgo) o precisan asumir geometrías particulares para las estructuras objeto de estudio (con­ vertir los núcleos en esferas o en elipsoides), lo cual conlleva también posibles sesgos en la estimación. Por ello, únicamente nos vamos a referir a las metodologías estereológicas, que se presentan como herramientas libres de ses­ go que aprovechan propiedades geométricas intrínsecas de las estructuras a cuantificar. La siguiente pregunta es, por tanto, acerca de la definición de la estereología. ¿Qué es la estereología? Se trata de un conjunto de métodos morfométricos que obtienen datos cuantitativos tridimensiona­ les (3D) a partir de elementos bidimensionales (2D) utilizando propiedades geométricas in­ trínsecas a la estructura que se está estudiando. La estereología se relaciona con la rea­ lización de estimaciones cuantitativas de características geométricas del objeto de interés (número de partículas, longitudes, superficies, volúmenes, etc.).

INFORMACIÓN ELEMENTAL SOBRE ANÁLISIS DIMENSIONAL Para entender lo que sigue, es preciso dar antes unas breves notas sobre el análisis dimensional. Se trata de una disciplina del campo de las matemáticas que suministra a los físicos herramientas y procedimientos para estudiar los cambios dimensionales y de unidades de medida en diversos procesos operacionales. Aquí solo nos interesa des­ cribir brevemente las unidades de longitud, superficie y volumen. Las dimensiones topológicas de una es­ tructura varían, a los efectos que aquí nos

interesan, entre cero y tres. Un ejemplo de elemento de cero dimensiones es el punto; de una dimensión, la línea, ya sea abierta o cerrada (perímetro); de dos dimensiones, la superficie, y de tres, el volumen. A su vez, cualquiera de estos elementos (de cero, una, dos y tres dimensiones) se encuentran sumer­ gidos en un espacio (en nuestro caso euclidiano) al que se le asignan tres dimensiones. Estrictamente hablando, toda estructura física (incluidos átomos y moléculas) sería 3D, pero a efectos prácticos podemos «reducir» las dimensiones a la más predominante en el terreno de la medición concreta; por ejemplo, de una fibra nerviosa se puede considerar exclusivamente su longitud (ID), de un corte histológico su superficie (2D) y de un núcleo celular su volumen (3D). En todo caso la notación que se sigue pa­ ra caracterizar las dimensiones y unidades de medida de los distintos elementos consiste en elevar a una potencia (0 ,1 ,2 , 3) el elemento de longitud designado por L; así, un punto (cero dimensiones) se representará por L°; un perímetro, por L 1; un plano, por L2 (L1X L 1), y un volumen, por L3 (L1 X L1 X L 1). Combinando estos elementos, se pueden deducir las unidades de diversos parámetros de medición; por ejemplo, una densidad numérica (número de células por unidad de volumen) será L°/L3 = L-3; una densidad o fracción de volumen ocupada por un elemen­ to, L3/L3 = L° (es decir, adimensional); una densidad de longitud (p. ej., longitud de un vaso sanguíneo por unidad de volumen), L 1/ L3 = L-2, etc. A la hora de indicar las unida­ des, L se expresa en unidades del sistema mé­ trico decimal, usualmente en histología serán micrómetros (|xm), milímetros (mm), etc.

RELACIONES ENTRE EL M UNDO REAL Y EL HISTO LÓ GICO Cuando se efectúa un corte a través de es­ tructuras 3D (L3) se originan perfiles o tran­ secciones 2D (L2); una estructura 3D com­ pleja puede generar varias transecciones. Las estructuras 2D en los cortes originan perímetros (estructuras ID, L 1)- En el corte, las estructuras ID , o longitudes, generan elementos adimensionales (puntos, L°); es

Capítulo | 1 2 Métodos estereológicos en histología y biología celular

decir, eventos contables (no mensurables). Resumimos esto en el cuadro 12-1. Del anterior esquema se desprende que el muestreo de una estructura tisular 3D mediante la obtención de cortes (2D, si des­ preciamos su grosor) opera una reducción de una dimensión sobre todos los elementos topológicamente reconocibles en dicha es­ tructura. C u ad ro 12-1 R elaciones e n tre el m un d o real (tridim ensional [3D]) y las se cc io n e s b id im en sio n ales (2D) M u n d o real (3D ) —>

Secció n (2D )

V o lu m en (L 3)

T ransecciones (L2)

—>

(pueden ser m últiples) S uperficie (L2)

Perím etro (L ‘)

L on g itu d ( L 1)

Evento co n tab le (L°)

Volumen (L3)

253

¿EN QUE CONSISTE LA ESTIMACIÓN ESTEREOLÓGICA? La esencia de la estimación estereológica consiste en producir el encuentro al azar de una sonda de medida (puntos, líneas, planos o volúmenes) con la característica geométrica del tejido que deseamos evaluar; de esta in­ tersección se genera un evento (impacto) que siempre es de cero dimensiones (fig. 12-1).

ALGUNAS DEFINICIONES DE INTERÉS EN ESTEREOLOGÍA Espacio de referencia Es el ámbito al que se refieren las estima­ ciones, usualmente un volumen, aunque a veces es útil referirlas a un área (p. ej., si estamos evaluando el número de neumocitos, se puede obtener una información fisiológica relevante si se refieren al área de superficie alveolar) o a longitudes (p. ej., cuando eva­ luamos el número de células endoteliales por

Superficie (L3)

Longitud (L1)

Número (L°)

FIGURA 12-1 Representación de las intersecciones de diversas sondas estereológicas, L° a L3 (puntos, lineas, planos y volúmenes), con las características geométricas estimadas en estructuras histológicas (volúmenes, superficies, longitudes y número de elementos). El evento registrado en la intersección de la sonda y el objeto es siempre un impacto (L°).

Técnicas en histología y biología celular

unidad de longitud de membrana basal del capilar); incluso se puede tomar como es­ pacio de referencia de una población celular otra población celular relacionada con la an­ terior y puede ser interesante, por ejemplo, contar el número de células basales de un epitelio y referirlo al número total de células (columnares más basales) de ese epitelio. El espacio de referencia se puede consi­ derar como la unidad fundamental de muestreo, es decir, el ámbito donde se seleccionan los elementos que se van a medir. Su de­ finición es crucial en un experimento. Por ejemplo, no es lo mismo referir el número de neuronas de la corteza cerebral al volu­ men ocupado por el córtex o al de todo el encéfalo; la densidad neuronal variará os­ tensiblemente con la elección de uno u otro espacio de referencia. Con frecuencia, en estereología se em­ plean estimaciones que son ratios o propor­ ciones entre un estimador y otro que puede ser considerado como espacio de referencia. Estas estimaciones se suelen denominar «densidades», en analogía al concepto de densidad física, que es una proporción entre el peso de una sustancia y el volumen que ocupa. Para la notación de estos estimadores relativos se sigue la convención de colocar como subíndice el espacio de referencia; así, tendremos: • Densidad numérica (número de células por unidad de volumen): Nv. • Densidad de volumen (fracción de volu­ men que ocupa un elemento dentro de un volumen de referencia): Vv. • Densidad de longitud (longitud de un ele­ mento lineal por unidad de volumen): Lv. • Densidad de superficie (superficie de una estructura por unidad de volumen): SvEvidentemente, esta notación se puede aplicar sea cual sea el espacio de referencia; de modo que si estamos contando estructuras 2D, se pue­ de obtener, por ejemplo, una densidad de área Na (número de estructuras por unidad de área).

Sesgo El sesgo es la desviación de los valores es­ timados en relación con los valores reales

de una determinada población. Puede ser de dos tipos: 1. Sesgo en el muestreo: cuando no todos los elementos de la población objeto de estudio tienen la misma probabilidad de ser elegidos (el muestreo no se ha efec­ tuado al azar); por ejemplo, si queremos estimar el volumen celular en un deter­ minado tejido y el sistema para elegir las células que se van a medir escoge con más probabilidad los elementos más grandes. 2. Sesgo sistemático: desviación constante de la medida obtenida en relación con el valor real (error sistemático). Se debe a: a. Defectos en el observador. b. Defectos en la sonda de medida. c. Defectos en el método de medida. Un ejemplo típico de sesgo sistemático es el originado por errores en la calibración de la sonda (p. ej., cuando nos equivocamos al hacer una transformación de aumentos al trabajar sobre una microfotografía); otro ejemplo es el sesgo derivado de asumir for­ mas geométricas elementales para diversos elementos celulares, con objeto de aplicar fórmulas geométricas sencillas para estimar volúmenes. Cuando «reducimos» la forma de un núcleo (p. ej., a un elipsoide), estamos introduciendo unos factores arbitrarios que pueden sistematizar desviaciones en la es­ timación de la medida del tamaño de ese núcleo.

Imprecisión No se debe confundir con el sesgo. No es un error sistemático sino el resultado de la variabilidad o dispersión de los datos en tor­ no al valor real (es una consecuencia de que toda evaluación estereológica es un análisis estadístico con un «ruido» en tomo al valor real). Ese mido se puede estimar mediante estadísticos del tipo de la varianza. Puede ser debida a: • Variabilidad biológica. Es la variabilidad interindividual, intrínseca a la estructura de la población. No se puede reducir. Su estimación proporciona datos valiosos

Capítulo | 1 2 Métodos estereológicos en histología y biología celular

acerca de la estructura y del comporta­ miento de la población que estamos es­ tudiando. • Muestreo insuficiente. • Imprecisión de la sonda de medida.

Variabilidad y sus componentes La variabilidad (imprecisión) final de una estimación estereológica es el sumatorio de las imprecisiones producidas en los diversos niveles de muestreo. En la ciencia histoló­ gica se pueden encontrar al menos cuatro niveles de muestreo, que se esquematizan en la figura 12-2. Si el muestreo está correctamente realiza­ do, la distribución porcentual de la variabili­ dad se debería ajustar al siguiente esquema: • Variabilidad interindividual (biológica): 70%. • Variabilidad entre bloques: 20%. • Variabilidad entre cortes: 5%. • Variabilidad entre campos: 3%. • Variabilidad entre medidas: 2%. La suma de la variabilidad debida a factores distintos de la variabilidad interindividual debe ser inferior al 50% de la variabilidad total observada.

EL MUESTREO EN ESTEREOLOGIA ES ESENCIAL La metodología estereológica es, fundamen­ talmente, estadística: extrae datos de grupos de células, tejidos, etc., de los cuales se es­ pera que representen a la población real ob­ jeto de interés. Esos colectivos son, por tanto, muestras en sentido estadístico. El muestreo presenta diversos niveles. En primer lugar, hay que seleccionar un grupo de animales y a cada uno de ellos se le debe extraer el órgano objeto de estudio. Sin embargo, el mismo no puede ser analizado en su totalidad, sino que hay que muestrear unas porciones, que, una vez fijadas, frecuentemente vuelven a ser muestreadas para obtener bloques, que son incluidos y cortados (nuevo proceso de muestreo que, además, opera una reducción de dimensiones [3D —» 2D]). Cada corte no suele ser estudiado exhaustivamente, por lo que de nuevo hay que muestrear campos sobre los cuales, o sobre una fracción de los cuales, se efectúa finalmente el estudio cuantitativo. La exigencia de todo el proceso es que se preserve la aleatoriedad desde el principio hasta el final, para que las medi­ ciones reflejen la realidad que acontece en la población de interés.

publicación MASSON. Fotocopiar:

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Bloques

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FIG U RA 1 2 -2 N iveles habituales de muestreo a lo largo del procesamiento histológico de un objeto, en este caso una próstata humana.

Técnicas en histología y biología celular

Tipos de muestreo • Muestreo aleatorio uniforme: todas las muestras (p. ej., animales, cortes, campos) tomadas de una población tienen la mis­ ma probabilidad de aparición (fig. 12-3). El ejemplo más sencillo sería elegir los objetos muéstrales asignándoles el nú­ mero de una papeleta extraída, aleatoria­ mente, de un bombo de lotería. • M uestreo aleatorio sistemático: es un muestreo sistemático con comienzo al azar; la primera muestra se obtiene alea­ toriamente, y las siguientes, mediante una fracción de muestreo (p. ej., uno de cada tres cortes seriados). Conserva la aleatoriedad del muestreo uniforme y es más eficiente (fig. 12-4).

SONDAS EN ESTEREOLOGÍA: EL RETÍCULO DE PUNTOS Ya se ha mencionado que la medición estereológica se efectúa mediante la interacción de una sonda de medida y el objeto que se va a medir. Entendemos por sonda un conjunto de estructuras geométricas de cero, una, dos o tres dimensiones, cuya intersección con la

muestra permite obtener una información cuantitativa vehiculizada en forma de impac­ tos o puntos en común del elemento geomé­ trico de la sonda y del objeto que se debe estimar. Vamos a ocupamos ahora de una de las sondas más elementales que se pueden utilizar en estereología: el retículo de puntos. Se trata de una distribución sistemática de puntos, en la que estos se sitúan en los vértices de una figura geométrica regular, generalmente un cuadrado (fig. 12-5). Para cumplir el requisito de aleatoriedad, el primer punto del retículo se coloca al azar, el resto de puntos se colocan desplazando sistemá­ ticamente dicho punto a una distancia fija A(x,y) que define el tamaño de la celda unidad (v. fig. 12-5). La celda unidad del retículo tiene unas dimensiones fijas para cada sonda (área asociada al punto). De modo muy directo, se ve que utilizan­ do esta sonda se puede estimar muy rápida­ mente el área de una sección. Basta con arro­ jar aleatoriamente el retículo (p. ej., plasmado en una transparencia) sobre la sección (una microfotografía, muestreada al azar) y contar el número de puntos que aparecen dentro de la sección; como conocemos el área asocia­ da a cada punto (a/p = Ax X Ay), basta con

G

N.os al azar: 0 < Z ,, Z 3<

0

mm

Aumento, M —> Área asociada al punto (a/p) —»

3. Colocar sobre las secciones el retículo n.° 1. 4. Contar el número de puntos que caen sobre cada sección y consignarlos en la siguiente tabla: Sección

Nl.° de puntos que caen sobre el perfil (P¡)

1

2 3

4 5

6 7

Sumatorio

ZP¡ =

Actividad n.° 2

Objetivo mm2

Se trata de estimar la fracción de volumen (Vv) ocupada por el núcleo de las células que se muestran a continuación.

Datos de interés Se dispone de tres microfotografías de epitelio prostático tomadas con muestreo uniforme al azar sobre una sección de próstata, inmunoteñida para evidenciar citoqueratina 18.

publicación MASSON. Fotocopiar:

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Procedimiento

Actividad n.° 3

Se coloca un retículo de puntos (retículo n.° 1) arrojado al azar sobre cada una de las tres microfotografías. Hay que contar sobre cada imagen el número de puntos que caen sobre las células [P(tot)] tanto sobre el citoplasma como sobre el núcleo. A continuación, se cuentan los puntos que caen sobre los núcleos [P(núc)].

Objetivo

Resultados

Imagen

Puntos sobre los núcleos [P(núc)]

Puntos sobre las células IP(tot)]

SP(núc) =

ZP(tot) =

1

2 3 Sumatorio

Estime la fracción de volumen (Vv) del núcleo sobre el conjunto de citoplas­ ma + núcleo: Vv (núc,tot) =

S>(niic) £ P (to t)

264.e3

Estimar la densidad numérica (Nv) de las cé­ lulas del epitelio prostático humano usando el disector óptico.

Datos de interés El tejido procedente de próstata humana normal fue fijado en paraformaldehído al 4%, deshidratado en serie de alcoholes creciente, incluido en parafina y seccionado seriadamen­ te a 15 |xm. Los cortes se tiñeron con hema­ toxilina. Las cuatro imágenes que se muestran proceden de un campo microscópico seleccio­ nado por muestreo aleatorio sistemático; han sido microfotografiadas con unos aumentos finales de 1.400 x . Cada imagen corresponde a un plano focal del mismo campo; la imagen 0 representa el plano focal 0, elegido aleato­ riamente dentro del espesor total del corte. Cada imagen subsiguiente (1 a 3) corresponde a un plano focal fotografiado tras desplazar la platina 3 |xm a lo largo del eje z.

Técnicas en histología y biología celular

264.e4

Procedimiento t . Calcular el área asociada (a/r) al retícu­ lo superpuesto a cada imagen. 2. Calcular el volumen del disector óptico introducido en el espesor del corte. 3. Examinar cada sección óptica (im á­ genes 0-3) y contar el número de núcleos muestreados usando la convención de Ste­ rio. Considerar el plano 0 como superficie de exclusión. Resultados Altura del disector (Hdis) -»

(|xm)

Área asociada al retículo (a/r) -»

(|xm2)

Volumen del disector óptico -»

(|xm3)

Imagen

Núcleos contados (Q-)

0 1

2 3 Sumatorio

ZQ~ =

Estime el número de células por unidad de volumen (expresarlo por 10~3 células/ M-m3): Nv = — v (a /r)x H d is

J \ . x 10"3células/um3 [ ]x [ ] M

Soluciones razonadas a las actividades En las soluciones que figuran a continua­ ción se ha usado el retículo n .° 1 y los disectores superpuestos en las imágenes de la actividad 3. Las dimensiones de a/p y a/r dependen de la ampliación final de la imagen; deberán ser muy sim ilares a los cá lcu lo s que realice el lector. Para las actividades 1 y 2, que requieren arro­ ja r al aza r el retícu lo de puntos sobre las imágenes, deberá haber diferencias inevitables en el número real de puntos o btenidos. Sin em bargo, para las tres a ctividades, sus respuestas tienen que aparecer expresadas en las unidades y dim ensiones correctas, así como tener el mismo orden de magnitud que las que figuran a continuación.

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264.e5

Estimación de la fracción de volumen (Vv) del núcleo sobre el conjunto de cito­ plasma + núcleo:

Distancia entre secciones (T) -»

8 mm

Aumento, M —>

Longitud real de la escala/ longitud nominal: 20/16 mm = 1 ,2 5 x

Área asociada al punto (a/p) ->

(Ax)2 corregido para los aumentos: (10/1,25)2 = 64 mm2

Sección

N.° de puntos que caen sobre el perfil (Pj)

1

5

2 3

5 6

4

4

5 6

5

V„ (núc,tot) = £ p(nuc) = — = 0,16 = 16% IP (to t) 57

Resultados

Altura del 3 |i,m (desplazamiento del disector (Hdis) foco) x 3 (imágenes cap-> tadas, excluido el plano 0) = 9 (ji,m Área asociada largo x ancho del al retículo disector (corregido para (a/r) -> el aumento) = (40 X 103 H,m) X (25 X 103 |xm)/ I .4002 = 507 |xm2 Volumen del disector óptico -»

5 3

(a/r) X Hdis = 507 X 9 = 4.563 |xm3

Z P = 33 Imagen

Estimación del volumen del objeto (ex­ presarlo en cm3):

publicación MASSON. Fotocopiar:

V = T x a / p x ¿ Pi = [0,8] X [0,64] X [33] = 17cm ’

I w S

Imagen

Puntos sobre los núcleos [P(núc)]

Puntos sobre las células [P(tot)]

1

2

17

2

3

3 Sumatorio

17 23 ZP(tot) = 57

Núcleos contados (Q-)

0 kéf ü

0

2

4

3 Sumatorio

2

10

2Q- = 16

Estimación del número de células por unidad de volumen (expresado x 10-3 célulasVm 3):

N = v

£ Q~

=

t16]

(a/r) x Hdis [507] x [9] = 3,5 x 10“3células/|jm3

264.e6

Técnicas en histología y biología celular

Caso Introducción Los cambios dimensionales que sufre el tejido durante su procesamiento histológico (fijación, deshidratación, inclusión en para­ fina, corte, etc.) influyen de modo determi­ nante sobre la cuantificación de diversos parámetros estereológicos, de modo que introducen sesgos sistemáticos al modificar el tamaño del espacio de referencia. Objetivo Diseñar un experimento para determinar el factor de retracción (Fr) que sufre el tejido prostático humano tras su inclusión en parafina y aplicarlo a la corrección de la estimación de la densidad numérica (Nv) de las células epiteliales de próstata humana normal. Datos de interés El material consiste en próstata humana normal obtenida en una autopsia. El órgano se recibe en fresco en el laboratorio. Pos­ teriormente, es fijado durante 1 semana en paraformaldehído al 10% , deshidratado en serie de alcoholes creciente e incluido en parafina. Se efectúan cortes seriados de 10 n-m de espesor, que son fijados sobre el portaobjetos y teñidos con hematoxilina de Harris. Sobre esos cortes, debidamente muestreados, se aplican disectores ópticos para estimar la Nv de las células del epitelio prostático. Cuestiones que deben plantearse 1. ¿Cómo calcular el Fr del tejido? Está cla­ ro que ese factor tiene que surgir de una proporción entre las dimensiones del te­ jido en fresco y las dim ensiones del material procesado (el procesamiento debe in c lu ir toda la m anipulación que termina en los cortes adheridos al portaobjetos, teñidos, deshidratados y montados en resina). 2. ¿En qué fase de la estimación de Nv debe de incluirse el Fr? Si la densidad numérica (Nv) es una proporción entre el número de partículas (células) y el volumen del espacio ocupado por las partículas, ¿cuál de los dos elementos de la ratio se verá afectado por el cambio dimensional que queremos corregir, el numerador o el denominador? ¿Cómo manejar el Fr para corregir el cambio?

Sugerencia de modus operandi 1. Medir el volumen en fresco (Vf) de un fragmento de próstata, antes de la fija­ ción en formol. ¿Cómo se podría hacer de modo directo? 2. Tomar ese mismo fragmento, incluirlo en parafina, seccionarlo y aplicar el es­ timador de Cavalieri para evaluar el vo­ lumen retraído (Vr). 3. Calcular el Fr a partir del V f y del Vr. ¿Cómo hacerlo? 4 . De modo paralelo y sobre el resto de la próstata incluida en parafina, se aplica el disector óptico para estimar Nv (sería un valor sin corregir para la retracción). Se adjuntan datos a este respecto: a. Número de núcleos de células epite­ liales prostáticas contados en el total de disectores aplicados: ZQ " = 40. b. Volumen total de los disectores aplicados: ZVdis = 300 X 103 |xm3. c. Densidad numérica celular (sin co­ rregir), Nv = células x cm-3. 5. Aplicar el Fr calculado para corregir el dato anterior: Nv corregido = células x cm '3 Solución del supuesto de investigación 1. M edición del volumen en fresco: se talla un fragmento de tejido en for­ ma de paralelepípedo de, digamos, 1 0 X 2 X 2 mm de arista; en total ten­ dremos un volumen de tejido (Vf), es­ timado geométricamente, de 40 mm3. 2. Ese mismo paralelepípedo es procesado en parafina y cortado exhaustivamente en secciones de 5 |xm, que serán teñidas con hematoxilina. Para obtener el volu­ men retraído (Vr), se aplica el estimador de Cavalieri sobre las secciones muestreadas sistemáticamente. Supongamos que se obtienen los datos siguientes: • Se aplica un retículo de puntos con un área asociada al punto (a/p) de 0,14 mm2. • El muestreo de los cortes se efectúa de modo que el espaciamiento intercorte (T) sea de 0,4 mm. • Del total de cortes realizados, una vez aplicado el muestreo sistemático con comienzo al azar, se selecciona

C apítulo | 12 Métodos estereológicos en histología y biología celular

1 de cada 20. Sobre esos cortes se superpone el retículo de puntos, con lo que se obtienen los resultados que figuran en la siguiente tabla: N.° de corte seleccionado

N.° de puntos del retículo sobre el corte

1

48

20 40

55 56

60

60

90

63

110 130

65 67 ZP¡ = 414

Se aplica Cavalieri: Vr = T X (a/p) x S P ¡ Vr = 0,4 x 0,14 x 414 = 23,18mm3 Sabemos que el volumen en fresco (Vf) es de 40 mm3. El factor de retracción será Fr = Vf/ Vr = 40/23,18 = 1,72. 3. Con los datos de densidad numérica no corregida (Nv) y aplicando Fr, se corrige la Nv para la retracción tisular del siguiente modo:

264.e7

Nv (sin corregir) = / ^ Vdis = 4 0 / 3 0 0 x 103 (v. fórmula del disector óptico en el texto): Nv (sin corregir) = 133 x 10 3 células por cm3 Para obtener la Nv (corregida), ten­ dremos que incrementar el volumen total de disectores aplicados (ZVdis) 1 ,7 2 veces (el valor de Fr), lo que equivale a dividir Nv (sin corregir) por 1,72: Nv (corregida) = 1 33 x 10 3 /1 ,7 2 = 77 ,3 x 10 3 células por cm3

BIBLIO GRAFÍA DE INTERÉS Baddeley A, Vedel Jensen E. Overview o f m odem ste­ reology. En: Baddeley A, Vedel Jensen E , editors. Stereology for Statisticians. Boca Ratón: Chapman& Hall; 2005. p. 55-85. H oward CV, Reed MG. U nbiased Stereology: ThreeDim ensional M easurem ent in M icroscopy. 2nd ed Oxford: BIOS Scientific Publishers; 2005. Santamaría L, Ingelmo I, R uiz J, T eba F, H erranz LM, M ontalban G , e t al. Stereological estim ate o f the length o f microvessels and the number, proliferation and apoptosis o f endothelial cells in prostate cancer. Open Prost Cancer J 2009;2:46-53.

264.e8

Técnicas en histología y biología celular

AUTOEVALUACIÓN 1. La estereología se define como: a. Metodología para reconstruir objetos a partir de cortes histológicos. b. Metodología estadística para extraer información cuantitativa tridimen­ sional (3D) a partir de muestras bidimensionales (2D). c. Proceso de imágenes. d. Método para medir volúmenes. e. Todas las respuestas anteriores son incorrectas. Respuesta correcta: b. R espuesta razonada: se trata de un conjunto de métodos morfométricos que obtienen datos cuantitativos 3D a partir de elementos 2D, para lo cual utilizan propie­ dades geométricas intrínsecas a la estructura que se está estudiando. La estereología se relaciona con la realización de estimaciones cuantitativas de características geométricas del objeto de interés (número de partículas, longitudes, superficies, volúmenes). 2. Cuando se efectúa un corte a través de estructuras 3D se originan perfiles o transecciones: a. De dimensión 0. b. De dimensión 3. c. De dimensión 2. d. De dimensión 1. e. De cualquier dimensión. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el muestreo de una estructura tisular 3D mediante la obtención de cortes opera una reducción de una dimen­ sión sobre todos los elementos topológicamente reconocibles en dicha estructura. 3. El espacio de referencia. a. Es siempre un volumen. b. Es el ámbito al que se refieren las es­ timaciones. c. Es siempre una superficie. d. No tiene importancia cuando se cuen­ tan células. e. Todas las respuestas anteriores son incorrectas. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: es el ámbito al que se refieren las estimaciones, usualmente un

volumen, aunque a veces es útil referirlas a un área; por ejemplo, si estamos evaluando el número de neumocitos; también se puede obtener una información fisiológica relevante si se refieren al área de superficie alveolar; asimismo, se pueden se pueden referir a lon­ gitudes, como cuando evaluamos el número de células endoteliales por unidad de longitud de membrana basal del capilar, e incluso es posible tomar como espacio de referencia de una población celular otra población celular relacionada con la anterior. 4. El parámetro L^: a. Estima longitudes absolutas. b. Mide la longitud de un elemento por unidad de área. c. Estima la densidad de superficie. d. Estima la longitud de un elemento por unidad de volumen. e. Se expresa en micrómetros al cua­ drado (|xm2). Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: con frecuencia, en estereología se emplean estimaciones que son ratios o proporciones entre un estimador y otro que se puede considerar el espacio de referencia. Estas estimaciones se suelen denominar «densidades». Para la notación de estos estimadores relativos, se sigue el convenio de colocar como subíndice el es­ pacio de referencia; así, Lv será la densidad de longitud (es decir, la longitud de un ele­ mento lineal por unidad de volumen). 5. El sesgo sistemático: a. Es la desviación constante de la me­ dida obtenida en relación con el valor real. b. Se produce cuando no todos los ele­ mentos de la población que es objeto de estudio tienen la misma probabi­ lidad de ser elegidos. c. Se estima por la varianza. d. Nunca se produce en estereología. e. Solo se da cuando hay defectos en la sonda de medida. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: el sesgo sistemáti­ co es la desviación constante de la medida

C apítulo | 12 Métodos estereológicos en histología y biología celular

obtenida en relación con el valor real (error sistemático) y se debe a defectos en el obser­ vador, en la sonda de medida o en el método de medida. 6. El principio de Cavalieri: a. Sirve para estimar volúmenes. b. Se utiliza para medir fracciones de área. c. Estima el número de partículas. d. Se emplea para estimar la densidad de superficie. e. Mide longitudes relativas. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: un modo sencillo de estimar volúmenes se basa en la aplica­ ción del principio de Cavalieri, matemático italiano, nacido en Milán a finales del siglo xvi, que desarrolló un sistema muy útil y directo para la determinación de volúmenes de objetos. Consiste en realizar el sumatorio de elementos de volumen definidos como el producto de su sección por el espesor de la misma. 7. Respecto al principio de Delesse, indique la respuesta correcta: a. Es idéntico al de Cavalieri. b. Existe identidad entre Pp, Ss y Vv. c. Se emplea para estimar el número de células. d. Solo se aplica en geología. e. Todas las respuestas anteriores son incorrectas. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: según el principio de Delesse, la razón entre los puntos es equi­ valente a la razón entre las áreas y a la razón entre los volúmenes. 8. Nv a. Es un estimador de áreas. b. Estima el número absoluto de células. c. Estima la densidad numérica de par­ tículas. d. Se emplea para medir la densidad de longitud. e. Todas las respuestas anteriores son incorrectas. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: con frecuencia, en estereología se emplean estimaciones que son ratios o proporciones entre un estimador y otro que se puede considerar el espacio

264.e9

de referencia. Estas estimaciones se suelen denominar «densidades». Para la notación de estos estimadores relativos se sigue el convenio de colocar como subíndice el es­ pacio de referencia; así, Nv será la densidad numérica (es decir, el número de partículas por unidad de volumen). 9. Respecto al fraccionador óptico, indique la respuesta correcta: a. La fracción total de muestreo es el sumatorio de las fracciones parciales. b. Este método permite contar células sin conocer el tamaño del volumen de referencia. c. No emplea disectores. d. Solo se puede utilizar con micros­ copía confocal. e. Es muy sensible a la retracción del órgano. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: se trata de un mé­ todo de recuento que combina el muestreo fraccionado del órgano cuya población ce­ lular se precisa contar y el uso del disector óptico como sonda de recuento aplicada a la última fracción obtenida. 10. La regla de Sterio: a. Se utiliza para estimar volúmenes. b. Solo se emplea en la estimación de superficies. c. Consiste en una convención para evi­ tar el sobrerrecuento o infrarrecuento con el método del disector. d. Es equivalente al principio de Delesse. e. Todas las respuestas anteriores son incorrectas. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el retículo del di­ sector tiene unos bordes de exclusión, que, siguiendo la convención de Sterio, permiten excluir del recuento a toda partícula que los toque, ya esté dentro o fuera del área del re­ tículo, y unos bordes de inclusión, que pres­ criben la inclusión de cualquier partícula que los toque. 11. La densidad de superficie es un paráme­ tro estereológico que estima la cantidad de superficie de un elemento (p. ej., un alvéolo pulmonar) por unidad de volu­ men del espacio de referencia (p. ej., en el caso del alvéolo, el volumen pulmonar

264.e10

total). La estimación de densidad de su­ perficie se expresa en: a. mm2. b. mm-1. c. (xm3. d . Cualquier expresión de la forma L~2, siendo L la unidad de longitud. e. Cualquier expresión de la forma L -3, siendo L la unidad de longitud. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: con L se representan los elementos lineales (cualquier unidad de longitud del sistema métrico decimal). La fórmula dimensional de la densidad de su­ perficie (superficie por unidad de volumen) es igual a: L2/L3 = L -2. 12.La mayor eficiencia del muestreo sis­ temático con comienzo al azar, cuando se compara con el muestreo aleatorio uniforme, se manifiesta en que las es­ timaciones efectuadas sobre una muestra obtenida por muestreo sistemático alea­ torio presentan, por regla general, menor variabilidad que en el caso del muestreo uniforme. ¿En qué se traduce esto desde el punto de vista estadístico? a. Los resultados son no sesgados. b. La varianza de los datos obtenidos por muestreo sistemático es menor. c. En el caso del muestreo sistemático se presenta el fenómeno de clustering. d . La variabilidad biológica en el mues­ treo sistemático es menor que en el aleatorio. e. Todas las respuestas anteriores son incorrectas. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: El muestreo sistemá­ tico con comienzo al azar es más eficiente que el aleatorio simple o uniforme, ya que evita el fenómeno de clustering, o agrupamiento de las muestras, en puntos concretos del espacio muestral. Esto se manifiesta en una menor variabilidad; por tanto, disminuye la varianza. 13. ¿Cuántos elefantes y cuántas mariposas hay en una habitación de volumen cono­ cido? Para resolver el problema, véase la siguiente imagen:

Técnicas en histología y biología celular

En la figura se observa que se han efec­ tuado tres secciones independientes (a, b y c) en el volumen de referencia (V) que contiene elefantes y mariposas. Suponga­ mos que solo disponemos de las secciones para efectuar el recuento: se contarían 5 elefantes y 3 mariposas, pero, en realidad, solo hay 1 elefante y 10 mariposas en el volumen de referencia. ¿Sesga el tamaño de las partículas el recuento de estas? ¿Cómo se pueden evitar los errores sis­ temáticos introducidos por el volumen de la partícula en el recuento de partículas? a. Se produce un sobrerrecuento de los elementos de más volumen. b. El tamaño de las partículas incremen­ ta la probabilidad de ser contadas. c. Para evitar el sesgo, basta con aplicar un factor de forma que pondere ne­ gativamente los elementos de menor tamaño. d. Las respuestas a y b son correctas. e. El único modo de evitar el error sis­ temático consiste en tener acceso a todo el volumen de referencia (p. ej., por reconstrucción 3D). Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: cuando en un mismo espacio de referencia coexisten dos elementos de tamaño muy distinto (células grandes y pe­ queñas), si no se toman precauciones (p. ej., no contar en secciones independientes), se puede dar un sesgo a favor de los elementos más grandes, que tienen más probabilidad de encontrarse con la sonda de medida. La

C apítulo | 1 2 Métodos estereológicos en histología y biología celular

publicación MASSON. Fotocopiar:

¿ % § | ;§ ■I 1

I w 3

aplicación del disector, con los criterios ade­ cuados de exclusión e inclusión, evita este tipo de sesgo. 14. La estereología se relaciona con la rea­ lización de estimaciones cuantitativas de características geométricas del objeto de interés (número de partículas, longitu­ des, superficies, volúmenes). ¿En qué se diferencia de las técnicas de análisis y proceso de imagen? a. La estereología usa propiedades geométricas intrínsecas. El proceso de imágenes «añade» a la imagen elementos externos. b. La estereología sirve para realizar la reconstrucción 3D del objeto a partir de secciones histológicas del mismo. c. El proceso de imágenes es siempre previo a la aplicación de un método estereológico. d. La estereología no utiliza probabili­ dades geométricas pero el análisis de imágenes sí. e. Sobre las imágenes procesadas nunca se pueden aplicar técnicas estereológicas. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la estereología apro­ vecha propiedades geométricas intrínsecas a la estructura que se quiere cuantificar, mientras que el proceso de imagen manipula esta con elementos externos (filtros, algoritmos matemáticos, segmentación, etc.) para obtener información cuantitativa del objeto. 1 5 .Se aplica el método del fraccionador para contar el número de neumocitos de tipo II de un pulmón de rata. Partimos de un pulmón completo, fijado en formol, que segmentamos en 4 fragmentos, de los que tomamos 2. Los 2 trozos muestreados son incluidos en parafina y sec­

264.e11

cionados exhaustivamente en cortes de 20 p,m, hasta obtener un total de 500 cortes, de los que se muestrean 5, que se montan y tiñen con un anticuerpo específico para visualizar los neumo­ citos de tipo II. Empleando una platina motorizada controlada por un software apropiado, en el conjunto de los cortes se selecciona un área total de 100.000 |xm2, en la que se aplican disectores ópticos solo sobre un total de campos que suman 10.000 |xm2. Los disectores tienen un es­ pesor Hdis = 10 |xm. Indique la fracción final de muestreo: 2.000 1 1 1 1_ 1 2 X 10ÓXT o x 2 “ 4.000 ii W i i 1 _ 1 2 100 10 " 2.000 1 104 Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: fracciones de mues­ treo empleadas: F1: de 4 fragmentos, se toman 2:2/4 = 1/2. F2: de 500 cortes, se toman 5: 5/500 = 1/ 100.

F3: de un área total de 105 |xm2, se muestrean campos por un total de 104 |xm2: 104/105 = 1/10. F4: de un grosor de corte de 20 [xm, se explora con el disector un espesor Hdis = 10 |xm: 10/20 = 1/2. Fracción total: FI X F2 X F3 X F4 = 1/4.000.

Técnicas de cultivo celular M aría Á ngela Burrell Bustos, Rafael V á z q u e z M a rtín e z , M aría d e l M ar M alag ó n Poyato, Francisco Jo sé E steban Ruiz

INTRODUCCIÓ N Las técnicas de cultivo celular (cell culture) consisten en el cultivo de células dispersas obtenidas de un tejido a partir de disgrega­ ción mecánica, enzimática o química, o de líneas celulares establecidas. En un principio se utilizó el término «cultivo tisular» (tissue culture), puesto que los cultivos se realizaban a partir de fragmentos de tejido de los que, sin disgregación alguna, migraban células que comenzaban a proliferar (cuadro 13-1). Posteriormente se realizaron los cultivos de células aisladas tras la disgregación, pero se ha seguido usando el término «cultivo celular» incluso para referirse a los cultivos tridimensionales de tejido no desagregado (organ culture) que permite mantener todas o muchas de las características del tejido in vivo. Cuando el cultivo se comienza a partir de células procedentes de un tejido, por dis­ gregación o migración, se denomina «cultivo primario». El uso de las técnicas de cultivo celular presenta toda una serie de indiscutibles ven­ tajas para el estudio de la función celular, pero también hay que ser consciente de los inconvenientes que según el problema de es­ tudio pueden presentar. Una de las ventajas de las técnicas de cultivo celular es el control de las condicio­ nes fisicoquímicas y fisiológicas. Entre las primeras se encuentran principalmente el pH, la temperatura, la presión osmótica, y la presión de oxígeno ( 0 2) y de dióxido de carbono (C02); las condiciones fisiológicas se refieren, principalmente, a la composición del © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

medio de cultivo en nutrientes, metabolitos, hormonas y cualquier otra sustancia nece­ saria para su mantenimiento y crecimiento adecuado. Además, nos encontramos ante una muestra homogénea que nos permite una buena caracterización. Por otro lado, la eco­ nomía experimental (cuando se dispone de los medios adecuados y se utilizan de modo habitual) y los aspectos éticos, si se comparan con una experiencia semejante realizada in vivo, también pueden considerarse ventajas. Las desventajas de los cultivos celulares son de carácter técnico y biológico. Para evi­ tar contaminaciones por microorganismos, se debe trabajar en condiciones de asepsia, lo que requiere una gran experiencia. Además, se han de conocer las condiciones adecuadas para el crecimiento del tipo celular a cultivar, y el coste del equipamiento y del material utilizado es elevado. Las desventajas bioló­ gicas se deben, sobre todo, a las diferencias in vitro/in vivo, tales como la inestabilidad de las poblaciones celulares (inestabilidad gené­ tica, desdiferenciación y selección), la falta de control nervioso y endocrino (ambiente nutricional condicionado), la ausencia de estructura tridimensional y de relaciones intercelulares específicas, y los cambios relacionados con el metabolismo energético.

CARACTERÍSTICAS DE LA CÉLULA CULTIVADA En los cultivos primarios, por disgregación o migración, se produce un proceso de selec­ ción de algunas células que proliferan más que otras. Tras sucesivos ciclos de división, 265

Técnicas en histología y biología celular

Cuadro 13-1 Algunas fechas importantes en el desarrollo de las técnicas de cultivo celular 1885 Roux. Comprobó que células embrio­ narias de pollo pueden mantenerse vivas en una solución salina. 1907 Harrison. Cultivó médula espinal de anfibio y demostró que los axones se producen como prolongaciones de las neuronas. 1912 Carrel. Comprobó que las células podían crecer en cultivo. 1952 Gey et al. Establecieron una línea celular continua de carcinoma cervical hu­ mano que actualmente conocemos como «línea celular HeLa». 1955 Eagle. Realizó el primer estudio sis­ temático de los requerimientos nutricionales de las células en cultivo. 1961 H a y flic k y M oo rhead. C o m ­ probaron que los fibroblastos humanos en cultivo mueren tras un número limitado de divisiones. Datos tomados de Alberts et al. Biología molecular de la célula. 4.aed. Barcelona: Omega; 2002. p. 476.

las células llegan a cubrir toda la superficie disponible de la botella; entonces se dice que han alcanzado la confluencia. Si se quiere mantener el cultivo, en ese momento es nece­ sario diluir las células en un nuevo medio de cultivo y pasarlas a otras botellas, así como realizar sucesivos subcultivos. En este caso ya podremos hablar de «línea celular». Hay líneas celulares que tras una serie de subcultivos, es decir, tras un número limi­ tado de divisiones, sufrirán un cambio que las llevará a la senescencia (muerte celular). Se trata de líneas celulares «finitas», como, por ejemplo, los fibroblastos humanos, que dejan de dividirse tras 25-40 divisiones en cultivo. Su capacidad de proliferación limi­ tada parece deberse al acortamiento de los telómeros de sus cromosomas. Otras líneas celulares, las denominadas «continuas», son aquellas cuyas células son capaces de crecer indefinidamente (fig. 13-1). En algunas líneas celulares tiene lugar un cambio que las lleva a crecer indefinida­ mente, dando lugar a un número ilimitado

FIG U RA 13-1 Línea celular NIH373 (fibroblastos de ratón) en cultivo.

de generaciones de células, el cual se deno­ mina transformación (fig. 13-2). Aunque en la mayor parte de los casos se desconoce la razón, se trata de un cambio fenotípico que, presumiblemente, se debe a una serie de alte­ raciones genéticas que pueden producirse de modo espontáneo o ser inducidas mediante agentes químicos, virus o radiaciones. En ge­ neral, las células humanas no generan líneas continuas, pero sí las células de roedores, así como las provenientes de tumores animales y humanos (tabla 13-1). De modo general, las células de líneas celulares transformadas presentan ciertas características morfofuncionales (tabla 13-2). Solo algunas líneas celulares transformadas presentan todas estas características, pero

TABLA 13-1 Algunas de las líneas celulares más usadas en investigación Línea c e lu la r 3T3

MDCK HeLa SP2 eos

CHO

T ip o c e lu la r y o rig e n

Fibroblasto (ratón) Célula epitelial (perro) Célula epitelial (humano) Célula plasmática (ratón) Riñón (mono) Ovario (hámster chino)

Datos tomados de Alberts et al. Biología molecular de la célula. 4.a ed. Barcelona: Omega; 2002. p. 475.

Capítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

FIGURA 13-2 Evolución de una línea celular. E n or­ denadas se representa en es­ cala logarítm ica el número total de células crecidas, y en a b scisas, el tiem po de cultivo para u na línea celu­ lar hipotética. (Modificado

de Freshney RI. Culture of animal cells. 1994. p. 10.)

TABLA 13-2 Características de las células transformadas in vitro Relativas al núcleo

Relativas a la superficie celular

Alteraciones de la adherencia

Alta proporción núcleocitoplasma Alteraciones cromosómicas (en número y estructura)

Cambios en la Independencia de anclaje: membrana plasmática disminución de la (transporte, movilidad necesidad de adherencia de proteínas, aumento a superficies de blebbing) Disminución de la capa Cambios antigénicos, externa de fibronectina de glucoproteínas de Desorganización de las membrana fibras de estrés (haces de filamentos de actina) Aumento de la producción de proteasas y, por tanto, incremento de la proteólisis extracelular

existe una mayor probabilidad de que dichos cambios ocurran en células transformadas que en las líneas celulares finitas. Muchas de estas características son también pro­ pias de las células cancerosas, por lo que las

Relativas al crecimiento y división No inhibición del crecimiento por densidad celular Bajos requerimientos de factores de crecimiento Inmortalidad (crecimiento ilimitado) Capacidad de inducir tumores

células transformadas sirven como modelo para el estudio de diferentes aspectos del proceso de carcinogénesis. Puesto que las células dispersas en cultivo pierden, al menos en parte, sus características

Técnicas en histología y biología celular

tras la disgregación del tejido, muchos in­ vestigadores han vuelto a utilizar cultivos tisulares (organotypic cultures). En estos cultivos, las células retienen la estructura histológica/fisiológica original y sus rela­ ciones intercelulares, lo que representa una ventaja importante a la hora de comprender la función celular en su entorno tisular. Sin embargo, esta aproximación presenta ciertas limitaciones técnicas, como la aparición de necrosis central debido a la pobre difusión del 0 2 a las zonas más profundas del tejido. Para minimizar este efecto, se han diseñado soportes especiales que crean una interfaz de aire/medio, optimizando así el intercambio gaseoso entre la atmósfera y el tejido. Otra alternativa particularmente atractiva para el área de ingeniería tisular es la amplificación de líneas celulares determinadas en un am­ biente tridimensional que mimetice la estruc­ tura original del tejido (histotypic cultures). Actualmente se consigue recrear en cultivo la organización estructural de la piel, pero, incluso en este caso, aún no se ha conseguido con éxito combinar las células epiteliales con otros tipos celulares también presentes en este órgano, como los melanocitos o los que forman las glándulas sudoríparas y los folícu­ los pilosos. Sin embargo, la gran repercusión biomédica de estos sistemas de cultivo está haciendo que este campo avance rápidamen­ te, desde la purificación y propagación de poblaciones celulares determinadas hasta su combinación en soportes tridimensionales que promuevan las interacciones célulacélula y célula-matriz.

EQUIPAMIENTO DE UN LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR Hay distintos tipos de laboratorios de culti­ vo celular, en función, fundamentalmente, de la patogenicidad del material con el que se trabaja. En concreto, la Unión Europea (UE), en su directiva 2000/54/EC, establece una clasificación de agentes biológicos en cuatro categorías o grupos, según el nivel de riesgo de infección que presentan: a) agen­ te biológico del grupo 1: aquel que presenta nula o muy escasa probabilidad de causar

una enfermedad en el ser humano; b) agen­ te biológico del grupo 2: aquel que puede causar enfermedades en el ser humano y que, por tanto, podría suponer un riesgo para los trabajadores, pero existe muy baja probabilidad de que se propague a la comu­ nidad y se dispone de un tratamiento eficaz; c) agente biológico del grupo 3: aquel que puede causar enfermedades graves en el ser humano y que supone un peligro serio para los trabajadores; además, la infección puede propagarse con cierta facilidad a la comu­ nidad, si bien existe un tratamiento eficaz, y d) agente biológico del grupo 4: aquel que causa una enfermedad grave en el ser humano y un serio peligro para los trabajadores y para la comunidad, para el que no existe tratamiento eficaz disponible. Por tanto, el equipamiento necesario debe estar en consonancia con el agente biológico de estudio, aunque, en cual­ quier caso, el material básico del que se ha de disponer debe permitir trabajar en condi­ ciones de asepsia. La técnica aséptica consis­ te en una combinación de procedimientos para reducir al máximo la probabilidad de contaminación del cultivo. Además de cuidar aspectos como la tranquilidad del área de cultivo, la limpieza y el orden en la superficie de trabajo y la higiene personal, actualmen­ te el equipamiento básico de un laboratorio de cultivo celular ha de incluir una cabina de flujo laminar y el uso de material estéril (ma­ terial autoclavado, material de un solo uso, filtrado con filtros 0,22 p,m y esterilización con etileno). También son necesarios otros aparatos como un incubador de C 02y un mi­ croscopio invertido (v. capítulo 2), además de un contador de células. A continuación pasamos a hacer una breve descripción de estos diversos componentes del equipamiento de un laboratorio de cultivo celular.

Cabina de flujo laminar En las cabinas de flujo laminar, la asepsia se consigue gracias a que en ellas se produce un flujo de aire laminar libre de partículas al ser filtrado por un filtro de alta eficien­ cia en el control de partículas suspendidas (HEPA, high efficiency particulate air). El filtro HEPA (fig. 13-3) retiene y filtra todas

Capítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

las partículas del aire desde un tamaño de 0,3 |i,m con una eficiencia del 99,97%. Es­ tos filtros fueron diseñados específicamente para proteger el sistema respiratorio del ser humano. Según la posición del filtro HEPA y, por tanto, de la dirección del flujo laminar las cabinas, se denominan «de tipo vertical» o «de tipo horizontal» (v. figs. 13-3 a 13-5). Eficiencia del 99,97%

FIG U RA 1 3 -3 Esquema de un filtro de alta eficiencia en el control de partículas suspendidas (HEPA) con una eficiencia del 99,97%.

Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan de acuerdo con el tipo de protección: protección del operador de los posibles agentes peligrosos del interior de la cabina; protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otros produc­ tos o cultivos situados en la misma cabina; y protección medioambiental, para evitar la salida al medioambiente de productos o agentes contaminantes. Por ejemplo, cuando se trabaja con patógenos deben utilizarse ca­ binas denominadas «de clases II y III», que están diseñadas para una mayor protección del operador y del medioambiente. Por último, cabe citar que existen una se­ rie de recomendaciones para el uso de las ca­ binas, tales como procurar que el material que se introduce esté limpio, ponerla en marcha unos 30 min antes de comenzar a trabajar (en­ cendiendo la lámpara ultravioleta, que tiene

Filtro grjeso

Protección de la muestra

Protección del operador

A

FIGURA 1 3-4 Esquema de una cabina de flujo laminar horizontal (A) y vertical (B). Las flechas negras representan aire no estéril, y las rojas, aire estéril. Filtro HEPA, filtro de alta eficiencia en el control d e partículas suspendidas. (Modificado de Freshney RI. Culture o f anim al cells. 1994. p. 57.)

Técnicas en histología y biología celular

FIG U RA 13-5

Trabajo en una cabina de flujo laminar vertical.

acción germicida), evitar el paso de personas por delante de la cabina para no alterar el flujo laminar y llevar a cabo un mantenimiento y un control periódicos del filtro HEPA.

Incubador de C 0 2 Las células deben crecer en un medio con un control de la temperatura y de la presión parcial de C 0 2, así como con una humedad elevada a fin de reducir la evaporación de agua del medio de cultivo. Actualmente es­ to se consigue con los incubadores de C 0 2 (fig. 13-6), que disponen de: dispositivos de control de temperatura, con un termos­ tato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía; un dispositivo de inyección de una mezcla de aire y C 02, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7% (el C 02 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas), y un dispositivo de control de la humedad ambiente, que en los incubadores menos so­ fisticados consisten en un simple recipiente con agua en el fondo del incubador; en los instrumentos más modernos el control de la humedad atmosférica se realiza inyectando agua estéril y filtrada, así como con un dis­ positivo de recirculación de aire, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior, en el cual se suele intercalar el filtro HEPA para eliminar las posibles partículas contaminantes y asegurar la esterilidad del ambiente. Las condiciones del cultivo óptimas, como temperatura, humedad atmosférica y niveles de

FIGURA 13-6

Incubador de dióxido de carbono (C 02).

C 02, son características de cada línea celular. El nivel de C 02 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, que suele rondar en tomo al 5%.

Técnicas de recuento celular Es imprescindible realizar un recuento celu­ lar para conocer el número de células en cada

Capítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

l.k l •\ J /

*Ti

FIGURA 13-7 células.

Esquema del contador electrónico de

recipiente de cultivo. Esto se consigue de mo­ do eficaz mediante un contador electrónico de células, que es un instrumento capaz de contar y m edir partículas en suspensión (fig. 13-7). El sistema tiene dos electrodos: uno de ellos se introduce en el interior de un tubo que presenta un pequeño orificio y que, a su vez, se introduce en la suspensión de células que se quieren contar; el otro electro­ do se introduce directamente en la suspensión celular. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño que es detectada por los electrodos; las oscilaciones de resistencia detectadas son transmitidas a un equipo, en el que son amplificadas y se analiza la señal, y donde quedan registradas. Otro modo de conocer el número de célu­ las es mediante el uso del hemocitómetro, que es un portaobjetos especial que tiene una zona de área conocida, de manera que, tras colocar el cubreobjetos correctamente, se crea una cámara de volumen conocido que permite calcular la concentración de células en una muestra tras ser depositada por capilaridad en dicha cámara. El uso de una tinción que distinga células vivas y muertas (como el azul tripán) facilita el recuento. Existen distintos tipos de hemocitómetros, como el de Burker, Neubauer o Thoma. En el cuadro 13-2 se describe un método de recuento con la cámara de Neubauer modificada (fig. 13-8). Además del equipamiento ya indicado, se requieren otros aparatos, que normalmente se encuentran en un laboratorio general, como

Campo aproximado del objetivo X10

.

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A

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j -V y

FIGURA 13-8 Cámara de Neubauer modificada. (Modificado de Freshney RI. Culture o f animal cells. 1994. p. 269.)

Técnicas en histología y biología celular

C u a d ro 13-2 Procedim iento de trip sinizació n y recuento celular Tripsinización: mediante la tripsinización se despegan de los frascos de cultivo las células que crecen en monocapa Procedimiento (para un frasco de cultivo de 25 cm2): • Retirar el medio con pipeta. • Añadir 5 mi de tampón fosfato salino (PBS), previamente calentado a 37 °C. • Retirar el PBS con pipeta. • Añadir 2,5 mi de solución tripsina/EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), previa­ mente calentada a 37 °C. • Incubar aproximadamente durante 5 min a 37 °C. • Observar al microscopio invertido. Golpear hasta que las células se despeguen. • Neutralizar la tripsina añadiendo un volu­ men igual de medio, 2,5 mi, y pasar a un bote estéril con una pipeta. • Hacer que desaparezcan los grumos, con la misma pipeta o con una jeringa de 5 mi y una aguja de 21 C . • Ya tenemos preparada la suspensión celular para hacer el recuento. Recuento celular Preparar el hemocitómetro (cámara de Neubauer de 0,1 mm de profundidad): • Limpiar el portaobjetos y el cubreobjetos con alcohol de 70° y un trapo o pañuelo de papel que no suelte pelusa.

baños termostáticos, congeladores y depósito de nitrógeno (N2) líquido, equipo de purifica­ ción de agua, centrífugas, pipetas y pH-metro, por citar algunos de los más importantes.

AMBIENTE DEL CULTIVO Sustrato La mayoría de las células son dependientes de anclaje o adherencia; es decir, deben es­ tablecer contacto con el sustrato para poder dividirse. Los frascos de cultivo están fabri­ cados con plásticos especiales que permiten una correcta adhesión celular (fig. 13-9). Una excepción son algunas células transformadas, que pueden proliferar sin adherirse al sus­ trato. Los contactos o las adhesiones focales permiten a las células permanecer unidas a

• Humedecer el cubreobjetos con un poco de aliento y ponerlo sobre el portaobjetos presionando ligeramente. • Si está correctamente colocado, lo que ase­ gura una profundidad de 0,1 mm, aparece­ rán los anillos de Newton (bandas concén­ tricas que se producen por fenómenos de interferencia). • Colocar una muestra (de unos 20 |xl) de la suspensión celular con ayuda de una pipeta o de una jeringa. • Con el objetivo de 10 x se enfoca un área de 1 mm X 1 mm, dividida en 5 X 5 cua­ dradlos, cada uno de los cuales también estará subdividido en 4 X 4. Contar el número de células en esa área de 1 mm2. • Realizar la siguiente operación para ob­ tener el número de células por milímetro: n = n.° de células en 0,1 mm3 n x 104 = n.° de células en 1 mi Hay que llegar a contar entre 100 y 300 células para que el recuento sea más exacto. Si el número de células es bajo (menos de 100/mm2), se contará algún otro cuadrado de 1 mm x 1 mm de los que rodean el cuadra­ do central y luego se calculará la media. Si el número de células es alto (más de 1.000/mm2), bastará contar los cinco cuadrados de la dia­ gonal del cuadrado central.

la matriz extracelular a través de proteínas transmembrana de tipo integrinas, que, a su vez, se conectan con los filamentos de actina intracelulares (fig. 13-10). La reorganización de estas uniones permite, además de la adhe­ sión, la motilidad y los cambios de forma. Como sustrato para el cultivo de células, en un principio se usaba material de vidrio. Actualmente se emplea, fundamentalmente, plástico (poliestireno) tratado para que su su­ perficie tenga una carga ligeramente negativa y facilite la adherencia. En algunos casos, se usan, además, recubrimientos de proteínas de la matriz extracelular, como fibronectina y laminina, para mejorar dicha adherencia. Cuando se requiere el uso de soportes de vidrio para el cultivo celular, estos deben ser tratados previamente con agentes que mejoren en lo posible la adherencia de las células al

Capítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

(L FIG U RA 13-9 Fotografía de distintos frascos y placas para el cultivo celular. A ) Frasco de 75 cm2. B) Frasco de 25 cm 2. C, D) Placas de 6 y 12 pocilios.

FIGURA 1 3 -1 0 D ibujo de un fibroblasto adherido al plástico del frasco de cultivos mediante el establecimiento d e adhesiones focales.

Fibras de estrés

publicación MASSON. Fotocopiar:

Adhesiones focales

soporte, lo que dependerá del tipo celular considerado. La adherencia de muchos tipos celulares se ve facilitada con tratamientos con poli-L-lisina, que genera superficies policatiónicas que atraen con fuerza las membranas celulares polianiónicas. Otros tipos celulares requieren para su adherencia la presencia de ciertos componentes de la matriz extracelular, como colágeno o fibronectina. Algunas com­ pañías comerciales han desarrollado geles que contienen distintos componentes de la matriz extracelular, que se consiguen mediante el aislamiento y la purificación de los productos de secreción de fibroblastos en cultivo.

Composición del medio Los medios de cultivo contienen nutrientes tamponados e isotónicos, con sales inor­ gánicas, azúcares como fuente de energía,

aminoácidos y otros metabolites (tabla 13-3). Entre ellos se encuentra, además, un indica­ dor de pH (normalmente el rojo fenol). El primer estudio sistemático de los requeri­ mientos nutricionales de las células en cul­ tivo fue realizado por Eagle en 1955. Desde entonces, se han ido desarrollando distintas formulaciones para los diversos tipos celula­ res. Algunas de las más utilizadas son: • Medio esencial mínimo (MEM) de Eagle (EMEM, Eagle's minimum essential me­ dium). • Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Dulbecco's modified Eagle medium). • Formulación del Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Tradicionalmente se ha usado para células linfoides humanas. • Otros: por ejemplo, bajos en Ca++y Mg^.

Técnicas en histología y biología celular

TABLA 13-3 C o m p o s ic ió n d e un m e d io típ ic o a d e c u a d o p a ra el cultivo d e c élu las d e m am ífe ro

Aminoácidos

Vitaminas

Sales

Varios

Arginina Cisterna Glutamina

Biotina Colina Folato

NaCI KCI NaH2P 0 4

Glucosa Penicilina Estreptomicina

Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptófano Tirosina Valina

Nicotinamida Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina

NaHC03 CaCI2 MgC2

Rojo fenol Suero total

Proteínas (necesarias en medios químicamente definidos libres de suero) Insulina Transferrina Factores de crecimiento específicos

Tomado de Alberts et al. Biología molecular de la célula. 4.a ed. Barcelona: Omega; 2002. p. 473.

Como diluyente de medios, para lavados o medios de disección o para cortas incuba­ ciones (de hasta 4 h) se utilizan soluciones salinas que contienen sales inorgánicas, glucosa y un indicador de pH; es decir, son soluciones isotónicas pero no necesariamente nutrientes. Entre las sales inorgánicas es muy importante el bicarbonato sódico, que no so­ lo actúa como tampón, sino también como metabolito. Por citar un ejemplo, la solución salina tamponada de Earle es la que se usa como solución diluyente para el MEM. Además, los medios de cultivo llevan una serie de suplementos que pueden variar según el medio. Los antibióticos/antimicóticos se emplean de forma rutinaria para reducir la posibilidad de contaminaciones oportunistas (bacterias, levaduras, hongos). La mezcla de antibióticos más utilizada incluye peni­ cilina, estreptomicina y anfotericina B. En cultivos mantenidos durante largos períodos de tiempo algunos microorganismos pueden hacerse resistentes. En ese caso puede ser conveniente hacer un test haciendo crecer células en un medio sin antibióticos para

asegurar que no hay una contaminación de fondo. La mayoría de las células requieren tam­ bién suero en un rango de concentración del 5 al 20%, aunque su requerimiento para las células transformadas es mucho menor (del orden del 0,5%). Los tipos de suero más usa­ dos son el fetal de ternera, el de ternera recién nacida, el de caballo y el humano. El suero se obtiene tras coagulación de la sangre, por lo que se pierden algunos factores plasmáticos, como factores de coagulación y fibrinógeno, y se enriquece en factores derivados de las plaquetas. Debe filtrarse varias veces con filtros de 0,1 p,m y someterlo a toda una serie de pruebas de control (esterilidad, pH, detección de virus, etc.). Además, es conve­ niente inactivar el suero calentándolo a 56 °C durante 30 min, con lo que se inactivarán los factores del complemento y las inmunoglobulinas citotóxicas. En cuanto a su composición, el conte­ nido de muchos factores es diferente según la procedencia, por lo que se recomienda la adquisición de lotes completos para que

Capítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

dicha composición sea lo más homogénea posible durante un período de tiempo pro­ longado. • Hormonas y péptidos con efectos promo­ tores del crecimiento: insulina, hormona tiroidea, cortisol, hormona del crecimien­ to (GH), factor de crecimiento epidér­ mico (EGF), factor de crecimiento de fi­ broblastos (FGF) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), entre otros. • Factores importantes para la adhesión: fibronectina, vitronectina. • Proteínas transportadoras para hormo­ nas, minerales y lípidos: albúmina, transferrina. • Lípidos: ácidos grasos, colesterol, prostaglandinas. • Minerales en cantidades traza: zinc, hie­ rro y selenio.

Composición de la fase gaseosa

publicación MASSON. Fotocopiar:

El requerimiento de 0 2 es variable, sobre todo en función de si el cultivo tiene o no estructura organotípica. La presión atmos­ férica es suficiente para el cultivo de células mientras que, si el cultivo muestra una es¿ tructura organotípica, puede requerir hasta un 95% de 0 2 debido a un problema de § difusión de gases. Es aconsejable que, en | la botella, la altura de líquido en el medio '■% sea del orden de 2-5 mm, lo cual supone S un volumen de medio de 0,2-0,5 ml/cm2 de 1 superficie de la botella; por ejemplo, 5 mi •I para una botella de 25 cm2y 15 ml para una de 75 cm2. El C 0 2 de la fase gaseosa se disuelve en el medio en un equilibrio con H C 03_ que depende de la temperatura. Tiene un papel complejo, ya que el C 0 2 disuelto, el pH y el [HC03“] están interrelacionados:

Rojo fenol: indicador del pH

Rosa a 7,6 ^H| Rojo a 7,4 Naranja a 7 I I Amarillo a 6,5 I I

FIGURA 13-11 Colores que toma el indicador rojo fenol según el pH.

Para las células animales, el pH óptimo está en el intervalo 7,4-7,7. Las células trans­ formadas pueden requerir un pH algo menor (7-7,4). Es importante controlar el pH, ya que un medio demasiado básico o demasiado ácido puede ser indicativo de contaminación, cultivo senescente o fallo en la concentración de C 02 (fig. 13-11).

Temperatura La temperatura óptima del cultivo depende de la temperatura corporal del animal del que proceden las células, así como de la posible variación por el tejido y órgano (p. ej., la temperatura de la piel o del testículo puede ser algo menor que la del resto del cuerpo). Así, la temperatura óptima para el cultivo de células humanas y de la mayoría de animales de sangre caliente es de 36,5-37 °C. Una ex­ cepción son las células de aves y de algunos mamíferos como el cerdo, cuyo máximo crecimiento se da a 38,5 °C. Las células en cultivo pueden tolerar con­ siderables disminuciones de temperatura; así, pueden pasar varios días a 4 °C o ser congela­ das de -70 a -196 °C (en N2líquido). Para su preservación se usan agentes crioprotectores como dimetil sulfóxido (DMSO) o glicerina, que protegen del daño celular debido a la formación de cristales de hielo. Sin embargo, las células en cultivo no toleran aumentos de 2 °C sobre su temperatura óptima y mueren rápidamente por encima de los 40 °C. Las figuras 13e-l a 13e-ll ilustran al­ gunos aspectos de cómo se desarrolla el

§ w I

C 02 + H20 f

C 02

■ — > H,COa

atmosférico

— ►

I pH

H” + HC03'

(depte.de temperatura)

Técnicas en histología y biología celular

trabajo en un laboratorio de cultivo celu­ lar, mostrando tanto los distintos aparatos pertenecientes a laboratorios reales como los resultados de algunos ensayos que se

realizan normalmente en esos laboratorios (ensayo de viabilidad celular, ensayo de eficiencia clonogénica, tinciones específi­ cas, etc.).

BIBLIOGRAFÍA

Freshney RI. Culture o f animal cells. A manual o f basic technique and specialized applications. 6th ed. New York: W iley-Liss; 2010. Harrison MA, Rae IF. General techniques o f cell culture. Cambridge: Cambridge University Press; 1997.

A lbeits B. B iología m olecular de la célula. 4.a ed. Bar­ celona: Omega; 2002. Freshney RI. Culture o f anim al cells. A manual o f basic technique. 3th ed. N ew York: W iley-Liss; 1994.

C apítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

276.e1

Caso 1 HepG2 es una línea celular de hepatocitos humanos adherentes que crecen en monocapa. Se desean sembrar, a partir de una botella de mantenimiento, cuatro placas de 3 cm de diámetro a una densidad de 20.000 células/cm2. A. ¿Qué número de células necesita­ mos en total? B. Diseñe un protocolo que incluya el método, los materiales y los medios nece­ sarios para realizar esta siembra a partir de la botella de mantenimiento. Respuesta A. Superficie de cada placa =nr2= 7,1 cm2 7 ,1 x 4 = 28 ,4 cm2

B.

Protocolo

1. Despegar las células con solución de tripsina + EDTA. 2. Centrifugar a 800 g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. 3. Añadir medio de cultivo suplementado con suero al 10% para inactivar la trip­ sina. 4. Contar el número de células y estimar la viabilidad celular. 5. Resembrar células a la densidad corres­ pondiente. 6. Añadir medio de cultivo suplementado con suero al 10%, antibiótico/antimicótico al 1% y aquellos suplementos necesarios para la línea ce lu la r en cuestión.

20.000 x 28,4 = 568.000 células

Caso 2 Una población celular de la línea HL-60 (células que crecen en suspensión) se mantiene en una botella grande con 40 mi de medio. Se desea realizar una extracción de citosol para distintas determinaciones bioquímicas. Se necesitarán 25 m illones de células para cada extracción. Si los resultados del recuento realizado en la cámara de Neubauer (se realiza mezclando el mismo volumen de suspensión celular y del colorante azul tripán) son los mostrados en la figura:

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FIGURA e 1 3-1 Incubadores de C 0 2 en u na sala b lanca d e categoría 2 (para agente bioló­ gico del grupo 2).

A. B.

¿Cuántas células en total tenemos en la botella? ¿Cuántas extracciones podremos hacer con las células que tenemos?

Técnicas en histología y biología celular

R e sp u e sta A.

(155+120+117+136)/4 = 132 N = 132 x 10.000 x 2 (factor de dilución al teñir con azul tripán) = 2.640.000 células/ml 2.640.000 x 40 mi =105.600.000 células

105.600.000/25.000.000 = 4

C apítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

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AUTOEVALUACION 1. Señale cuál de las siguientes opciones NO puede ser considerada un medio de esterilización: a. Homo. b. Autoclave. c. Cabina de flujo laminar. d. Filtración. e. Todas las respuestas anteriores son correctas. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el homo, el autocla­ ve y la filtración son medios de esterilización. Sin embargo, con la cabina de flujo laminar lo que conseguimos es una zona de trabajo en condiciones de asepsia. 2. Si cultivamos células procedentes direc­ tamente del explante de un tejido, obte­ nemos: a. Un cultivo primario. b. Un cultivo secundario. c. Una línea celular finita. d. Una línea celular continua. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: cuando un cultivo se comienza a partir de células procedentes de un tejido, por disgregación o migración, se denomina «cultivo primario». 3. Todas las cabinas de flujo laminar están diseñadas para: a. Trabajar en condiciones de máxima seguridad cuando se usan solventes orgánicos. b. Disminuir el riesgo de contaminación de la muestra objeto de estudio. c. Disminuir el riesgo del operador. d. Evitar la emisión de malos olores al exterior. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: todas las cabinas de flujo laminar deben proteger la muestra de la contaminación. Algunos tipos de cabinas aportan, además, otro tipo de protección. 4. De las siguientes condiciones, ¿cuál debe cumplir un medio de cultivo? a. Contener aminoácidos esenciales.

b. No contener glucosa para evitar la contaminación bacteriana. c. Tener un pH comprendido entre 5 y 6. d. Contener el indicador de pH más común, el azul fenol. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: el medio debe con­ tener aminoácidos esenciales. El pH óptimo para las células animales está en el intervalo 7,4-7,7. El indicador de pH más común es el rojo fenol. 5. El material indispensable en una sala de cultivo es: a. Campana extractora, incubador de dióxido de carbono (COj) y centrífuga. b. Frigorífico, congelador y cabina de flujo laminar. c. Cabina de flujo laminar, incubador de C 02 y centrífuga. d. Circuito cerrado de aire, microscopio invertido y homo esterilizador. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: en una sala de cul­ tivo se debe contar, como mínimo, con una cabina de flujo laminar, con un incubador de C 02 y con una centrífuga. 6. ¿Qué es el azul tripán y para qué se uti­ liza? a. Es un colorante que se utiliza para ensayos de viabilidad celular, ya que permite diferenciar las células vivas de las muertas. b. Es un colorante que se internaliza en aquellas células que tienen una tasa metabólica elevada. c. Es un indicador de pH que se añade habitualmente a los medios de cultivo. d. Es un elemento traza que se requiere a bajas concentraciones para la super­ vivencia celular. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: el azul tripán se usa en ensayos de viabilidad. Es un colorante

276.e4

que permite diferenciar las células vivas de las muertas, ya que logra entrar solo en es­ tas últimas, debido a que su membrana está dañada. 7. Señale la respuesta correcta en relación con las condiciones normales de incuba­ ción de líneas celulares de mamífero: a. 37 °C y 10% de C 02sin humidificación. b. 37 °C y 10% de CO2con humidificación. c. 36 °C y 5% de C 02con humidificación. d. 37 °C y 5% de C 02con humidificación. e. 37 °C y 5% de C 02sin humidificación. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: las condiciones habituales de incubación para células de mamíferos son: 37 °C y 5% de C 0 2 con humidificación. 8. En cultivo celular para despegar las cé­ lulas de los frascos es frecuente utilizar, entre otras cosas: a. Medio DMEM a 37 °C. b. Tripsina a 37 °C. c. Medio DMEM a temperatura am­ biente. d. Tripsina a temperatura ambiente. e. Un tratamiento mecánico. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la aplicación de tripsina a 37 °C es la manera más habitual de despegar de los frascos de cultivo las células que crecen en monocapa. 9. ¿Cuál de los siguientes componentes NO puede esterilizarse en el autoclave? a. Bicarbonato. b. Antibióticos. c. Suero. d. Solución salina. e. Todos pueden. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el suero, ya que las temperaturas que se alcanzan en el autoclave destruirían componentes como proteínas y factores de crecimiento. 10. De los siguientes componentes del medio de cultivo, ¿cuál NO lo aporta el suero? a. Nutrientes. b. Factores de crecimiento. c. Elementos traza. d. Antibióticos. e . Factores importantes para la adhesión. Respuesta correcta: d.

Técnicas en histología y biología celular

Respuesta razonada: el suero se obtiene tras la coagulación de la sangre de un animal, por lo que no aporta antibióticos. 11 .En el recuento celular de una botella de cultivo se ha obtenido una media de 500 células/0,1 mm3. ¿Qué volumen de esta suspensión debemos añadir a una botella para sembrar 30.000 células? a. 30 pl. b. 3 pl. c. 60 pl. d. 6 pl. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: tras el recuento, cal­ culamos que tenemos 5 X 106 en 1 mi. Por tanto, necesitaremos: 3 X 104/5 X 106 mi = 0,006 mi = 6 pl. 12.Un lunes por la mañana sembramos 250.000 células en un frasco de 25 cm2. El miércoles, sobre la misma hora, rea­ lizamos la tripsinización de ese frasco y el recuento celular en la cámara de Neubauer, obteniendo un recuento de 80. ¿Cuál es la duración del ciclo celular de estas células? a. 6h. b. 8 h. c. 12 h. d. 24 h. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: N.° inicial: 250.000 células N.° final: 8 X 105 células/ml X 5 mi = 4 X 106 células N.° final/N.° inicial = 16 El número de células se ha multiplicado por 16 (24) en 48 h; es decir, se han dividido cuatro veces, por lo que la duración del ciclo celular es de 12 h. 13. Tras el recuento de una línea celular rea­ lizado en la cámara de Neubauer con la tinción de azul tripán, obtenemos los siguientes resultados: N.° de células total: cuadro 1 = 70; cuadro 2 = 68; cuadro 3 = 74, y cuadro 4 = 68. N.° de células no viables: cuadro 1 = 3 ; cuadro 2 = 4; cuadro 3 = 5, y cuadro 4 = 2.

C apítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

¿Cuál es el porcentaje de no viabilidad celular? a. 0,05%. b. 5%. c. 0,14%. d. 14%. e. Ninguna de las respuestas anteriores es correcta. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: N.° de células total = 70 + 68 + 74 + 68 = 280 N.° de células no viables=3+4+ 5+ 2 = 14 % de viabilidad = 14 X 100/280 = 5%

RECURSOS O NLINE Vídeos V ídeo que m uestra el m odo de trabajar en condiciones de esterilidad. h ttp ://w w w .b en ch fly .co m /v id eo /3 3 /w o rking-w ithsterile-technique/ V ídeo en el que se m uestra un subcultivo de una línea celular.

276.e5

http://www.youtube.com/watch?v=PC51Z5FKZXQ Vídeo en el que se m uestra un recuento celular con el hemocitómetro. http://www.youtube.com/watch?v=pPOxERLUhyc

Enlaces de interés Introduction to animal cell culture: a technical bulletin (Corning). http://www.level.com.tw/html/ezcatfiles/vipweb20/img/ img/20297/in tro_animal_cell_culture.pdf Troubleshooting in cell culture. http://openwetware.Org/images/7/77/Troubleshopoting_ Cell_Culture.pdf American Type Culture Collection (ATCC). http://www.atcc.org/~/media/PDFs/Technical%20Bulletins/tb04.ashx; http://www.atcc.Org/~/media/PDFs/ Technical%20Bulletins/tb07.ashx Directiva 2000/54/CE del Parlamento Europeo. h ttp ://e u r-le x .e u ro p a .e u /L e x U riS e rv /L ex U riS e rv . do?uri=OJ :L:2000:262:0021:0045:ES:PDF Protocolo online. http://w w w .protocol-online.org/prot/C ell_B iology/ Cell_Culture/

FIGURA e 1 3-2 C abinas de flujo laminar con filtros HEPA.

F IG U R A e1 3 - 3 U s u a rio trab a jan d o en u n a c ab in a de flujo lam inar bajo condiciones asépticas.

FIGURA e 1 3-4 Otros apara­ tos im portantes en una sala de cultivo. De derecha a izquierda, baño maría, estufa y centrífuga refrigerada de mesa.

C apítulo | 13 Técnicas de cultivo celular

FIG U RA e 1 3 -5 O tros apa­ ratos im portantes en una sala de cultivo. M icroscopio óptico invertido con contraste de fases.

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FIG U RA e 1 3 - 6 C ultiv o de p re a d ip o c ito s h um anos d ife­ renciados a adipocitos in vitro. El contenido lipídico se tiñó con el colorante Oil-red-O.

I w 3

276.e7

Técnicas en histología y biología celular

276.e8

8

9

10

11

12

* ? # • » FIG U RA e1 3 -7 Ensayo de viabilidad celular con M TT. La intensidad de color de cada uno de los pocilios (corres­ pondientes a distintas condiciones experimentales) se cuantifica m ediante espectrometría.

F IG U R A e1 3 - 8 U s u a r ia observando al m icroscopio in­ vertido las células crecidas en un frasco.

FIGURA e 1 3 -1 0 Interiordel incubador de C 0 2. Se observan las baldas metálicas agujereadas para una mejor recirculación del aire.

i

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I g § •§

I w 3

F IG U R A e 1 3 - 1 1 A sp ecto exterior del incubador de C 0 2. Se observan los indicadores de tem peratura y C 0 2, a s í com o la conexión a la bom bona que suministra el C 0 2.

Proliferación, muerte celular y angiogénesis Paul Alain N guew a Tchinda, Alfonso Calvo G onzález, M aría José Pajares Villandiego, D iana Llópiz Khatchikian, A lfredo M artínez Ramírez

INTRODUCCIÓ N La homeostasis tisular viene determinada por un equilibrio fisiológico que implica un adecuado recambio celular y un aporte de nutrientes y oxígeno constante. El nú­ mero de células en un tejido depende del balance entre la proliferación y la muerte celu lar program ada (program m ed cell death), o apoptosis. Por otro lado, el aporte adecuado de oxígeno implica una correcta vascularización tisular. Muchas patologías están relacionadas con un desequilibrio en estos procesos, y se origina, por ejemplo, un defecto en la muerte celular o una desenfre­ nada proliferación. La isquemia, o falta de riego tisular, es otra causa de enfermedades frecuentes. Algunas de ellas, como el cán­ cer, el sida, el Parkinson y gran número de patologías cardiovasculares, cursan con alte­ raciones en estos procesos. El conocimiento de técnicas de análisis relacionadas con la medición de la proliferación, de la apopto­ sis y del desarrollo vascular es clave para entender mejor los mecanismos patognomónicos de muchas de estas enfermedades. En el presente capítulo nos centramos en las técnicas más empleadas para el estudio de estos fenómenos en procesos patológicos como el cáncer. Aunque, lógicamente, estas técnicas se pueden aplicar en muchas otras patologías, el cáncer es un paradigma en el que los procesos de proliferación, apoptosis © 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

y angiogénesis son claves para el desarrollo de la enfermedad y donde se han realizado numerosos estudios al respecto. Aunque todavía no se conocen bien las causas que originan la mayor parte de los tumores, la investigación actual está descu­ briendo numerosas alteraciones moleculares que favorecen el desarrollo del cáncer. El proceso de carcinogénesis sigue un patrón en su evolución que implica una serie de cambios más o menos comunes a todo tipo de tumores. Esta secuencia de acontecimien­ tos ha quedado resumida magistralmente en un artículo de investigación de Hanahan y Weinberg, publicado en la revista Cell (2000) (cuadro 14-1). El análisis de los factores que promueven la división celular o impiden los procesos de muerte por apoptosis, o bien de los que controlan la senescencia y autofagia son fundamentales para comprender mejor có­ mo se desarrollan los tumores y cómo se puede bloquear farmacológicamente dicho proceso (cuadro 14-2). Igualmente, el estudio de la angiogénesis tumoral, que permite la diseminación de las células malignas y el desarrollo de nuevos focos metastásicos, es esencial para poder frenar esta enfermedad. A continuación detallamos las principales técnicas que se usan para el estudio de dichos mecanismos, junto con una breve explicación introductoria sobre qué proceso analiza cada una de ellas. 277

Técnicas en histología y biología celular

Cu ad ro 14-1 Rasgos propios de la célu la tum oral • Autosuficiencia en los factores de crecímiento. • Resistencia a la inhibición del crecimiento. • Evasión de la apoptosis.

• Ilimitado potencial de replicación. • Angiogénesis sostenida. • Invasión y metástasis.

C u a d ro 14-2 C o n c e p to s de a p o p to sis, se n e sc e n c ia y a u to fag ia La muerte celular puede considerarse un fe­ enfermedades autoinmunes, sida, Parkinson y nómeno necesario para la remodelación y el recambio de los tejidos. La apoptosis o muerte celular programada (programmed cell death) es un tipo de muerte celular que sigue un programa genético y requiere de la síntesis previa de algunas pro­ teínas (caspasas) implicadas en el desencade­ namiento de la muerte celular. Se han asociado ciertas alteraciones en la apoptosis a cáncer,

ANÁLISIS DEL CICLO Y DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Introducción El ciclo celular es la secuencia ordenada de procesos que conducen al crecimiento de una célula y a su posterior división en dos células hijas. La célula puede encontrarse en dos es­ tados claramente diferenciados: un estado de división, o fase M, y un estado de no división, o interfase. A su vez, esta se divide en tres etapas: G l,S y G 2 (fig. 14-1). La prim era fase es la fa se G l {gap, «intervalo»), que duraría entre 6 y 12 h en un hipotético ciclo de 24 h. Ocurre justo después de una división celular y es una fase anterior a los fenómenos de síntesis o replicación del DNA. Durante la fase G l, la célula sintetiza las proteínas responsables de su fenotipo particular y aumenta en volumen con el fin de prepararse para la siguiente división. Sin embargo, hay células que detienen su pro­ gresión hacia la división en esta fase G l y permanecen durante días, meses o años en estado de reposo sin aumentar de tamaño ni activar sus mecanism os ulteriores de división. Esta fase se denomina «fase GO»

muchas otras patologías degenerativas. La senescencia celular es un mecanismo fisiológico que impide que las células se divi­ dan de manera indefinida. La autofagia es un proceso catabólico al­ tamente conservado en la evolución. Permite a la célula eucariota obtener energía, ácidos grasos y aminoácidos para su supervivencia en condiciones adversas y de estrés celular.

y se interpreta como una salida temporal (o definitiva) del ciclo celular. En la fase Gl existe un punto de control muy importante, llamado «punto de restricción R», que con­ trola si existen las condiciones adecuadas (volumen celular, condiciones ambientales, etc.) para comenzar la síntesis del DNA. Este punto se conoce también como «de no retor­ no», porque si la célula traspasa este punto de control y comienza a duplicar su DNA, ya no puede volver atrás y «desduplicar» dicho DNA. Por tanto, tras la superación del pun­ to R y si las condiciones son favorables, la célula se dividirá; en caso contrario, entrará en apoptosis. D urante las 6-8 h que dura la fa se S (synthesis) se replica el DNA. En este momento del ciclo, cada cromosoma está formado por dos cromátidas, es decir, dos moléculas de DNA de cadena doble, que son copia una de la otra. La fase G2 duraría entre 3 y 4 h, que es el tiempo que transcurre entre el final de la síntesis de DNA y el comienzo de la división celular. En esta fase existe un segundo punto de control crítico G2/M, en el que la célula debe comprobar que ha duplicado su masa,

Capítulo | 14 Proliferación, muerte celular y angiogénesis

La célula duplica su tamaño y aumenta la cantidad de nm ánulm n7invK

El citoplasma se divide

atocine

Duplicación del DNA y proteínas asociadas; existen ahora dos copias de la información genética de la célula

..............r V

Se separan lasdoscromátidas

Las estructuras necesarias para la división empiezan a ensamblarse; se inicia la condensación de los cromosomas FIGURA 14-1 Fases del ciclo celular (G l, S, G 2 y M ) y sus puntos de control (R, G2/M, M ) señalados en verde. Después del punto R , que controla el tamaño celular adecuado y las condiciones ambientales favorables, se inicia la síntesis del D NA (fase S). Antes de la entrada en m itosis (fase M ), el punto G 2/M controla también el tamaño celular adecuado, las condiciones ambientales favorables, y la replicación com pleta y correcta del DNA. Tras el correcto alineamiento de los cromosomas (punto de control M), finaliza la división celular. (Imagen modificada de la página web http://www.fisicanet.com.ar/biologia/informacion_genetica.)

que las condiciones ambientales son favora­ bles y que ha completado de modo correcto la replicación del DNA. Finalmente, las células entran en fase de mitosis (M), que dura 1 h. Entre los procesos más importantes que acontecen durante la mitosis podemos señalar la condensación de la cromatina (profase), la distribución alinea­ da de los cromosomas sobre el huso acro­ m ático (m etafase), la separación de las cromátidas hacia los polos (anafase) y la descondensación de la cromatina (telofase). La citocinesis consiste en la división del cito­ plasma y conduce a la formación de dos cé­ lulas hijas. El punto de control M comprueba que la célula está preparada para completar la división celular. Los puntos de control aseguran que el ciclo celular progrese únicamente cuando la célula está en las condiciones adecuadas para dividirse. Sin embargo, las células neoplásicas son capaces de completar la división celular ignorando los puntos de control.

Análisis de la proliferación y del ciclo celular en células aisladas Ciclo celular Generalmente, el análisis del ciclo celular se realiza m ediante citom etría de flu jo (cuadro 14-3). Para entender cómo se lleva a cabo dicho estudio, convendría conocer los fundamentos de la mencionada técnica, que se explican en «Recursos online». Bre­ vemente, se puede decir que la citometría de flujo es un método que permite el estudio de múltiples parámetros en una única célula, como, por ejemplo, marcadores de superficie o proteínas intracelulares, así como analizar simultáneamente diferentes poblaciones ce­ lulares utilizando anticuerpos específicos conjugados con fluorocromos (v. «Recursos online» para más especificaciones). La gran ventaja de esta técnica radica en que con ella es posible estudiar de forma rápida, fiable y simultánea una gran cantidad de células y obtener datos de gran valor estadístico.

Técnicas en histología y biología celular

Cu ad ro 14-3 Co ncep tos básicos de la citom etría de flujo Mediante la citometría de flujo es posible analizar distintas características de una mis­ ma célula: • Tamaño (FSC, forward scatter) y comple­ jidad (SSC, side scatter) gracias a la dis­ persión de la luz que se genera al incidir el rayo luminoso en la célula. • Expresión de diversas moléculas presentes en la superficie o en el interior de la célula, utilizando anticuerpos específicos para su

Para ello es necesario que la muestra se en­ cuentre en suspensión para que pueda ser analizada por un aparato cualificado para tal fin, que se denomina «citómetro de flujo» (cuadro 14-4). Para el estudio del ciclo celu­ lar con citometría de flujo, el DNA celular se puede teñir con determinados compuestos, como el yoduro de propidio, que es capaz de intercalarse entre las hebras de DNA. Si se hace pasar a las células teñidas por el citómetro de flujo, podemos cuantificar qué proporción de las mismas se encuentra en cada una de las fases del ciclo. Las células normales diploides en fase GO o G l del ciclo celular suelen tener un contenido en DNA de 2N, mientras que las que se encuentran en fases G2 y antes del proceso mitótico (M) contienen exactamente doble cantidad (4N; número tetraploide de cromosomas) de DNA. Dado que este es sintetizado durante la fase S, el contenido del mismo en las cé­ lulas oscila entre 2N y 4N. La figura 14-2 muestra un histograma típico que refleja la

detección, los cuales, además, deben estar conjugados con fluorocromos. Las dos grandes ventajas de esta técnica son que permite estudiar de forma rápida, fiable y simultánea varios parámetros en una gran cantidad de células, y que con ella se obtienen datos de alto valor estadístico. La muestra debe estar en suspensión para poder ser analizada por un aparato cualificado denominado «citómetro de flujo».

cantidad relativa de células en función de su contenido de DNA. La citometría de flujo nos permite, ade­ más, medir el contenido de DNA en células dañadas. Por ejemplo, cuando el DNA re­ sulta fragmentado debido a la activación de endonucleasas durante el proceso apoptótico inducido por agentes genotóxicos (p. ej., cisplatino, estaurosporina, luz ultravioleta, etc.), se altera el ciclo celular y se genera un his­ tograma diferente. Las células en apoptosis presentan fragmentación del DNA, lo que en el histograma se observa como un pico a la izquierda de la fase G0/G1, llamado «sub-GO/Gl». En otras ocasiones, deter­ minados tratamientos quimioterapéuticos o radioterapéuticos, o la falta de factores de crecimiento en el medio de cultivo, dan lugar al llamado «arresto del ciclo celular» en una fase específica del ciclo. Esto quiere decir que el compuesto en cuestión detiene el ciclo celular en una fase concreta y, por tanto, im­ pide que pase a la siguiente. Es decir, hay un

Cuadro 14-4 Partes de un citómetro de flujo • Sistema de fluidos: para recoger las mues­

tras y poder restringir su paso por la cámara de flujo. • Sistema óptico: el aparato tiene al menos una fuente de excitación (láser), además de una serie de lentes y prismas. Asimismo, existen espejos ópticos y filtros que pueden

dirigir las emisiones de longitud de onda hacia detectores ópticos. Sistema electrónico: es necesario para con­ vertir las señales de luz en electrónicas, de modo que puedan ser digital izadas, lo que permitirá hacer el análisis mediante programas informáticos especializados.

Capítulo | 14 Proliferación, muerte celular y angiogénesis

U373 control G

I 1

G2/M

Lá. 50

100

150

200

C o n ten id o d e DNA

C ontenido d e DNA

P oblación asincrónica

Pobla ción sincrónica

G1

1 h

r

G2/M rH .

G2/M 1— 1 ,--------,

200

400

600

800

1.000

C ontenido d e DNA

— 200l

------- t-------

400

600

800

1.000

C ontenido d e DNA

FIGURA 1 4 -2 A ) H istogram as d e u na población a sincrónica d e células e n c recim iento teñidas c on yoduro de p ropidio. E n el histogram a de la izquierda se observan las fases G l, S y G 2/M de las células controles (U 373 co n tro l). U n a v ez tratad as con 100 |iM de estaurosporina durante 12 h, las células U 373 entran en apoptosis. L as cantidades de células e n las fases G l, S y G 2/M se han reducido; adem ás, aparece la población sub -G 0 /G l de células apoptóticas. B ) H istogram as de una p oblación asincrónica y sincrónica d e células en crecim ien to teñ id as con y o duro d e p ro p idio. E n este caso, la sincronización produce un arre sto en la fase G l . (A , m odificado a p a rtir de A m irla k B, Couldw ell WT. A poptosis in g liom a cells: review a nd a nalysis o f tech n iq u es u se d f o r stu d y w ith fo c u s on the laser scanning cytom eter. J N eurooncol 2003; 63: 129-45; B , m odificado de M cN eely SC, X u X, T a ylo r BF, Z acharias W, M cC abe M J Jr, S tates JC. E xit fro m arseniteinduced m itotic a rrest is p 5 3 dependent. E nviron H ealth P erspect 2 006;114:1401-6.)

aumento en la proporción de células en una determinada fase del ciclo con respecto a la situación normal. Por ejemplo, la radiotera­ pia causa arresto del ciclo en la fase G2/M, lo que provoca un aumento relativo del número de células en esta fase con respecto a células control que no han recibido tratamiento. Para el análisis del ciclo celular normal­ mente se utiliza el proceso de la sincroniza­

ción. En efecto, el estudio de la regulación del ciclo requiere que las células en cultivo comiencen a crecer en la misma fase. La sincronización se puede definir como el procedimiento por el cual dichas células son arrestadas en unas fases específicas del ciclo celular. Es particularmente importante en el estudio de la biología celular en determina­ das condiciones fisiopatológicas. Un claro

Técnicas en histología y biología celular

ejemplo práctico de esta técnica es el análisis de los efectos producidos por compuestos terapéuticos como los antitumorales sobre el proceso mitótico de algunas células can­ cerosas. Mediante la sincronización celular se consigue que una población asincrónica con células en varias fases (v. fig. 14-2) pase a ser una población sincrónica con todas sus células en la misma fase del ciclo. De esta manera, se puede observar con claridad si las células experimentan cambios en su ciclo celular, dado que todas sufren las mismas alteraciones de forma simultánea, y en qué fase se producen dichas variaciones. Existen varios métodos de sincronización, de los cuales el más común es la retirada de suero del medio de cultivo. Las células se cultivan en un medio con baja o nula concentración de suero durante 24-72 h. Se produce una parada del crecimiento y las células entran mayoritariamente en fase GO o G0/G1 o bien quedan retenidas en un punto de control del ci­ clo celular y mueren; una pequeña proporción de células permanece en las fases S y G2/M (v. fig. 14-2). Tras la adición al medio de suero a concentraciones normales, las células crecen de forma sincronizada. Otro método para lo­ grar la sincronización es la adición al medio de cultivo de compuestos como la hidroxiurea, un inhibidor de la replicación del DNA. Durante las últimas dos décadas, la tecno­ logía de citometría de flujo ha proporcionado abundantes datos a la biología celular del cáncer (figs. e l4 -l a el4-4). Además del es­ tudio de cambios en la proporción de células en cada fase del ciclo, la citometría permite determinar los cambios en la ploidía celular y los niveles de aneuploidía en una población celular tumoral concreta.

Análisis de la proliferación mediante recuento celular La proliferación puede analizarse en células en cultivo mediante un simple recuento del número de células en sucesivos momentos, para calcular así el tiempo en el que se dobla la población. Hay muchos métodos posibles para contar el número de células, entre los que se encuentran el recuento en cámaras de Neubauer, los métodos automatizados y la

citometría de flujo (v. capítulo 13 sobre cul­ tivos celulares, para más especificaciones). Para células adherentes es necesario utilizar tripsina u otros tratamientos que permitan despegar las células del sustrato. Para evaluar el número de células vivas las células suelen incubarse con colorantes vitales, como el azul tripán, que solo penetrará en el citoplasma de las células que tengan daños en la membrana plasmática. En cambio, el colorante no pene­ trará en las que sean viables (con membrana plasmática íntegra).

Análisis de la proliferación y de la citotoxicidad mediante técnicas colorimétricas de la actividad metabólica celular Una técnica frecuentemente utilizada para estudiar la proliferación celular y la citoto­ xicidad producida por fármacos es el em­ pleo de métodos colorimétricos que miden la actividad metabólica, lo cual refleja de un modo indirecto la cantidad de células presentes en el cultivo. El método más co­ mún se basa en la capacidad que tienen las células vivas de reducir sales de tetrazolio y formar cristales de formazán (fig. 14-3). La sal de tetrazolio más em pleada es el MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, «bromuro de metiltiazolildifeniltetrazolio»). Este es reducido por la enzima succinato-tetrazolio reductasa, perteneciente a la cadena respiratoria mitocondrial, para lo cual utiliza el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) como cofactor. El formazán forma cristales que tienen que ser solubilizados después de la incubación. Tras la reacción se produce un precipitado de color azul que puede ser analizado, una vez solubilizado para obtener una solución homogénea, en un lector de placas de ELISA a una longitud de onda de 570 nm. Un color oscuro refleja la presencia de células vivas, mientras que uno amarillento indica la presencia de células muertas o la ausencia de células (fig. 14-4). Más recientemente se han desarrollado variantes del compuesto MTT, como el XTT y el WST-1, que son solubles en agua y no necesitan ser solubilizados tras la incubación. Todas estas técnicas son rápidas, precisas y

Capítulo | 14 Proliferación, muerte celular y angiogénesis

FIGURA 14-3 Estructura m olecular del M TT y reacción d e reducción que d a lugar al formazán. NAD*, dinucleótido de nicotinam ida y adenina e n su form a oxidada; NADH, dinucleótido de nicotinam ida y adenina en su forma reducida.

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